Técnicas de separación de

Moléculas

• Métodos Físicos

• Métodos Químicos
 Las técnicas de separación de moléculas explotan
las diferencias entre las características físicas de
los compuestos que forman una muestra
biológica, ya que normalmente se asemejan en
sus características químicas.
 Estos métodos normalmente se acoplan a
métodos químicos que permitirán la
cuantificación de cada uno de los compuestos de
la muestra biológica, después de separarlos.
 Entre las propiedades físicas que pueden explotarse
para la separación de las biomoleculas, podemos
citar la polaridad, que determina la solubilidad,
volatilidad y la adsorción sobre sólidos de un
compuesto, el tamaño de las moléculas, la carga,
afinidad, etc.
 Las primeras técnicas de análisis para para la
identificación las moléculas se fundamentaron en la
solubilidad de las diferentes biomoléculas en los
distintos disolventes
 Diseño de las técnicas de
separación de moléculas
 La separación se da por la diferente velocidad de las moléculas a separar
en un medio determinado
 Normalmente hay una fuerza impulsora del movimiento de las moléculas,
a la que se opone una fuerza que retarda dicho movimiento, siendo la
fuerza resultante función de las características físicas de las moléculas y
del medio en el que se realiza dicha función.
 Separación de mezclas
Para poder identificar y analizar los componentes de una mezcla es necesario separarlos.
Esto se puede lograr por medio de distintos métodos físicos y químicos.
La elección del método dependerá de las características de la mezcla y sus componentes.

HOMOGÉNEAS HETEROGÉNEAS
Soluciones Dispersiones

Métodos de fraccionamiento Métodos de separación de fases

Procedimientos que permiten separar los Procedimientos físicos y mecánicos cuyo objetivo es
componentes de una mezcla homogénea. separar las diferentes fases de una mezcla heterogénea

• Destilación • Centrifugación
• Cristalización • Filtración
• Cromatografía • Extracción
• Tamizado
 Centrifugación
 El coeficiente de sedimentación tiene unidades de segundos. Los
valores típicos para las moléculas se encuentran cerca de por lo que
esta cantidad se ha designado como 1 unidad Svedberg (S).
 Por ejemplo, el coeficiente de sedimentación de la hemoglobina es de
aproximadamente 4.10-13s, o 4 S.
 Las partículas celulares suelen identificarse por su valor de S, por
ejemplo: ribosoma 70 S.
 S aumenta con la masa de la partícula, pero la relación no es lineal.
 A pesar de que podemos utilizar la sedimentación como una medida
estimativa del peso molecular, la relación es sólo aproximada.
 Puesto que las partículas o moléculas de distinto tamaño difieren en
cuanto a S, y en consecuencia también difieren en su velocidad de
sedimentación, la sedimentación es una herramienta útil para la
separación
Según su PM
 Separación por diferencia de
tamaño
 Filtracion
 Dialisis
 Cromatografia

 ¿Qué es la Cromatografía?
Es una técnica de separación en la que los componentes de una muestra se separan en dos
fases: una fase estacionaria de gran área superficial, y una fase móvil.

El objetivo de la fase estacionaria es retrasar el paso de los componentes de la muestra.

Cuando los componentes pasan a través del sistema a diferentes velocidades, estos se
separan en determinados tiempos. Cada componente tiene un tiempo de paso
característico a través del sistema, llamado tiempo de retención. La separación
cromatográfica se logra cuando el tiempo de retención del analito difiere del resto de
componentes de la muestra.
Métodos de separación en mezclas heterogéneas

Filtración

Esta técnica está basada en el

diferente tamaño de las partículas
de las sustancias que componen Arena y agua
la mezcla.
Se utiliza para separar un sólido Arena y agua
de un líquido en el cual no es
soluble. Para ello, se hace pasar Preparación
la mezcla por un material poroso, de un papel
Arena
de filtro
como papel, telas, etc., que
retiene las partículas de la mezcla
cuyo tamaño sea mayor que el Agua
Agua
tamaño del poro.
En el laboratorio se suele emplear
un papel de filtro colocado en un Agua
embudo.
 Separación por diferencia de
tamaño
 Diálisis: a través de una membrana
semipermeable pequeñas moléculas pueden
ser removidas de una solución de proteínas
• La diálisis se utiliza usualmente para eliminar las pequeñas moléculas contaminantes o
para cambiar suavemente las condiciones de una solución tampón
• La ultrafiltración se utiliza algunas veces para concentrar soluciones de
macromoléculas. Se utiliza una membrana semipermeable similar, pero se aplica presión
para hacer salir al disolvente y a las moléculas pequeñas a través de la membrana, con
lo que se concentran las macromoléculas
La sangre pasa por un extremo del filtro y
entra a muchas fibras huecas muy
delgadas. A medida que la sangre pasa a
través de las fibras huecas, la solución de
diálisis pasa en dirección opuesta en el
exterior de las fibras. Las toxinas de la
sangre pasan a la solución de diálisis. La
sangre filtrada permanece en las fibras
huecas y regresa al organismo.
Los métodos cromatográficos comportan el paso de una solución a través de un medio que
presenta una absorción selectiva para los distintos componentes solutos

se coloca la mezcla
de las moléculas que se van se hace pasar
a separar en la parte superior lentamente a lo
de la columna largo de la
columna una
solución tampón

se humedece la
columna con la
solución tampón
adecuada

Se forman fracciones, mientras

continúa este proceso de elución.
 La electroforesis se basa en la migración
de iones presentes en una disolución por
la acción de un campo eléctrico.

Modificando convenientemente las

condiciones de electroforesis se
pueden
una separar moléculas e
neutras
iones, así como isómeros ópticos,
y disminuir los límites de detección.
 Electroforesis
Elektro: Electricidad
Phoros:
Movimiento
Esta técnicafue introducida porel
bioquímico Arne Su
sueco interés fue
Tiselius.
la química de
principal las
proteínas séricas.
Recibió el premio Nobel en el año 1948
por su gran contribución en el desarrollo
de la técnica de electroforesis y por la
importancia de su hallazgo sobre la
naturaleza compleja de las proteínas del
suero.
 Método de separación de:

Proteínas

Ácidos nucleicos

Otras biomoléculas

Permite determinar:

• Peso molecular de una proteína

• Punto isoeléctrico
• Distinguir moléculas por su carga neta o su forma
Electroforesis Separación de especies
cargadas, anión (-) y catión (+)

Influencia de campo
cargado eléctricamente

Movimiento al cátodo (-) o al

ánodo (+)

- +
Ánodo Cátodo

+ - + -

Técnica de separación que consiste en el transporte de iones

a través de una disolución por acción de un campo eléctrico.
 FUNDAMENT
O
La electroforesis separa moléculas según su
relación carga:masa

Las moléculas disueltas se desplazan o migran en un

campo eléctrico a una velocidad determinada por su
relación carga:masa.

Por ejemplo: si dos moléculas tienen masa y formas iguales, la de

mayor carga neta se desplazará más rápido hacia un electrodo

La movilidad electroforética (μe) depende de:

• La carga de la molécula, su tamaño y su forma.

* la carga, a su vez, depende del pH de la disolución.
 FUNDAMENT
O
LA VELOCIDAD DE MIGRACIÓN (V) DE LA PARTÍCULA es
directamente proporcional al producto de su carga efectiva
(q) y el gradiente de potencial eléctrico (E) e inversamente
proporcional al coeficiente de fricción (f) relativo a la
forma de la molécula, o sea, a la resistencia que le ofrece
el medio.

V=qE/f
 FUNDAMENT
O

El movimiento de las moléculas está gobernado también por dos fuerzas

adicionales: inicialmente la fricción con el solvente dificultará este
movimiento originando una fuerza que se opone, por otro lado las moléculas
poseen energía cinética propia por lo que tienden a moverse en forma
aleatoria o movimiento browniano
PARÁMETROS QUE INFLUYEN EN LA MOVILIDAD
ELECTROFORÉTICA
Parámetros externos
- Campo eléctrico
- Temperatura

Parámetros relacionados con el solvente y con el sistema

electroforético
- Viscosidad
-Fuerza iónica
-La naturaleza de los iones componentes
-El pH
Parámetros relacionados con el
soluto
- La carga
- La forma y el tamaño de los iones
 La velocidad de migración electroforética depende de
los siguientes FACTORES:
 Carga: cuanto mayor sea la carga, mayor será la movilidad,
además su carácter catiónicos o aniónicos determinará la
dirección del desplazamiento.

 Tamaño y forma de las partículas: el tamaño del ión es un

factor decisivo; cuanto menor sea un ión mayor será su
movilidad.

 Fuerza iónica y pH del la mayoría de

solvente:
biomacromoléculas (proteínas, ácidos nucleicos las
polisacáridos) poseen determinada carga eléctrica con gruposy
aniónicos y catiónicos capaces de disociarse.
FACTORES:

 Temperatura: el aumento de la temperatura puede traducirse en

destrucción, o en la alteración de sus características (estructura,
función, entre otros) de las que depende la movilidad
electroforética.

 Viscosidad del medio: al disminuir la viscosidad aumenta

la
movilidad.

 Voltaje: no se puede incrementar indiscriminadamente porque se

genera un excesivo calor.
 Fenómenos que pueden originarse en el sistema
electroforético

DIFUSIÓN

 Esta provocado por la existencia de gradientes de

concentración que favorecen el transporte hacia las zonas de
menor concentración de cada especie.

 Afecta tanto a partículas cargadas como no cargadas.

 Las moléculas tienen a moverse en forma aleatoria

(movimiento browniano) debido a que poseen energía cinética
propia
 Fenómenos que pueden originarse en el sistema
electroforético

MIGRACIÓN:
Es el movimiento de las especies producido por una fuerza externa
que es impuesta al medio, en este caso, el campo eléctrico y su
intensidad.

CONVENCIÓN:
Se trata de un fenómeno no deseable en electroforesis. Consiste en el
transporte de todo tipo de especies, cargadas y no cargadas.
 Fenómenos que pueden originarse en el sistema
electroforético

FLUJO TÉRMICO
Al pasar una corriente eléctrica a través de un sistema que origina
una resistencia dada, se produce calor. Por tanto, el sistema
electroforético no es isotérmico.

FRICCIÓN
La fricción con el solvente dificultará el movimiento (es decir, al
moverse los solutos chocarán con las moléculas de solvente que
están en su camino), lo que genera una fuerza que se opone al
movimiento.
Métodos
Electroforesis libre (en disolución)

Electroforesis Zonal (sobre un medio soporte)

Geles
En Papel Sílice
(a través de una matriz porosa)

Agarosa Policramida
 Electroforesis libre: sin la presencia de soporte

Las moléculas cargadas migran hacia los electrodos, aunque no

bien separadas por tratarse de una disolución. Actualmente está
en desuso, ya que al ser un fluido el medio en el que se
desarrolla, tiene poco poder de resolución.

Tiselius
 Electroforesis zonal: presencia de soporte

Es una de las técnicas más utilizadas en bioquímica y biología

molecular por su elevada resolución. El campo eléctrico se
aplica a un medio o soporte estabilizante (en vez de a un
fluido) y la muestra se deposita en una reducida zona del
mismo.
 Medios de Soporte
Soportes no
Soportes restrictivos
restrictivos
• Porosidad del • Poros de tamaño
soporte mucho similar al de las
mayor que el tamaño moléculas.
de las moléculas. • Efecto de tamizado
• No ofrece restricción durante el avance.
al avance de las • Se separan
moléculas. dependiendo de su
• Se separan tamaño.
dependiendo de su
densidad de carga.

Ejemplo: acetato de celulosa (para Ejemplo: Agarosa (para ácidos nucleicos),

proteínas), agarosa (para proteínas) poliacrilamida (para proteínas)
 Medios de Soporte

 Método sencillo y
rápido
• Proteínas
 Separación de: • Oligonucleótidos
• Carbohidratos
Papel • Lípidos

• Se desgarra fácilmente
• Distorsiona las bandas
 Desventajas • Se produce interacción
las proteínas y los
entre
grupos
hidroxilo de la celulosa
Electroforesis en Papel
 Medios de Soporte

 Se usa en el análisis de fluidos biológicos

(proteínas séricas, proteínas urinarias,
hemoglobinas).
Acetato de
Celulosa  Tiempo de análisis corto.
 Sencillez en la técnica.
 Desventaja: débil resolución

Gran parte de los grupos hidroxilo de la celulosa se

han esterificado por acetilación, por lo que no hay
interacción con las proteínas
 Medios de Soporte

• Técnica
 Almidón económica,
fácil y rápida.

• Soporte más usado en

 Poliacrilamida electroforesis.
• Alta resolución.
Gel • Componentes tóxicos

• Buena resolución
• Separación de moléculas
 Agarosa grandes (virus, ácidos
nucleicos).
 Electroforesis en Geles de Poliacrilamida
(PAGE)
Polimerización de
acrilamida

Químicamente inertes

Geles de porosidad controlable

Forma geles transparentes

Permiten buena visualización
 Electroforesis en Gel de Agarosa

Polisacárido obtenido de
algas

Separa moléculas grandes

(20 000 nucleótidos)

Actúa en forma restrictiva

frente a las fibras de ADN
Presentan mucha carga negativa
(migran hacia el ánodo)
 Electroforesis en gel

Isoelectroenfoque

TIPOS DE
ELECTROFORESI
S Electroforesis capilar

Electroforesis

bidimensional
 Cubeta vertical u
horizontal donde se
coloca el soporte

Sistema de
revelado y lectura Buffer
(Detector)

COMPONENTES DE UN SISTEMA
ELECTROFORÉTICO

Estándares y
2 electrodos
muestra

Fuente de poder
COMPONENTES DE UN SISTEMA ELECTROFORÉTICO

 Cubeta vertical u horizontal

donde se coloca el soporte
 Buffer
 Estándares y muestra
 Fuente de poder
 2 electrodos
 Sistema de revelado y lectura
(Detector)
COMPONENTES DE UN SISTEMA ELECTROFORÉTICO
DETERMINACIÓN DEL NÚMERO Y PESO
APROXIMADO DE LAS SUBUNIDADES DE
PROTEÍNAS: ELECTROFORESIS EN GEL SDS

• En estas condiciones, las estructuras secundaria, terciaria y cuaternaria de

las proteínas se descomponen todas. La cadena se despliega y se rodea de
moléculas de SDS.
• Las numerosas cargas negativas transportadas por las moléculas de SDS
unidas a la proteína hacen que la carga que ésta transporta sea
insignificante.
• La cadena polipeptídica plegada se transforma en un objeto alargado, cuya
carga y longitud son proporcionales a la longitud y al peso molecular de la
cadena. Estas partículas migrarán en la electroforesis en gel con
movilidades relativas, que dependen únicamente de sus longitudes.
• Cuando se investigan las subunidades de una proteína mediante
esta técnica, es aconsejable realizar dos experimentos: uno en
presencia de un agente reductor de enlaces disulfuro como el
B–mercaptoetanol (HSCH2CH2OH) y otro en su ausencia.

• Si se encuentra una sola banda en cada uno de estos geles con

SDS, correspondiente en peso molecular a la de la proteína
nativa, podemos concluir que la proteína existe en condiciones
fisiológicas como una única cadena polipeptídica.

• La presencia de más de una banda en el gel con SDS es una

indicación clara de que se trata de múltiples tipos de
subunidades.
 APLICACIONES DE LA
ELECTROFORESIS

Es posible separar moléculas biológicas en dependencia

fundamentalmente de carga la influencia de un campo
bajo
su eléctrico.

Método de separación de mezclas complejas de ácidos nucleicos,

proteínas y otras biomoléculas, donde aportan un potente criterio de
pureza.

Es útil además para determinar otros parámetros como peso

molecular, punto isoeléctrico y número de cadenas polipeptídicas de
las proteínas.