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Universidad Nacional Mayor de San Marcos

Universidad del Per, DECANA DE AMRICA

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUMICA


Escuela Acadmico Profesional de Farmacia Y Bioqumica

FRACCIONAMIENTO CELULAR. DETERMINACIN DE SU


CONTENIDO PROTICO
INFORME N03

CURSO:

Bioqumica I

DOCENTE:

Q.F.

Mg.

Yadira

ALUMNOS:

ALDERETE ESPEJO, Hattie.


MOLEROS CORAL, Diego Alejandro.
PORRAS COCHACHI, Katia Rub.
QUIONES HUAYANEY, Mara.
TOLENTINO CHVEZ, Jorge Luis.

MESA:

N 03

AO:

Tercero

SEMESTRE: 2013-I

Fernndez

Jer

FRACCIONAMIENTO CELULAR Y DETERMINACIN DE SU CONTENIDO PROTEICO

INTRODUCCIN
Por definicin, y a diferencia de las clulas procariontes, las clulas
eucariontes poseen un ncleo que contiene la mayora del DNA envuelto
en una membrana. Esto deja al material gentico en un compartimento
separado del resto de los contenidos de la clula o citoplasma, donde
ocurren las reacciones metablicas. En el citoplasma se pueden distinguir
varios organelos: cloroplastos, mitocondrias, retculo endoplsmico,
aparato de Golgi, ribosomas, peroxisomas, lisosomas, citoesqueleto, los
cuales cumplen funciones especficas dentro de la clula.
As como un tejido puede ser separado en las clulas que lo constituyen,
con las tcnicas adecuadas la clula puede separarse en los diferentes
organelos y macromolculas que la componen. Una de las tcnicas ms
utilizadas para tal propsito es el Fraccionamiento Subcelular, que permite
obtener componentes celulares aislados, en grandes cantidades y con alto
grado de pureza. Esta tcnica fue desarrollada entre otros por Alberte
Claude y Christian Duve entre1940 y 1950, y consiste en la separacin de
los componentes de la clula en base a su tamao y densidad.
Finalmente, cabe resaltar que una separacin pura de una protena es
esencial para poder determinar sus propiedades y su actividad. Puesto que
las clulas las contienen miles de tipos de diferentes protenas.

FRACCIONAMIENTO CELULAR Y DETERMINACIN DE SU CONTENIDO PROTEICO

I.

OBJETIVOS
Adquirir destrezas en el manejo y en la obtencin de rganos y fracciones celulares a partir de
un ratn de laboratorio.
Obtener homogenizados de hgado de rata.
Separar fracciones subcelulares del homogenizado de hgado de rata mediante el proceso de
centrifugacin diferencial.
Determinar el contenido de protenas en las diferentes fracciones obtenidas.
Aplicar el mtodo de Biuret en la cuantificacin de protenas totales.

II.

MARCO TERICO

El fraccionamiento celular permite separar los componentes de las clulas. Las membranas y
organelos celulares suelen separarse mediante centrifugadoras, aparatos que hacen girar tubos de
ensayo. Esto ejerce una fuerza centrfuga en el contenido de los tubos, que sedimenta las partculas
suspendidas en la solucin (como los organelos y membranas de clulas).
Algunas de estas partculas, como las mitocondrias, son organelos completos. Otras son pequeas
vesculas cerradas, llamadas microsomas, constituidas por membranas de Retculo
Endoplasmtico, complejo de Golgi y membrana plasmtica. Despus de la centrifugacin
algunas de las partculas forman un condensado en el fondo del tubo. Las diferentes partes celulares
tienen densidad distinta, lo que permite separarla en fracciones celulares al centrifugar la suspensin
a velocidad creciente (centrifugacin diferencial).
Las membranas y los organelos de los condensados resuspendidos pueden purificarse despus
mediante centrifugacin por gradiente de densidad, que se ilustra como el ltimo paso en la figura. El
condensado resuspendido se dispone en una capa en la parte superior de un gradiente de densidad,
por lo general compuesto de una solucin de sacarosa y agua. Dado que las densidades de los
organelos y las membranas difieren, cada uno emigrar durante la centrifugacin y formar una
banda a una altura distinta en el gradiente. (1)

Centrifugacin Diferencial o Pelleting


En este mtodo, el tubo de la centrfuga es llenado inicialmente con una mezcla uniforme de la
solucin de la muestra, a travs de la centrifugacin se obtiene una separacin de dos fracciones: Un
pellet (sedimento) que contiene la partcula sedimentada y un sobrenadante con la fraccin no
sedimentada de la solucin. Un particular componente puede terminar en el sobrenadante o en el
pellet, o podra estar distribuido en ambas fracciones, dependiendo de su tamao y/o de las
condiciones de centrifugacin.

FIGURA 1 ESQUEMA DE
FRACCIONAMIENTO CELULAR

FRACCIONAMIENTO CELULAR Y DETERMINACIN DE SU CONTENIDO PROTEICO

El pellet es una mezcla de todos los componentes sedimentados y est contaminado con cualquier
partcula no sedimentada que estuviera en el fondo del tubo. Las dos fracciones son recuperadas por
decantacin de la solucin sobrenadante del pellet.
El sobrenadante puede ser recentrifugado a altas velocidades para obtener una mayor purificacin
con la formacin de nuevo pellet y sobrenadante. El pellet puede ser resuspendido en un pequeo
volumen y recentrifugado dependiendo de lo que se desee separar.

FIGURA 2: CENTRIFUGACION
Otro
mtodo
de
separacin es por gradiente de
DIFERENCIAL
densidad, un mtodo
que es ms complicado que la
centrifugacin diferencial pero tiene algunas ventajas: el mtodo de gradiente de densidad permite la

FRACCIONAMIENTO CELULAR Y DETERMINACIN DE SU CONTENIDO PROTEICO


completa separacin de algunos o todos los componentes de la mezcla y tambin permite que se
puedan realizar mediciones analticas.
Hay dos mtodos bsicos de centrifugacin por gradiente de densidad: La centrifugacin zonal y la
centrifugacin isopcnica o al equilibrio.
Centrifugacin Zonal
Es Cuando se coloca una pequea cantidad de la disolucin con las molculas que se quieren
caracterizar sobre la superficie de un gradiente de densidad previamente formado a lo largo de un
tubo de centrifugacin, en la superficie siempre hay una densidad menor que la existente en la parte
superior del gradiente y cuando se centrifuga el tubo las molculas de la capa superior sedimentan a
travs del gradiente. Si todas ellas tienen el mismo coeficiente de sedimentacin sedimentarn en una
estrecha franja, sin embargo, si hay molculas con distintos coeficientes de sedimentacin, se
separaran unas de otras a medida que se produzca la centrifugacin y finalmente los diferentes
componentes se resolvern en una serie de zonas o bandas, de ah el nombre de centrifugacin
zonal.
Una vez completada la centrifugacin, se fracciona el contenido del tubo generalmente por
recoleccin de las gotas cuando se hace un orificio en el fondo del tubo y el goteo es lo
suficientemente lento para no producir turbulencias. Cada gota representa una lmina del tubo y una
fraccin est representada por una o varias gotas. (2)

FIGURA 3: CENTRIFUGACIN
ZONAL
La separacin zonal es ideal
para separar partculas de
tamao definido (ejemplo: protenas, RNA y ribosomas), sin embargo, las partculas del mismo tipo
son heterogneas; en este caso, la separacin por centrifugacin zonal no es eficiente y es ms

FRACCIONAMIENTO CELULAR Y DETERMINACIN DE SU CONTENIDO PROTEICO


apropiado separar las partculas en base a otro parmetro como la densidad; por lo tanto se recurre a
la separacin isopcnica.
Separacin isopcnica
En este tipo de separaciones, partculas de una densidad en particular se hunden durante la
centrifugacin hasta que se alcanza una posicin donde la densidad de la solucin que las rodea es
exactamente igual a la de las partculas. Una vez que se alcanza este cuasi equilibrio, la longitud de la
centrifugacin ya no influye en la migracin de partculas. Un ejemplo comn para este mtodo es la
separacin de cidos nucleicos en un gradiente CsCl. La Figura 4 ilustra la separacin isopcnica y los
criterios para su xito.

FIGURA 4: ISOPYCNIC
Criterios para el xito de la separacin isopcnica:

La densidad de las partculas utilizadas debe estar dentro de los lmites de las densidades de
los gradientes.
Se admite cualquier longitud de gradientes.
El tiempo de ejecucin debe ser suficiente para que las partculas se agrupen en el punto
isopcnica. No se producen efectos adversos ante el exceso de tiempo. (3)

USO DE COMPUESTOS PARA EL FRACCIONAMENTO CELULAR

FRACCIONAMIENTO CELULAR Y DETERMINACIN DE SU CONTENIDO PROTEICO


Sacarosa:
La sacarosa posee propiedades para ser un ideal medio para la formacin de gradiente y es el ms
utilizado en la centrifugacin zonal. Este material tiene aplicacin en el fraccionamiento de organelos
celulares y virus. La razn de su gran utilidad es su comportamiento inerte ante la presencia del
material biolgico, su bajo costo y su naturaleza estable. Debido a su gran uso, se han caracterizado
las propiedades de la sacarosa y de sus soluciones con respecto a sus relaciones de concentracin y
viscosidad, densidad e ndice de refraccin en un gran rango de temperaturas, y es posible encontrar
las descripciones de los gradientes disponibles y condiciones de centrifugacin para la separacin de
un gran tipo de muestras biolgicas.
La principal desventaja de la sacarosa son algunas de sus propiedades fisicoqumicas. Las soluciones
de sacarosa tienen alta fuerza osmtica y las soluciones por arriba del 9% (p/V) son hipertnicas y
solo tienen una densidad de 1.03 g/cm3 lo que reduce su uso en la separacin de partculas
osmticamente sensibles. Las soluciones concentradas de sacarosa requeridas para separaciones
isopcnicas son muy viscosas, por lo que, las partculas pequeas son incapaces de alcanzar su
posicin isopcnica en el gradiente.
La sacarosa es muy susceptible a hidrlisis de los enlaces glicoslicos a pH menores a 3. Cuando se
calientan, y a menos que se ajuste el pH a 5-6, las soluciones concentradas tienden a caramelizarse
por arriba de los 100 0C.
Los gradientes de sacarosa pueden ser preformados para fraccionamiento zonal de macromolculas y
complejos macromoleculares, por ejemplo, protenas, cidos nucleicos, ribosomas y polisomas,
tambin se utiliza gradientes de sacarosa para la separacin isopcnica de virus, organelos celulares y
de clulas si la viabilidad no es esencial.

Sales de sodio y potasio:


El cloruro de sodio y el cloruro de potasio son soluciones poco densas para bandear la mayora de las
macromolculas.

METODOS DE DETERMIANCION DE PROTEINAS


Mtodo de BIURET

FRACCIONAMIENTO CELULAR Y DETERMINACIN DE SU CONTENIDO PROTEICO


El mtodo comprende un ensayo colorimtrico de un paso donde se cuantifica la formacin de un
complejo estable entre protenas y cobre (II). El complejo presenta un color violeta caracterstico, que
se puede observar a 310nm o 540-560nm, el cual se da por la coordinacin de un tomo de cobre con cuatro
tomos de nitrgeno. El complejo se basa en la desprotonacin de los grupos amida para formar el enlace
con el cobre (II)o por el establecimiento de un enlace coordinado entre el metal y los pares de
electrones libres de los tomos de oxgeno y de nitrgeno del pptido. Despus de la adicin del
reactivo de cobre se requiere de tiempo para desarrollar una coloracin de Biuret estable; es
necesario considerar la posible influencia de aminocidos libres que forman buffer en configuracin
tris y amoniaco. (4)

FIGURA 5: Estructura complejo entre el CU y los


enlaces peptdicos
El mtodo Biuret se basa en la formacin de un complejo coloreado entre el Cu 2+ y los grupos
NH de los enlaces peptdicos en medio bsico.
1Cu2+ se acompleja con 4 NH.
La intensidad de coloracin es directamente proporcional a la cantidad de protenas (enlaces
peptdicos) y la reaccin es bastante especfica, de manera que pocas sustancias interfieren.
La sensibilidad del mtodo es muy baja y slo se recomienda para la cuantificacin de
protenas en preparados muy concentrados (por ejemplo en suero).

VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE DIVERSOS METODOS DE DETERMINACION PROTEICA

Tabla 1: comparacin entre mtodos usados para la


determinacin de protenas

FRACCIONAMIENTO CELULAR Y DETERMINACIN DE SU CONTENIDO PROTEICO

III.

RESULTADOS

BLANCO

FRACCIONAMIENTO CELULAR Y DETERMINACIN DE SU CONTENIDO PROTEICO


1
2
3
4
5
6
estndar (mL)

0.1

0.2

0.4

0.6

0.8

Agua (Ml)

0.9

0.8

0.6

0.4

0.2

Concentracin
(mg/mL)

20

40

60

80

NaCl 0.9% (mL)

Biuret(mL)

0.074

0.077

0.128

0.172

0.226

0.283

ABSORBANCIA

10

Solucin

Absorbancia

Blanco

0.074

Absorbancia Real (Abs. experimental


Abs. Del blanco)
-

Cst1

0.077

0.003

Cst2

0.128

0.054

Cst3

0.172

0.098

FRACCIONAMIENTO CELULAR Y DETERMINACIN DE SU CONTENIDO PROTEICO


Cst4
0.226
0.152
Cst5

0.283

0.209

MUESTRA PROBLEMA
Blanco

Homogenizad
o

Pellet A

Pellet B

Sobren. A

Sobren. B

Vol. M.P

0.2

0.5

Sucrosa 0.25

0.8

0.5

Sol. De NaCl
0.9%

Reactivo de
Biuret

0.107

0.263

0.373

0.137

0.215

0.332

ABSROBANCI
A

Solucin

Absorbancia

Blanco

0.107

Absorbancia Real (Abs. experimental


Abs. Del blanco)
-

Homogenizado

0.263

0.156

Pellet A

0.373

0.266

Pellet B

0.137

0.030

Sobrenadante A

0.215

0.108

Sobrenadante B

0.332

0.225

CONTENIDO PROTICO OBTENIDO EN CADA M.P

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Blanco
REFERENCIA:
Curva de
calibracin

IV.

Homogeni
zado
300 mg/mL

Pellet A

90mg/mL

Pellet B

12mg/mL

Sobren. A

Sobren.
B

84 mg/mL

82
mg/mL

DISC
USIO
NES

Dos
de las

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lecturas correspondientes a la muestra problema se salieron del rango trabajado con los
estndares pero usamos el mtodo geomtrico para estimar una concentracin en mg/mL,
entonces para evitar este problema en futuras prcticas tendramos que revisar bien la dilucin
a la que vamos a llevar cada muestra para que de preferencia tengamos resultados dentro del
rango trabajado con estndares. Las concentraciones determinadas para cada muestra
problema guardan relacin a lo referido tericamente y no hubo mayor discusin respecto a los
resultados ya que si bien la absorbancia no corresponde a la concentracin exacta, esto ltimo
se debe a pequeos errores de medicin o manipulacin, teniendo en cuenta la calidad de las
mediciones espectrofotmetricas a causa del equipo y el manejo de las muestras debido a
nuestra inexperiencia justifican dicha desviacin.

A pesar de tener indicada la aceleracin centrifuga aplicada respecto a cada velocidad en RPM
y observando las diferentes lecturas obtenidas, surge la pregunta si en verdad tenemos en
cada sedimento o sobrenadante lo que decimos tener, es por ello que averiguamos si existen
tcnicas para identificar en cada fraccin celular el respectivo contenido, encontramos que se
puede hacer un anlisis con el microscopio electrnico pero esta tcnica en la mayora de los
casos resulta cara y se necesita una preparacin especial de la muestra.
Otra

tcnica

consiste

en

el

uso

de

marcadores

enzimticos

de

organelas:

Fraccin nuclear: medimos la concentracin de ADN de las distintas fracciones. La mayor


concentracin de ADN debe estar en la fraccin nuclear.
Fraccin mitocondrial: medimos la actividad de la glutamato deshidrogenasa en todas las
fracciones, una mayor actividad corresponde a la fraccin mitocondrial.
Fraccin lisosomal: mayor actividad de la fosfatasa cida o alcalina.
Fraccin microsomal: mayor actividad de la glucosa-6 fosfatasa.
Fraccin soluble: mayor actividad del lactato deshidrogenasa. No debe haber gran cantidad
de actividad de las otras enzimas porque supondra que algunos orgnulos se han roto.
Empleando dichas tcnicas podramos determinar si hemos llevado a cabo correctamente
todos los procedimientos desde la homogenizacin en solucin isotnica hasta la correcta
centrifugacin.

Si bien hemos usado la centrifugacin diferencial averiguamos qu otras tcnica de


centrifugacin se usa generalmente en el fraccionamiento subcelular y consultando en la web
algunos otros manuales de prcticas de bioqumica notamos que la otra tcnica que ms se
usa es la centrifugacin isopicnica que consiste en separar las partculas en funcin a su
densidad. Dicha separacin tiene lugar en el seno del disolvente que presenta un gradiente
continuo de densidad. El desplazamiento de la partcula se detiene cuando sta encuentra un

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medio
cuya
densidad
es
igual
a
la
propia.
Adems este tipo de centrifugacin tambin se usa para purificar cada sedimentado obtenido
en cada centrifugacin diferencial, ya que as se pueden separar partculas de igual
coeficiente de sedimentacin segn su diferente densidad.

V.

Otra duda que surgi fue sobre la importancia del tiempo, si tendramos los mismos resultados
duplicando el tiempo de centrifugacin o si detuviramos el proceso a la mitad; pues la
respuesta se halla en la Ley de Stokes. Ya que no hemos modificado ni el dimetro ni la
densidad de las partculas, ni la densidad ni viscosidad del medio; la nica variable a la que le
podemos hacer cambios es a la gravedad y esto se logra con las diferentes fuerzas de
centrifugacin aplicadas a cada tubo en cada parte del experimento. Si cambisemos el tiempo
de centrifugacin nos distanciaramos del objetivo que realmente queremos retener en cada
pellet o mantener en cada sobrenadante.

CONCLUSIONES
El mtodo de centrifugacin diferencial es el adecuado para separar fracciones subcelulares
previas a una homogenizacin.
Se determin fracciones celulares como ncleos, mitocondrias, lisosoma por centrifugacin
diferencial.
El contenido proteico fue determinada por el mtodo de Biuret y se obtuvo lo siguiente:
Homogenizado >Pellet A>Sobrenadante A>Pellet B>Sobrenadante B.

VI. CUESTIONARIO
1. Con qu fin obtenemos fracciones celulares?
Las fracciones celulares son ampliamente usados para la investigacin en la bioqumica y fisiologa
de organelos fuera del ambiente complejo de la clula intacta. El objetivo principal de este
experimento es aislar los cloroplastos, ncleo y mitocondria del tejido de plantas por el mtodo de
fraccionamiento celular. Los otros objetivos son examinar esas fracciones microscpicamente y
estimar el coeficiente de sedimentacin de los organelos.

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2. Qu se supone determinar en cada una de las fracciones obtenidas?
Las clulas se lisan y los componentes subcelulares se separan mediante una serie de
centrifugaciones que van aumentando de velocidad. Despus de cada centrifugacin, los orgnulos
que se han sedimentado en el fondo del tubo, se recogen en forma de precipitado slido. El
sobrenadante se centrifuga a una mayor velocidad para sedimentar la siguiente organela ms grande.
Se sedimentan las estructuras ms grandes y pesadas con mayor rapidez.
Se puede determinar de las fracciones:
Uso enzimas marcadoras de orgnulos: Consiste en que cogemos una fraccin de cada precipitado
y medimos la actividad caracterstica de un orgnulo.
Fraccin nuclear: medimos la concentracin de ADN de las distintas fracciones. La mayor

concentracin de ADN debe estar en la fraccin nuclear.


Fraccin mitocondrial: medimos la actividad de la glutamato deshidrogenasa en todas las
fracciones, el mayor pico debe salir en la fraccin mitocondrial.
Fraccin lisosomal: actividad de la fosfatasa cida o alcalina.
Fraccin microsomal: actividad de la glucosa-6 fosfatasa.
Fraccin soluble: lactato deshidrogenasa. No debe haber gran cantidad de actividad de las otras
enzimas porque supondra que algunos orgnulos se han roto.

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3. Explique el fundamento de la determinacin de protenas por el mtodo de Biuret.


Los pptidos y protenas producen una reaccin del Biuret .Las protenas por sus uniones
peptdicas reaccionan con los iones cpricos del reactivo en medio alcalino formando un
complejo de color violeta .Se necesita 2 o ms uniones peptdicas para que se forme el
complejo coloreado.

4. Cul es el coeficiente de sedimentacin de los lisosomas y mitocondrias?


Coeficientes de Sedimentacin:
Mitocondrias: Entre 105 y 107 S.
Lisosomas: entre 50 y 9000 S.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

FRACCIONAMIENTO CELULAR Y DETERMINACIN DE SU CONTENIDO PROTEICO

1. Villee, Cluade. Biologa. Fraccionamiento celular; 1998.


2. Montero Hilda. Mtodos. Centrifugacin. Disponible en
http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/Centrifugacion.pdf
3. THERMO. Conceptos Bsicos de centrifugacin. Disponible en
http://www.coleparmer.com/TechLibraryArticle/910
4. PAPIME. Anlisis de alimentos, fundamentos y tcnicas. Disponible en
http://es.scribd.com/doc/42854211/43/Metodo-de-Biuret.
5. Pruebas cualitativas .Identificacin de compuestos bioqumicos.Disponible en
http://docencia.izt.uam.mx/japg/RedVirtualJAP/CursoDRosado/2_EstructuradeCompue
stosBioquimicos/9-1_ReaccionesIdentificacion.pdf
6. Laboratory Investigations in Cell and Molecular Biology, Allyn Bregma. cell
fractionation. Link available at:
http://facultad.bayamon.inter.edu/amlugo/LAB%20DESTREZAS%20III/FRACCEL.htm
7. Marino Villavicencio Nez. Bioqumica. Tomo primero. Captulo V. Universidad
Nacional Mayor de San Marcos.