INSTITUTO DE CIENCIAS NATURALES

GUÍA N°1
SEGUNDA PARTE

METODOS DE SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS

CROMATOGRAFÍA

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
CQU310

2022
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RESULTADOS DE APRENDIZAJE

• Distinguir la naturaleza fisicoquímica de las biomoléculas mediante la caracterización de su

estructura, propiedades y funciones en los organismos.

• Analizar resultados experimentales de laboratorio mediante la aplicación de principios

fisicoquímicos y fisiológicos, con el uso de herramientas computacionales.

METODOS DE SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS

INTRODUCCIÓN

Muchas de las técnicas que se utilizan en Bioquímica para la separación de los componentes de
una mezcla de moléculas biológicas se basan en las diferencias que existen en las propiedades
físicas y/o químicas de sus componentes tales como solubilidad, tamaño, masa, carga eléctrica o
afinidad por otras moléculas.
A continuación, se presentan algunas técnicas que utilizan estos principios.
I.- DIÁLISIS

La diálisis es un proceso basado en la difusión pasiva de solutos desde una zona hipertónica a otra
zona hipotónica. Este traspaso se hace a través de una membrana semipermeable, que impide el
paso de moléculas mayores de un determinado peso molecular, permitiendo la libre difusión de
iones inorgánicos, como el sulfato y el amonio, aminoácidos y péptidos pequeños. Así pues, las
moléculas menores al punto de corte de la membrana difundirán libremente, mientras que las
mayores quedarán retenidas dentro de la membrana de diálisis.
Un ejemplo muy importante de diálisis es la hemodiálisis:
Es un procedimiento que permite retirar parcialmente del cuerpo el agua y los desechos que se
acumulan debido a una afección renal. Para ello, se utiliza un dializador.

El dializador tiene dos compartimentos separados por una membrana semi-permeable (membrana
facilitadora). Por uno de ellos circula la sangre que viene de la paciente, cargada de desechos y
agua. Mientras que por el otro circula el dializado o baño de diálisis (medio o zona hipotónica). El
intercambio que se produce entre la sangre y el dializado depende principalmente del tamaño de
los poros, del grosor y de la superficie de la membrana. De este modo la membrana sólo permite
el paso de algunos elementos. Por ejemplo, sodio, urea, potasio, creatinina y fósforo pasan
fácilmente. Los glóbulos rojos, los glóbulos blancos, las bacterias y las proteínas sanguíneas, no
pasan.

Figura 1: Dializador

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II.- CROMATOGRAFÍA

La cromatografía es una de las técnicas más poderosas de separación de los componentes de

una mezcla, ha sido ampliamente estudiada y aplicada a nivel de laboratorio y en los últimos años
ha debido aumentar la escala para servir en procesos productivos.
La técnica se basa en la diferente velocidad con que se mueven los solutos arrastrados por un
disolvente (fase móvil) a través de un medio poroso (fase estacionaria).

El fenómeno de migración de los componentes de una mezcla a lo largo de la fase estacionaria,

impulsados por la fase móvil, recibe el nombre de elusión. La mezcla a separar se deposita sobre
la fase estacionaria, mientras que la móvil atraviesa el sistema desplazando a los componentes de
la mezcla a distinta velocidad, dependiendo de la magnitud de sus interacciones relativas con
ambas fases. Las dos fases se eligen de forma que los componentes de la muestra se distribuyan
de modo distinto entre la fase móvil y la fase estacionaria. Aquellos componentes que son
fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase móvil;
por el contrario, los componentes que se unen débilmente a la fase estacionaria, se mueven con
rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan
en bandas o zonas discretas que pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente.

Existen varios tipos de cromatografías, entre las que cabe destacar las siguientes:
• Cromatografía de Intercambio Iónico
• Cromatografía de Afinidad
• Cromatografía de Adsorción
• Cromatografía de Exclusión Molecular

• CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IONICO

Este tipo de cromatografía se utiliza para separar las moléculas de acuerdo a su carga eléctrica.
En el proceso de intercambio iónico, los iones que están unidos electrostáticamente a una matriz
insoluble e inerte químicamente son sustituidos de modo reversible por los iones en disolución:

Los polianiones y los policationes se unen, por tanto, a los intercambiadores de aniones y de
cationes. Sin embargo, las proteínas y otros polielectrolitos (polímeros poliiónicos) que son
portadores de cargas positivas y negativas pueden unirse tanto a los cambiadores de cationes como
a los de aniones, dependiendo de su carga neta, La afinidad con la que un polielectrolito concreto
se une a un cambiador iónico determinado, depende de las identidades y de las concentraciones
de los demás iones presentes en la disolución. Las afinidades de los polielectrolitos portadores de
grupos ácido-base dependen también, en gran medida, del pH ya que sus cargas netas varían con
dicho valor.

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Es una técnica de alta resolución, flexibilidad de operación y versatilidad de aplicación, se debe

considerar la estabilidad de los solutos a separar frente al pH. Las propiedades de la matriz deben
ser tal, que excluyan la retención de moléculas por otros métodos cromatográficos.

• CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
La cromatografía de afinidad es una clase de cromatografía más específica, ideal para aislar una
o unas pocas proteínas de una mezcla compleja. Consiste en la retención de moléculas por su
interacción a ligandos específicos según su actividad biológica (generalmente anticuerpos). Al
separar por las propiedades biológicas funcionales de la molécula y no con sus propiedades físicas
o químicas, le confiere a esta técnica gran potencial de purificación.

Muchas proteínas presentan interacciones bastante fuertes (no covalentes) con otras moléculas,
por ejemplo, las interacciones de las enzimas con sus sustratos y análogos de sus sustratos o con
cofactores. En esta técnica, una molécula conocida como ligando se une por covalencia a una
matriz inerte y porosa, a dicho ligando se unirá la proteína que interesa, todas las proteínas
restantes, presentes en la mezcla, simplemente pasaran a través de la columna. Las moléculas
proteicas capturadas pueden liberarse posteriormente eluyendo la columna con una solución
amortiguadora que contenga copias libres del ligando utilizado o algún otro reactivo que pueda
romper la interacción.

• CROMATOGRAFIA DE ADSORCIÓN
La cromatografía de adsorción permite la separación de una mezcla de solutos basándose en la
diferencia de velocidad con que éstos se mueven a través de una fase estacionaria activa (sílica
gel o alúmina) debido a la diferente capacidad de adsorción que presentan los diferentes solutos
en dicha fase estacionaria. La adsorción depende del tipo de interacción que pueda presentar el
soluto con la fase estacionaria (interacciones puente de hidrógeno, dipolo-dipolo etc.) Mientras
mayor es la intensidad de dicha fuerza mayor será la adsorción del soluto sobre la fase estacionaria
por lo cual su velocidad de desplazamiento disminuye (el soluto queda más retenido). La velocidad
de desplazamiento también depende de la naturaleza del solvente y de las interacciones que éste
presente en el soluto.

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• CROMATOGRAFIA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR (Cromatografía de filtración en gel)

El principio en este tipo de cromatografía, es el fraccionamiento de acuerdo al tamaño de las
moléculas en lugar de las propiedades químicas. A menudo, constituye un método adecuado para
separar las macromoléculas de tamaño diferente o para eliminar los contaminantes de peso
molecular bajo de las disoluciones de moléculas grandes.

En esta técnica la fase estacionaria está constituida por gránulos de un material esponjoso
hidratado, que contiene poros que comprenden un intervalo de tamaños, relativamente reducido,
de dimensiones moleculares.
Si por una columna que contenga estos “tamices moleculares” se hace atravesar una disolución
acuosa que contenga moléculas de varios tamaños, las moléculas que sean demasiado grandes
para atravesar los poros quedaran excluidas del volumen del disolvente contenido en el interior de
los gránulos del gel. Estas moléculas más grandes atravesaran la columna más rápidamente, es
decir, en un volumen de eluyente menor que las moléculas que circulan a través de los poros.

Esta técnica es simple, rápida y más económica que otro tipo de cromatografías, el rango de
sustancias que se pueden separar está limitado por el máximo del tamaño de los poros de la matriz,
no es adecuada para soluciones muy viscosas que afectan la eficiente difusión y migración de
moléculas.

Las moléculas pequeñas

pueden penetrar en las
esferas, su paso se retrasa.
Columna de esferas porosas
estacionarias.

Las moléculas grandes se

mueven entre las esferas.

Flujo del
disolvente
Figura 6: Principio de filtración en gel

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• CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC).

Uno de los avances más significativos de estos últimos años en el campo de la cromatografía
ha sido la introducción de la cromatografía líquida de alta resolución. Originalmente, esta técnica
se diseñó para separar pequeñas moléculas orgánicas solubles en solventes no acuosos, aunque
rápidamente se adecuó para la separación de compuestos biológicos de mayor tamaño solubles
en agua. Actualmente, y debido al desarrollo de soportes macroporosos, la técnica se puede aplicar
a moléculas tan grandes como proteínas y ácidos nucleicos.
La alta eficacia de las columnas de HPLC se deriva del pequeño tamaño de sus partículas. Este
pequeño tamaño necesita presiones altas para obtener velocidades de flujo adecuadas.

PARTE EXPERIMENTAL

I.- Cromatografía de Exclusión: Separación de hemoglobina (Hb) de diclorofenol-indofenol (DCPIP)

en Sephadex G-25 (1-5 KD)

AVERIGUE EL PESO MOLECULAR DE LA HEMOGLOBINA Y DCPIP

1. Previo a la cromatografía

1) Se mide el largo y diámetro interno de la columna y se anotan esos valores.

2) Se agregan 5 ml de agua destilada en un tubo de ensayo y luego se marca de nivel del
agua en el tubo. Finalmente, se replica la marca de nivel de agua en los tubos que se va a
utilizar para la cromatografía (20 tubos).

2. Aplicación de la muestra a separar

3) Se realiza un lavado de la columna con aproximadamente 20 ml de tampón fosfato como

fase móvil, siguiendo las indicaciones de los profesores.
4) Se deposita aproximadamente 0,5 ml de la muestra sobre la superficie de la columna, y se
agrega continuamente tampón fosfato, cuidando de mantener en todo momento un flujo
constante de tampón y evitando que la columna se seque.
5) Se recogen fracciones de 5 ml por cada tubo de ensayo hasta que toda la muestra sea
eluída de la columna.
6)
3. Medidas de Absorbancia:

El volumen eluído debe medirse a partir del momento en que fija la muestra en la columna. Desde
que se deposita la muestra se debe comenzar con la recolección en los tubos.

Se mide la absorbancia de los distintos tubos recogidos a dos longitudes de onda la primera es a
420 nm donde será posible cuantificar la hemoglobina y la segunda a 580 nm para cuantificar el
DCPIP, de acuerdo a las instrucciones entregadas por los profesores.

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II.- Cálculos y Grafico:

• Grafique, en un sólo gráfico, la absorbancia v/s el volumen de elusión a ambas longitudes

de onda.

Perfil de Elusión.

• Determine el Volumen de elusión de cada constituyente de la mezcla.

• Determine el orden de elusión de las sustancias.
• Determine el Kav de la hemoglobina y DCPIP con la siguiente formula:
Kav = VE – VO
VT – VO

VE: Volumen de elusión Hemoglobina o DCPIP

VT: Volumen total ( x r2 x h)
Vo: Volumen muerto (0,35 x VT )

FUENTES BIBLIOGRÁFICAS

(1) Voet, D., Voet, J. Bioquímica. Ed. Omega 1992, pp. 87-93.
(2) Acevedo F., Gentina, J.C. Illanes, A Fundamentos de Ingeniería Bioquímica. Ediciones
Universitarias de Valparaíso De la Pontificia Universidad Católica de Valparaíso 2002, pp 335- 338.
(3) Wiseman A., Manual de Biotecnología de las enzimas Ed: Acribia 1991, pp. 24-39.

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