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CROMATOGRAFÍA DE COLUMNA

OBJETIVOS:

• Conocer la cromatografía en columna como técnica de separación de mezclas de sustancias, sus


características y los factores que en ella intervienen.

• Utilizar la cromatografía en columna para la purificación de una sustancia contaminada con un


colorante.

• Controlar con cromatografía en capa fina el proceso de separación de mezclas por cromatografía en
columna

FUNDAMENTO TEÓRICO

La cromatografía es la técnica que valga la redundancia agrupa una serie de técnicas que permiten
analizar, purificar o separar una mezcla de solutos basada en la velocidad de desplazamiento diferencial
de los mismos que se establece al ser arrastrados por una fase móvil (liquida o gaseosa) a través de un
lecho cromatográfico que contiene la fase estacionaria, la cual puede ser sólida o líquida, por lo que es
uno de los métodos más eficientes y más utilizados actualmente en los laboratorios de química. Ningún
otro método de separación es tan potente y de aplicación tan general como la cromatografía.

Es difícil definir rigurosamente el término de cromatografía, ya que se ha aplicado ese nombre a varios
sistemas y técnicas. Sin embargo, todos esos métodos tienen en común el uso de una fase estacionaria y
una fase móvil.

Sin embargo este nombre proviene de la primera experiencia cromatográfica realizada, la cual se utilizo
para separar pigmentos coloreados de plantas. La cromatografía fue descubierta por el botánico ruso de
origen italiano Mijail Tswett en 1903. Tswett separo los pigmentos de las plantas (clorofila) vertiendo
extracto de hojas verde en éter de petróleo sobre una columna de carbonato de calcio en polvo en el
interior de una probeta. No obstante, no existen datos sobre la utilización de esta técnica hasta 1930
cuando khun y Lederer separaron también pigmentos de las plantas usando como adsorbentes alúmina y
carbonato de calcio. Fue a partir de ahí cuando se inicio el verdadero desarrollo de la cromatografía.

Para explicar el fenómeno cromatográfico es necesario establecer dos tipos de fundamento, uno remoto y
otro próximo:

Fundamento remoto: Este fundamento se encuentra en alguna o algunas propiedades físicas o físico
químicas de los analitos: solubilidad, adsorción (tendencia a ser retenidos en sólidos finamente divididos),
volatilidad, tamaño, carga, reactividad química o bioquímica, etc. La mezcla de sustancias a separar se
coloca en una situación experimental dinámica donde exhiben dos de estas propiedades, o bien una de
ellas pero por duplicado tal como la solubilidad en dos líquidos diferentes como ocurre en cromatografía
liquido - liquido. Deben cumplirse las condiciones siguientes:

- Los componentes de los sistemas empleados deben estar en intimo contacto entre si.

- El equilibrio establecido entre esos componentes debe ser lo más completo posible.

Fundamento próximo: Se encuentra en el hecho de que es muy improbable que dos especies
presenten cuantitativamente el mismo par de propiedades físicas o físico - químicas frente a un sistema
cromatográfico dado. Por tanto, en estas diferencias, que pueden ser muy pequeñas, se basa la separación
cromatográfica.
Si se transforma la idea del equilibrio estático establecido entra las dos fases en un equilibrio dinámico, se
tiene la realidad del fenómeno cromatográfico. Como se ha indicado anteriormente, una de las fases,
denominada fase móvil, fluye a través de la otra, a la que se denomina fase estacionaria, que permanece
inmóvil, y que, al menos en una extensión esta en equilibrio con la fase móvil.

Las propiedades de los componentes de una mezcla determinan so “movilidad” entre si y con respecto a
la fase móvil. Se eligen las condiciones experimentales y las fases cromatográficas para que los
componentes de la mezcla se muevan a distinta velocidad. La base de la separación cromatográfica será,
por tanto, la diferencia en la velocidad de migración de los mismos.

La cromatografía es probablemente la más versátil de las técnicas de separación: es aplicable a cualquier


mezcla soluble o volátil. De hecho las técnicas de separación suelen dividirse en dos grandes grupos:
cromatograficas y no cromatograficas. La elección de una técnica cromatográfica concreta dependerá de
la naturaleza y cantidad de la muestra, del objetivo de la separación y de las limitaciones del tiempo y
equipo asequible

Puede hacerse una primera distinción entra las técnicas cromatográficas atendiendo a la integración
continua o no del sistema de detección. Así, la cromatografía no conlleva a un sistema de detección,
mientras que cualquier cromatógrafo de líquidos o gases lleva incorporado dicho sistema siendo, por
tanto, auténticos instrumentos.

Clasificaciones:
Para clasificar globalmente los procesos cromatográficos es necesario atender a dos criterios básicos:

 Fundamento del proceso cromatográfico, lo que conduce a los tipos de cromatografias

 Forma de realizar el proceso cromatográfico, es decir, lo que constituye las distintas técnicas
cromatográficas

Tipos de cromatografías:

Si es un sólido, cabe distinguir entre:

 Cromatografía de adsorción: 

El sólido adsorbe al componente que inicialmente estaba en fase móvil (liquida o gaseosa) (Fuerzas de
Van der Waals).

Se realiza generalmente en columna (también es posible en capa fina), que se rellena de un adsorbente
adecuado. El sistema es bañado por un solvente que fluye a través de la columna para comprobar el
funcionamiento de la misma. Por la parte superior se introduce la sustancia a separar disuelta
adecuadamente. Se deja fluir por la columna. Antes de que ésta quede totalmente seca se incorporan
los disolventes de acuerdo con la solubilidad de las sustancias, sufriendo durante su arrastre
interacciones de polaridad con el sólido adsorbente. Los eluatos son recogidos para su determinación
posterior, normalmente por un método espectroscópico (espectrofotometría, espectrofluorimetría). Las
separaciones se basan en las diferencias de distribución de los solutos entre el adsorbente (fase
estacionaria) y el disolvente (fase móvil) de acuerdo con sus respectivas isotermas de adsorción.

Los adsorbentes más utilizados, ordenados de mayor a menor actividad son:

• Alúmina

• Sílice

• Carbonato cálcico
 Cromatografía de cambio iónico o intercambio iónico: 

El sólido es un cambiador de iones (fuerzas electrostáticas).

Esta cromatografía está basada en las interacciones electrostáticas que se producen entre los grupos
ionizables de los productos a separar y los grupos cargados unidos a un soporte inerte (fase
estacionaria). Existen dos clases principales de soportes (cambiadores), según el tipo de grupos
enlazados que posea:

• Catiónicos: con grupos cargados negativamente y que intercambian iones del medio con carga
positiva.

• Aniónicos: con grupos positivos y que intercambian iones negativos.

Los grupos cargados de la matriz insoluble determinan el tipo y la fuerza del cambiador. La fase
cargada inmóvil está inicialmente neutralizada por cationes o aniones (contraiones), dependiendo de
su naturaleza. Cuando la mezcla iónica a separar se pone en contracto con la fase inmóvil, en
condiciones oportunas de fuerza iónica y pH, se produce el intercambio iónico formándose sales y
asociaciones iónicas entre la fase estacionaria y la móvil:

• Los grupos fenólico, carboxilo y sulfónico se utilizan como cambiadores catiónicos.

• Los grupos amino, alifático y aromático, se utilizan como cambiadores aniónicos.

Este tipo de cromatografía se usa para la separación de aminoácidos, péptidos, proteínas, nucleótidos
y, en general, para los compuestos que tengan naturaleza iónica. En clínica, se utilizan para la
separación de hemoglobinas, isoenzimas, esteroides, etc.

 Cromatografía de exclusión (o de geles) , el sólido es un gel formado por polímeros no iónicos


porosos que retienen a las moléculas de soluto según su tamaño.

La cromatografía de exclusión, también llamada de filtración en gel o cromatografía de permeación en


gel, se basa en la diferencia de penetración de las moléculas en los poros de la fase estacionaria debido
a que la separación obtenida depende del tamaño de la molécula. El tiempo de elución es proporcional
al peso molecular de los mismos, por lo que no es muy usada con los compuestos de alto peso
molecular. Este tipo de separación por tamaño difiere de las demás técnicas de cromatografía en que
no existen interacciones físicas o químicas entre el analito y la fase estacionaria. Es una técnica
reproducible, escalable y rápida.
La fase fija está formada por partículas poliméricas o de sílice que contienen una red uniforme de
poros por los que pueden penetrar las moléculas de pequeño tamaño. Las moléculas de tamaño grande
se excluyen totalmente y son eluidas en primer lugar, mientras que las de pequeño tamaño tienen
acceso a todo el volúmen poroso y son las últimas que se eluyen; de esto se deduce que el volúmen
disponible para las moléculas pequeñas es mayor que para las grandes. Por lo tanto las moléculas se
eluyen por su tamaño decreciente. En resumen los factores que determinan la separación de las
moléculas son el tamaño del poro, el tamaño de la partícula y el flujo de elución.
Los diferentes tipos de partículas usadas deben ser estables, mecánica y químicamente, tener bajo
contenido en grupos iónicos, uniformidad de poro y tamaño. Los compuestos pueden ser derivados de
dextranos (Sephadex), derivados de agarosa (Sepharosa), derivados de acrilamidas (Biogel P) y
esferas de vidrio. Hay diferentes tamaños de partícula para un gel: a menor tamaño mayor resolución
y menor gasto en la columna.

Esta técnica se emplea en la separación de proteínas de alimentos, determinación de glucosa y


fructosa en zumos de fruta, etc.

 Cromatografía de afinidad: 
Es un tipo especial de cromatografía de adsorción, utilizada especialmente en bioquímica, en la que un
sólido tiene enlazado un llamado ligando de afinidad que puede ser por ejemplo, un indicador
enzimático o un anticuerpo.

Para ello un ligando de afinidad se une al soporte de la FE. Cuando la muestra atraviese la columna
solo se retendrá la sustancia capaz de reaccionar con dicho ligando.

Una vez concluida la separación hay que provocar la salida de la sustancia que dio la reacción
específica.

Si es un líquido que se encuentra soportado en un sólido inerte, se trata de la Cromatografía de partición.


El soluto se reparte entra la fase móvil (liquido o gas) y la fase estacionaria.

Según la naturaleza de la fase móvil, la técnica cromatográfica correspondiente recibe el nombre de dicha
fase móvil:

Si es un líquido, cromatografía liquida, cabe distinguir:

 Cromatografía liquido-liquido (CLL) en la que ambas fases son liquidas y, por tanto, se
trata de una cromatografía de partición.

Es una técnica de separación y no debe confundirse con una técnica cuantitativa o cualitativa de
análisis. Es una de las técnicas analíticas ampliamente utilizada, la cual permite separar
físicamente los distintos componentes de una solución por la absorción selectiva de los
constituyentes de una mezcla. En toda cromatografía existe un contacto entre dos fases, una fija
que suele llamarse fase estacionaria, y una móvil (fase móvil) que fluye permanente durante el
análisis, y que en este caso es un líquido o mezcla de varios líquidos. La fase estacionaria por su
parte puede ser alúmina, sílice o resinas de intercambio iónico que se encuentran disponibles en
el mercado. Los intercambiadores iónicos son matrices sólidas que contienen sitios activos
(también llamados grupos ionogénicos) con carga electrostática (positiva o negativa). De esta
forma, la muestra queda retenida sobre el soporte sólido por afinidad electrostática. Dependiendo
de la relación carga/tamaño unos constituyentes de la mezcla serán retenidos con mayor fuerza
sobre el soporte sólido que otros, lo que provocará su separación. Las sustancias que permanecen
más tiempo libre en la fase móvil, avanzan más rápidamente con el fluir de la misma y las que
quedan más unidas a la fase estacionaria o retenidas avanzan menos y por tanto tardarán más en
salir o fluir. Éste es el principio fundamental de la cromatografía. Un ejemplo notable es la
cromatografía de intercambio iónico. Las columnas más utilizadas son las de sílice.

 Cromatografía liquido-sólido (CLS) en la que la fase estacionaria es sólida (adsorción,


cambio iónica, exclusión, afinidad).

Si es un gas, cromatografía de gases, puede ser:

 Cromatografía gas-liquido (CGL), que es una cromatografía de partición.

 Cromatografía gas-sólido (CGS), que es una cromatografía de adsorción.

Si es un fluido supercrítico, (fluido calentado a una temperatura superior a la temperatura crítica, pero
simultáneamente comprimido a una presión mayor que su presión critica), se trata de la cromatografía de
fluidos supercríticos (CFS), que puede ser de partición o de adsorción.

Técnicas cromatográficas:

1. Cromatografía en columna:
En la cromatografía en columna la separación se consigue haciendo fluir la mezcla a través de una
columna de adsorbente. Los compuestos emergen de la columna a tiempos diferentes, y pueden ser
recogidos en fracciones separadas.

En una columna cromatográfica se deben tener en cuenta los siguientes términos:

  matriz de la columna. Sustancia que está empapada de solvente y que  se empaqueta en la


columna. También se denomina el lecho de la columna.
  longitud de la columna. Longitud del dispositivo en el que se empaqueta la columna.
 volumen de la columna. Volumen total de gel que se empaqueta en una columna cromatográfica.
 volumen muerto de la columna. Cantidad de solvente que tiene que   atravesar la columna para
asegurar que se ha reemplazado completamente.

Comúnmente se suele usar como adsorbente alúmina o sílice. Las fases móviles se usan en función de la
polaridad de los compuestos a separar.

Se utiliza un tubo cilíndrico, en cuyo interior se coloca la fase estacionaria y a su través se hace pasar la
fase móvil. El flujo de la fase móvil (líquido o gas) a través de la estacionaria se consigue:

1) Por presión, 2) por capilaridad, 3) por gravedad.

Clasificación general Método específico Fase estacionaria Tipo de equilibrio

Cromatografía de líquidos Líquido adsorbido sobre un Distribución entre liquidos


Líquido-líquido, o reparto
(LC) (fase móvil: líquida) sólido inmiscibles

Especies orgánicas
Líquido-fase unida Distribución entre líquido
  enlazadas a una superficie
químicamente. y la superficie enlazada.
sólida.
  Líquido-sólido, o adsorción Sólido Adsorción
Resina de intercambio
  Intercambio iónico Intercambio iónico
iónico
Líquido en los intersticios
  Exclusión por tamaño Distribución/exclusión
de un sólido polimérico
Cromatografía de gases Líquido adsorbido sobre un Distribución entre un gas y
Gas-líquido
(GC) (fase móvil: gas) sólido un líquido
Especies orgánicas Distribución entre el
Gas-fase unida
  enlazadas a una superficie líquido y la superficie
químicamente
sólida enlazada
  Gas-sólido Sólido Adsorción
Cromatografía de fluidos Especies orgánicas Distribución entre el
supercríticos (SFC) (fase   enlazadas a una superficie líquido y la superficie
móvil: fluido supercrítico) sólida enlazada

Es de destacar que en la actualidad, aunque incorrectamente, el término de cromatografia en columna


suele aplicarse a la cromatografia liquida para distinguirla de la cromatografia plana ya que, obviamente
la cromatografia de gases solo puede realizarse en columna.

Cromatografia plana: La fase estacionaria esta colocada en una superficie plana que en realidad es
tridimensional, aunque una de sus dimensiones es muy reducida, por lo que puede considerarse
bidimendional. Se divide en dos tipos generales:

 Cromatografia en papel: en la que el papel actúa como soporte de la fase estacionaria


(cromatografia de partición).
Es un proceso muy utilizado en los laboratorios para realizar análisis cualitativos ya que pese a
no ser una técnica muy potente no requiere de ningún tipo de equipamiento.
La fase estacionaria está constituida simplemente por una tira de papel de filtro. La muestra se
deposita en un extremo colocando pequeñas gotas de la solución y evaporando el disolvente.
Luego el disolvente empleado como fase móvil se hace ascender por capilaridad. Esto es, se
coloca la tira de papel verticalmente y con la muestra del lado de abajo dentro de un recipiente
que contiene fase móvil en el fondo.
Después de unos minutos cuando el disolvente deja de ascender o ha llegado al extremo se retira
el papel y seca. Si el disolvente elegido fue adecuado y las sustancias tienen color propio se
verán las manchas de distinto color separadas. Cuando los componentes no tienen color propio el
papel se somete a procesos de revelado.
Hay varios factores de los cuales depende una cromatografía eficaz: la elección del disolvente y
la del papel de filtro.

 Cromatografia en capa fina: en la que un sólido actúa como fase estacionaria (cromatografia de
partición), se extiende en una capa delgada sobre una placa, generalmente de vidrio.

La separación de mezclas de moléculas mediante la cromatografía de capa fina se basa en el


principio del reparto entre dos fases.En general, una cromatografía se realiza permitiendo que la
mezcla de moléculas que se desea separar (muestra) interaccione con un medio o matriz de
soporte que se denomina fase estacionaria. Un segundo medio(la fase móvil) que es inmiscible
con la fase estacionaria se hace fluir a través de ésta para "lavar"(eluír) a las moléculas en la
muestra. Debido a que las distintas moléculas en la muestra presentan diferente coeficiente de
reparto, la fase móvil "lavará" a los distintos componentes con diferente eficiencia, de modo que
aquellos que "prefieren disolverse" en la fase móvil serán eluídos más rápido que los que sean
preferencialmente solubles en la fase estacionaria. En la cromatografía de capa fina, la fase
estacionaria es una delgada capa de un soporte sólido granulado, tal como gel de sílica, alumina,
ácido silícico u otros, que se depositan sobre una placa de vidrio, aluminio u otro soporte inerte.
Para que adquiera firmeza y no se desmorone, la capa de fase estacionaria se aglutina con una
pequeña cantidad de sulfato de calcio u otro agente cementante. Las muestras se aplican
añadiendo pequeñas gotas de solución en un pequeño círculo cerca del extremo inferior de la
placa. La gota se deja secar y si se desea poner más muestra se pueden aplicar más gotas,
cuidando de que la mancha no se haga demasiado grande. La placa seca se sumerge en un
pequeño volumen de fase móvil (mezcla de solventes). La polaridad de la mezcla de solventes se
elige de acuerdo a la mezcla de compuestos que se desea separar. En cromatografía de capa fina
la fase estacionaria está hidratada, por lo que se le considera como la fase polar. Como sólo la
base de la placa queda sumergida, el solvente comienza a mojar la fase estacionaria y asciende
por capilaridad. Al recorrer la placa la fase móvil va arrastrando a las substancias apolares y
aquellas más polares son retenidas por la fase estacionario dando lugar a la separación. La placa
desarrollada se deja secar y se revela con un reactivo que tiña a las substancias de interés. La
movilidad relativa o Rf es la relación entre la distancia recorrida por la mancha de un compuesto,
dividida por la distancia recorrida por el frente de solvente al momento de sacar la placa del
solvente. La técnica de cromatografía en capa fina (TLC), entre otras cosas permite:

∼Determinar el grado de pureza de un compuesto

∼Comparar muestras

∼Realizar el seguimiento de una reacción

∼Controlar el contenido de las fracciones obtenidas en cromatografía de columna.

El flujo de la fase móvil puede conseguirse de dos formas: 1) por capilaridad (cromatografia horizontal y
ascendente) y 2) por capilaridad y gravedad (cromatografia descendente). En la cromatografia plana
queda excluido el uso de un gas como fase móvil, por lo que ésta siempre es líquida.

2. Cromatografia plana:
La cromatografia plana es un tipo de cromatografia liquida en la que la fase estacionaria esta extendida
sobre la superficie de un plano y la fase móvil fluye a través de ella. La fase móvil siempre es un liquido,
mientras que la fase estacionaria puede ser un liquidosoportedo en un sólido (cromatografia de particion)
o un sólido sorbente (cromatografia de adsorción, cambio ionico o exclusión). El flujo de la fase móvil se
produce:

o Por capilaridad (cromatografia horizontal y ascendente)

o Por capilaridad y gravedad (cromatografia descendente)

Esta clase de cromatografia es considerada la más simple de todas las técnicas cromatograficas. La
diferencia principal con la cromatografia en columna es de tipo técnico, es decir, difieren en la forma de
soportar la fase estacionaria. En lo que se refiere al fenómeno en que se fundamenta la separación, es el
mismo para ambas técnicas

En la cromatografía plana, la disolución de la muestra a separar se sitúa sobre el plano que contiene la
fase estacionaria en forma de mancha, o a veces de banda, a corta distancia de uno de los extremos de
dicho plano. Una vez seca la mancha o banda, el extremo del plano próximo a la misma se pone en
contacto con la fase móvil, manteniendo todo el sistema cromatográfico en una cámara cerrada. La
separación se produce por migración diferencial de los componentes de la muestra en la dirección en que
se mueve la fase móvil.

Generalmente, a diferencia de la cromatografía en columna, en cromatografía plana el analito no


abandona el lecho cromatográfico, de forma que el proceso se detiene cuando la fase movil ha alcanzado
una determinada zona del plano.

Cabe distinguir dos tipos de cromatografia plana: En papel (CP) y en capa fina (CCF).

La cromatografía en papel tuvo su máximo desarrollo en, os años cincuenta per en la actualidad se
encuentra practicamante eclipsada debido a la mayor rapidez, eficacia y versatilidad de la cromatografía
en capa fina. Aproximadamente solo el 4% de las publicaciones sobre las distintas técnicas
cromatográficas se dedican a la cromatografía en papel. En esta técnica, la celulosa actúa como soporte de
la fase estacionaria que suele ser agua (cromatografia de partición). No obstante, también existen en el
comercio papeles impregnados (v.i. como gel de sílice o alúmina, con silicona para separaciones en fase
invertida, con cambiadores ionicos) o tratadas químicamente (v.i. grupos cambiadores incorporados al
esqueleto polimérico de la celulosa), que amplían la aplicabilidad de esta técnica.

En cromatografía en capa fina, un sólido, sorbente o soporte de la fase estacionaria, se extiende en


forma de capa sobre el plano de una superficie rígida, normalmente una capa de vidrio o polietileno, de
forma que la fase móvil fluye a través del mismo. Dependiendo de las características del sólido utilizado,
la cromatografía será de partición, adsorción, cambio ionico o exclusión.

3. Cromatografía de gases

Es una técnica cromatográfica en la que la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una


columna cromatográfica. La elución se produce por el flujo de una fase móvil de gas inerte. A
diferencia de los otros tipos de  cromatografía, la fase móvil no interactúa con las moléculas
del analito; su única función es la de transportar el analito a través de la columna.

Existen dos tipos de cromatografía de gases (GC): la cromatografía gas-sólido (GSC) y la


cromatografía gas-líquido (GLC), siendo esta última la que se utiliza más ampliamente, y que se
puede llamar simplemente cromatografía de gases (GC). En la GSC la fase estacionaria es sólida y la
retención de los analitos en ella se produce mediante el proceso de  adsorción. Precisamente este
proceso de adsorción, que no es lineal, es el que ha provocado que este tipo de cromatografía tenga
aplicación limitada, ya que la retención del analito sobre la superficie es semipermanente y se
obtienen picos de elución con colas. Su única aplicación es la separación de especies gaseosas de
bajo peso molecular. La GLC utiliza como fase estacionaria moléculas de líquido inmovilizadas
sobre la superficie de un sólido inerte.

La GC se lleva a cabo en un cromatógrafo de gases. Éste consta de diversos componentes como el


gas portador, el sistema de inyección de muestra, la columna (generalmente dentro de un horno), y el
detector.

4. Cromatografía de alta perfomance (HPLC)

La cromatografía líquida “clásica” se lleva a cabo en una columna generalmente de vidrio, la cual
está rellena con la fase fija. Luego de sembrar la muestra en la parte superior, se hace fluir la fase
móvil a través de la columna por efecto de la gravedad.

Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamaño de las partículas de fase fija se
fue disminuyendo hasta el tamaño de los micrones, lo cual generó la necesidad de utilizar altas
presiones para lograr que fluya la fase móvil. De esta manera, nació la técnica de cromatografía
líquida de alta resolución (HPLC), que requiere de instrumental especial que permita trabajar con las
altas presiones requeridas.

5. Cromatografía en fluidos supercríticos


La cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) es una técnica híbrida entre la cromatografía de
gases (GC) y la HPLC, que combina lo mejor de ambas técnicas. Esta técnica es importante porque
permite la separación de mezclas en las que no es adecuada la aplicación de la GC ni de la HPLC. En
concreto, se aplica a compuestos no volátiles o térmicamente inestables que no pueden ser separados
mediante GC, o aquellos que contienen grupos funcionales que imposibilitan su detección en HPLC.

CONCLUSIONES:
 Se concluye sabiendo que por medio de la cromatografía es posible identificar de que
sustancias está compuesta una mezcla.

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