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UNIDAD No 2: TÉCNICAS DEL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA CLÍNICA

(II): CROMATOGRAFÍA, ESPECTROFOTOMETRÍA DE MASAS,


OSMOMETRÍA Y TÉCNICAS ELECTROQUÍMICAS

1.- CROMATOGRAFÍA

1.1.- ¿QUÉ ES LA CROMATOGRAFÍA?

La cromatografía es un conjunto de técnicas de separación de sustancias que se basan en la


diferente capacidad de migración de los componentes de una muestra para ser arrastrados por una
fase móvil (constituida por un eluyente) en su desplazamiento a través de una fase estacionaria
(constituida por un material poroso).
Es un proceso físico en el que los componentes de una mezcla se separan por la distribución
diferente entre una fase móvil y una fase estacionaria. Para ello, la muestra que se desea separar
se disuelve en la fase móvil que puede ser un gas o un líquido. Durante el proceso cromatográfico
se hace pasar la fase móvil a través de una fase estacionaria, la cual se mantiene fija en una
columna o en una superficie sólida que actúa como soporte.
Las dos fases -móvil y estacionaria- se eligen de tal forma que los componentes de la muestra se
distribuyan de forma distinta entre ambas. Aquellos componentes que son fuertemente retenidos
por la fase estacionaria, se mueven lentamente con el flujo debido a la fase móvil. En cambio,
aquellos componentes de la muestra que tienen una reducida afinidad por la fase estacionaria, se
desplazan con una mayor rapidez al ser arrastrados por la fase móvil.
En consecuencia, la cromatografía separa las sustancias componentes de una mezcla o muestra
según su diferente afinidad por alguna de las dos fases: por la fase móvil o por la fase estacionaria.
Por tanto, esta técnica permite obtener por separado sustancias que normalmente se hallan
mezcladas en el seno de una disolución, identificándolas cualitativamente y, después de este
proceso, aquéllas que nos interesen las podremos someter a otros procedimientos que nos
permitirán conocer su concentración (cuantificación).

1.2.- COMPONENTES BÁSICOS DE LA TÉCNICA CROMATOGRÁFICA.

Los componentes básicos de la cromatografía son la muestra, la fase móvil y la fase estacionaria.
• Muestra. Es la mezcla que se pretende cromatografiar.
• Fase móvil. Está formada por el eluyente que se desplaza a través de la fase estacionaria
arrastrando los componentes de la muestra. El eluyente suele ser un disolvente, o mezcla de
disolventes, en el cual se ha disuelto la muestra y su función es ayudar a movilizar la muestra y a
separar sus componentes. Puede ser un líquido o un gas y su polaridad es variable, pueden ser
acuosos (agua, etanol, propanol, mezcla de alcoholes) o hidrófobos (acetonitrilo, cloroformo,
ciclohexano, tetracloruro de carbono).
• Fase estacionaria. Forma la parte fija del sistema. Esta fase retrasa, de forma diferencial, el
movimiento de los diferentes componentes de la fase móvil; es decir, algunos componentes
quedarán más retenidos que otros en esta fase estacionaria de forma que se irán separando unos
de otros en su desplazamiento. La fase estacionaria puede ser un sólido (como, por ejemplo, un
soporte de papel), o un líquido soportado en un sólido o en un gel. También puede ser una
columna de vidrio o de plástico de dimensiones variables y repletas de una resina o matriz sobre la
cual se moverá en el tiempo la fase móvil
Figura 1

Figura 2
1.3.- CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
Las separaciones cromatográficas pueden clasificarse atendiendo a tres criterios clasificadores:
según el método de contacto entre las fases móvil y estacionaria, según el estado físico de estas
fases y según los mecanismos físicos de separación.

- Según el método de contacto (o forma en que las fases -móvil y estacionaria- se ponen en
contacto), la cromatografía puede ser:
Cromatografía plana. La fase estacionaria se mantiene sobre una placa lisa (de vidrio, metal o
plástico), o impregnando un soporte plano de papel. Durante el proceso cromatográfico la fase
estacionaria se pone en contacto con la fase móvil y ésta se desplaza a través de ella por
capilaridad o por gravedad.
Cromatografía en columna. La fase estacionaria se encuentra en el interior de un tubo -
normalmente de fino calibre- a través del cual se hace pasar la fase móvil mediante presión o
simplemente por acción de la gravedad.

- En función del estado físico de las fases móvil y estacionaria, puede distinguirse
entre: Cromatografía de líquidos. Se puede realizar sobre soporte plano o sobre
columnas. Cromatografía de gases. Siempre se lleva a cabo en columnas.

- Según los mecanismos físicos de separación, la cromatografía se divide en:


Cromatografía de adsorción.
Cromatografía de reparto o partición.
Cromatografía de cambio de ión o intercambio iónico.
Cromatografía de exclusión molecular, penetrabilidad o filtración en geles.
Cromatografía de afinidad o de bioespecificidad.

En algunos métodos cromatográficos de separación coexisten dos o más tipos de mecanismos.

- ESQUEMA DE LOS TIPOS DE CROMATOGRAFÍA SEGÚN LA NATURALEZA DE LAS FASES


MÓVIL Y ESTACIONARIA, Y DE LOS MECANISMOS DE SEPARACIÓN QUE SE UTILIZAN.

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA CROMATOGRAFÍA GASEOSA

(Fase móvil líquida) (Fase móvil gaseosa)

Fase estacionaria Fase estacionaria Fase estacionaria Fase estacionaria sólida


sólida líquida líquida
Líquido/Sólido Líquido/Líquido Gas/Líquido Gas/Sólido

Mecanismos Mecanismo Mecanismo Mecanismo

Interc. Iónico (L/S)


Adsorción (L/S) Afinidad (L/S)
Exclusión molecular (L/S) Partición (L/L) Adsorción (G/L) Partición (G/S)

Adsorción: un proceso por el cual átomos, iones o moléculas son atrapados o retenidos en la superficie de un material.
Elución: extracción mediante un líquido apropiado de una sustancia del medio sólido que la ha absorbido.
1.4.- TIPOS DE CROMATOGRAFÍA SEGÚN EL MECANISMO DE SEPARACIÓN

Según el mecanismo de separación pueden ser: de adsorción, de reparto o partición, de exclusión


molecular, penetrabilidad o filtración en geles, de intercambio iónico y de afinidad.

1.4.1.- CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN

La separación de sustancias está basada en las interacciones que se producen entre las moléculas
del soluto y de la fase móvil con las moléculas de la fase sólida estacionaria. Estas interacciones
pueden ser de tipo electrostático, puentes de hidrógeno o fuerzas de van der Waals.
La fase móvil puede ser un líquido o un gas, mientras que la fase estacionaria es siempre un
sólido. Es un fenómeno de superficie que se manifiesta por el aumento de la concentración del
soluto en la interfase que rodea a la fase estacionaria, sobre la superficie del sólido o adsorbente.
La adsorción está basada en la diferencia de polaridad entre las moléculas de la mezcla y el
adsorbente. Los compuestos con mayor afinidad por el adsorbente serán retenidos con mayor
fuerza y se desplazarán poco respecto al punto inicial de referencia donde es colocada la muestra,
mientras que los compuestos adsorbidos con menor intensidad se desplazarán a mayor distancia,
ocupando cada sustancia una posición bien definida y bien separada de las demás.
Como sustancias adsorbentes podemos citar, entre otras, el teflón (no polar), el gel de sílice
(ácido), el óxido de aluminio o alúmina (básico) y el carbonato cálcico (básico).

Figura 3. Cromatografía de adsorción

Figura 4

1.4.2.- DE REPARTO O PARTICIÓN.

En la cromatografía de reparto se produce la separación de una mezcla de solutos por la


diferente distribución de las moléculas de estos entre una fase estacionaria líquida, soportada
sobre un sólido, y una fase móvil o eluyente del sistema, que puede ser un líquido o un gas. Ambas
fases deben ser inmiscibles entre sí, una fase es orgánica y otra fase es acuosa, por lo que este
método se relaciona con la solubilidad de esas sustancias en los diferentes líquidos o gases.
Además, tiene la particularidad de que la sustancia no permanece en la superficie, como en el caso
de la cromatografía de adsorción, sino que llega hasta el interior de la fase estacionaria. Por tanto,
se produce en profundidad. Puede realizarse en papel, en capa fina o en columna.

Los materiales empleados como fase estacionaria son el almidón y la celulosa con un líquido como
el agua o el amoníaco. Como fase móvil se emplea normalmente un líquido, por supuesto no
miscible con el primero, tal como el butanol, el benceno y otros.
Figura 5.
Cromatografía de
reparto o partición

1.4.3.- DE EXCLUSIÓN MOLECULAR, PENETRABILIDAD O FILTRACIÓN EN GELES

La cromatografía de exclusión molecular, también llamada de filtración en geles o de


penetrabilidad, se basa en la diferencia molecular existente entre las sustancias a separar en
cuanto a su tamaño y forma, así como del tamaño de los geles utilizados.
La fase móvil es un líquido, como el agua o una solución electrolítica.
La fase estacionaria consiste en esferas de un gel polímero anhidro o dextrano que presenta poros
de tamaño variable en función de los componentes que se quieran separar. Además, es muy
hidrófilo, con lo cual se hincha cuando se sumerge en soluciones acuosas o en soluciones
electrolíticas. Los principales geles que se utilizan en la cromatografía de exclusión son de
dextrano, agarosa y poliacrilamida Los nombres comerciales de los geles más usados son
Sephadex®, Sepharosa®, Sephacryl® y Biogel®. Estas esferas de gel se disponen formando un
entramado o red que crea a su través unos canales o poros por los que sólo caben los
componentes de menor tamaño que el poro.
Una vez introducidas las sustancias en los geles, las moléculas mayores que los poros del gel
pasan por fuera de las moléculas del gel sin ser retenidas. En cambio, las moléculas menores que
los poros penetran en estos, quedando retenidas por el gel, por lo que tardarán más en salir de él y
eluirán o saldrán más tarde por el extremo de salida de la columna.
Esta cromatografía se realiza en columna y la elución o salida de las sustancias es independiente
del eluyente o fase móvil utilizada, de su pH y de su fuerza iónica y, como se ha indicado, sólo está
en función de la forma y del tamaño de las sustancias y de los poros del gel.

El mecanismo de separación de este tipo de cromatografía se representa en las figuras 6 y 7. La


muestra se aplica sobre el lecho del gel y, al pasar a través de la columna, las moléculas mayores
que el diámetro máximo de los poros de los geles pasan por los espacios que dejan entre sí los
poros del gel y salen pronto. En cambio, las moléculas menores quedan retenidas en los poros.
Cuanto menores sean las moléculas, más tardarán en salir de la red porosa y, por tanto, saldrán de
la columna más tarde. De este modo, en la cromatografía de exclusión la elución se produce en
orden decreciente de tamaño molecular.

Las aplicaciones de la cromatografía de exclusión se basan fundamentalmente en separar


sustancias de peso molecular elevado, como péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, polisacáridos,
etc. En los laboratorios clínicos, esta cromatografía se usa para purificar en técnicas hormonales.
Figura 6

Figura 7

1.4.4.- DE INTERCAMBIO IÓNICO O CAMBIO DE IÓN

La cromatografía de cambio de ión o de intercambio iónico es conocida por las siglas IEC (Ion
Exchange Chromatography). El principio básico se apoya en que las moléculas de soluto llevan
iones intercambiables con otros iones, situados en las fases estacionaria y móvil y con afinidad
distinta por cada una de ellas. Por tanto, las sustancias se separan debido a las interacciones que
se producen entre los grupos ionizables de los compuestos que quieren separase y los grupos
cargados unidos a un soporte sólido inerte.
La presencia de grupos funcionales cargados eléctricamente es la propiedad fundamental del
intercambiador iónico, también llamados cambiadores o resinas. Pueden ser de intercambio
aniónico (separan aniones) o de intercambio catiónico (separan cationes).
Este tipo de cromatografía se suele realizar en columnas en las que se encuentra empaquetada la
fase sólida estacionaria que es la resina de intercambio iónico. La fase móvil es un líquido. Una de
las aplicaciones de las resinas de intercambio iónico es la preparación de agua desionizada.

Figura 8

El mecanismo por el que se produce la separación en la cromatografía de cambio de ión es la


unión reversible de los compuestos a separar con los cambiadores o resinas de intercambio iónico.
Las dos etapas de las que consta el proceso son las siguientes:
1º.- Se aplica la muestra (con los compuestos que se quiere separar) sobre la columna que
contiene el cambiador (fase estacionaria). Las sustancias quedan más o menos retenidas
dependiendo de la interacción de sus grupos ionizables con los cambiadores presentes en la fase
fija de la columna. Las sustancias que no se han fijado o lo han hecho muy débilmente pueden
limpiarse o separarse del resto del intercambiador iónico mediante la aplicación de un tampón de
pH adecuado, o cambiando la fuerza iónica del intercambiador, o bien añadiendo algún metabolito.
2º.- Las sustancias separadas y retenidas se liberan de la unión con el cambiador y salen de la
columna.
3º.- Se regenera la columna pasando contraiones del cambiador, para que pueda usarse de nuevo.

Existen dos tipos de cromatografía de intercambio iónico.

- Cromatografía de intercambio aniónico. Fija aniones y, por tanto, la resina debe estar cargada
positivamente, como por ejemplo, la DEAE (dietil amino etil-celulosa). Los componentes con carga
positiva se eluirán y los de carga negativa quedarán fijados. Para recuperarlos, se hace pasar a su
través una solución ácida diluida, como, por ejemplo, el HCl 0,001 N o tampón citrato. Si la
sustancia que se quiere separar tiene carga positiva, la recuperaremos a la salida de la columna en
un recipiente adecuado, regenerando al mismo tiempo la columna para un nuevo uso.

- Cromatografía de intercambio catiónico. Fija cationes (iones de carga positiva), por lo que la
resina debe estar cargada negativamente, como la CM (carboximetil-celulosa). Los componentes
con carga negativa se eluirán y los de carga positiva quedarán fijados. Para recuperarlos se hace
pasar a su través una disolución básica diluida, como NaOH 0,001 N o tampón TRIS. Una
sustancia de carga negativa será recuperada a la salida de la columna en un recipiente adecuado,
regenerando al mismo tiempo la columna que quedará lista para un nuevo uso.
HCl

Figura 9

NaOH

Figura 10

1.4.5.- DE AFINIDAD.

La cromatografía de afinidad se utiliza para separar las sustancias con interacciones biológicas
muy específicas, y se basan en mecanismos que implican la afinidad entre dos elementos, como,
por ejemplo, las uniones enzima-sustrato, hormona-receptor, antígeno-anticuerpo, entre otras.
En este tipo de cromatografía, el compuesto que quiere separarse se une con un adsorbente que
lleva una sustancia llamada aquí ligando, que interacciona bioespecíficamente con un componente
de la superficie del compuesto a separar. Generalmente, el ligando está contenido en una columna
cromatográfica, aunque también puede encontrarse en disolución. Por tanto, la fase estacionaria es
un sólido que contiene unido el ligando y la fase móvil es un líquido que atraviesa la fase
estacionaria transportando la muestra con la sustancia a determinar.
Para realizar la cromatografía se añade la fase móvil y la mezcla que contiene la sustancia que se
desea separar. Cuando transcurre a través de la fase estacionaria la fase móvil con los productos a
separar, aquellos que presenten afinidad por el ligando de la fase estacionaria quedarán unidos a
este y retenidos en la columna. El resto de las sustancias no afines al ligando no serán retenidos
en la columna. Luego, se consigue la elución de los productos retenidos añadiendo pasando un
ligando distinto al anclado en la columna por el que la sustancia tenga mayor afinidad, o bien
cambiando las condiciones físico-químicas (pH, fuerza iónica) de la fase móvil.
No se requiere un equipo demasiado complicado ni caro y el tipo de adsorbente se puede utilizar
repetidas veces. Las aplicaciones más usadas de la cromatografía de afinidad en los laboratorios
de bioquímica clínica son la separación de la hemoglobina glicosilada y de las catecolaminas,

Figura 11

Figura 12
1.5.- TIPOS DE CROMATOGRAFÍA SEGÚN EL MÉTODO DE CONTACTO ENTRE LAS FASES

1.5.1.- CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA


Los métodos en columna se emplean para varios tipos de cromatografía: tanto para cromatografía
líquida como para cromatografía gaseosa, y tanto con fases estacionarias líquidas como sólidas.
Dependiendo de la naturaleza de las fases, los mecanismos en función de los cuales se produce la
separación son de dos tipos: adsorción, cuando la fase estacionaria es sólida, y partición, cuando
la fase estacionaria es líquida.

En la cromatografía en columna, la fase estacionaria está formada por una columna de vidrio
(similar a una bureta) que se encuentra rellena de gel de sílice, óxido de magnesio, óxido de
aluminio, arena u otro material poroso. La muestra es colocada en la parte superior de la columna.
Las sucesivas adiciones de fase móvil (eluyente) hacen descender por la columna las moléculas de
la muestra, permitiendo su separación.
Los componentes de la mezcla saldrán de la columna ordenadamente en función de la retención
que ejerza sobre ellos la fase estacionaria, saliendo primero los que queden menos retenidos y
desciendan más rápidamente, lo que depende de factores como su polaridad, su masa molecular,
etc. Las diferentes fracciones individuales que van saliendo por la apertura inferior de la columna
se recogen individualmente en tubos separados y son detectadas por un detector.

Figura 13
- Procedimiento de separación cromatográfica en columna.
Consideremos que pretendemos lograr la separación de dos elementos (1 y 2) de una disolución.
El tubo contiene la fase estacionaria así como también una pequeña porción de espacio adicional
en su extremo superior que permanece vacío y que se destina a contener la fase móvil. El
instrumento tiene una llave de paso en su extremo inferior que permite la regulación del flujo de
fase móvil que se desliza a lo largo y por el interior del tubo. La fase estacionaria pueden ser
sustancias adsorbentes como el silica-gel o la alumina. La fase móvil suele ser algún tipo de
eluyente que disuelve a la muestra sin reaccionar con ella. Los pasos del procedimiento son:
1º. Antes de adicionar la muestra, se abre la llave de paso, por poco tiempo, para que un pequeño
volumen de fase móvil, que se coloca previamente en el extremo superior, drene por la columna.
2º. Se disuelve la muestra en un volumen mínimo de fase móvil y se deposita en el extremo
superior de la columna.
3º. Se abre de nuevo, brevemente, la llave de paso, consiguiendo que la pequeña porción de fase
móvil que contiene la muestra se deslice a lo largo de la columna. En este momento, el soluto
(elementos 1 y 2 de la muestra) se distribuye ya entre la fase estacionaria (adsorbente) y la
solución compuesta por la fase móvil y la muestra, en unas proporciones determinadas.
Supongamos que el componente 2 se adsorbe con mayor fuerza que el componente 1.
4º.- Se añade un cierto volumen de fase móvil a la columna que actúa como eluyente. Se abre de
nuevo la llave de paso manteniendo un flujo constante a lo largo de la columna (en mL/minuto).
5º.- Las diferentes fracciones individuales que van saliendo de la columna van siendo detectadas
(mediante un sistema de detección adecuado), o recogidas independientemente.
Manteniendo constante el flujo, se puede analizar cada gota que emerja por el extremo inferior
de la columna y comprobar si contiene soluto, utilizando unos detectores electrónicos especiales
que emiten una señal de salida, de intensidad proporcional a la cantidad de soluto detectado.

Figura 14

Mediante los detectores se obtiene una gráfica llamada cromatograma, donde aparecen una serie
de picos que se corresponden con los tiempos de retención, que son los tiempos que ha tardado en
eluir cada componente de la muestra. El tiempo de retención es característico de cada sustancia,
por lo que se usa para su identificación (análisis cualitativo) y para su cuantificación (análisis
cuantitativo).
RECUERDA: El tiempo de retención ( tR) es el tiempo que transcurre desde que se inyecta la
muestra en la columna hasta que un determinado soluto sale eluido y alcanza el detector
produciendo el pico cromatográfico. Cada elemento tiene su propio y característico tiempo de
retención (tr1, tr2, tr3, tr4…) en condiciones fijas de trabajo.

-Cromatogramas obtenidos mediante las cromatografías en columna


El cromatograma es el gráfico de la separación cromatográfica. Representa la concentración de
cada componente respecto a su tiempo de retención (tR), que es el tiempo que cada componente
tarda en salir de la columna. Por tanto, cuanto mayor sea el t R de un componente, más afinidad
tendrá por la fase estacionaria y menos por la fase móvil. En los cromatogramas el primer
componente en salir de la columna suele ser la misma fase móvil. El pico más elevado indica que
que ese componente es más abundante (tiene mayor concentración) en la muestra.
La señal recogida por el detector puede representarse en función del tiempo (detectores
diferenciales) o del volumen de acúmulo de los componentes de la mezcla que han salido hasta
ese momento (detectores integrales).
A. Detector diferencial. Sólo emite respuesta cuando la fase móvil que pasa a través de él lleva
consigo algún componente de la mezcla. La respuesta que emite será proporcional a la
concentración de la sustancia separada. Cuando ésta ha pasado, el detector vuelve a situarse a la
altura inicial hasta que llega otra sustancia.

Figura 15

Para hacer un análisis cuantitativo de los resultados de la cromatografía se calculará el área


total y las áreas parciales de cada pico. La relación entre ambas será proporcional a la masa de la
sustancia separada. Para determinar el área podremos optar por una de las dos formas que se
describen a continuación:
- Suponiendo que el pico sea parecido a un triángulo, su área será: ½ x base x altura
- Si se considera al pico como si fuese un rectángulo, cuya anchura corresponda a la anchura de
la mitad de la altura del pico, el área del pico será el producto de la anchura por la altura del pico.
Figura 16

Un proceso de separación cromatográfica será más efectivo cuanto más separadas aparezcan
unas bandas de otras. La utilización de columnas de desarrollo suficientemente largas incrementa
el grado de resolución cromatográfica. Además, las muestras deben ser y de pequeño volumen y
suministradas rápidamente, lo que evita que las bandas se ensanchen y disminuya la resolución.
B. Detector integral. Su respuesta es proporcional a la masa total de la sustancia que queda
incorporada a la fase móvil, mientras que cuando la fase móvil es pura, aparece una línea
horizontal. De esta forma, el desnivel m2 – m1 es proporcional al total de la masa de la sustancia
componente que ha sido eliminada en el intervalo t2 – t1 , por lo que nos proporcionará un valor de
la masa de esta sustancia respecto a la masa total de la muestra. Cada escalón de la gráfica
corresponderá a una sustancia separada y sus respectivas alturas serán equivalentes a la
proporción de masa de cada una de ellas respecto a la masa total de la muestra.

Figura 17

En la actualidad se usan dos técnicas de separación en columna: la cromatografía de gases y la


cromatografía líquida de alta resolución.
1.5.1.1.- CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
Hasta hace unos años, la separación en columna se hacía usando el flujo gravitatorio como fuerza
impulsora de la fase móvil, lo que exigía tiempos de separación largos que solían durar varias
horas. La construcción de sistemas impulsores de la fase móvil con mucha presión y la obtención
de rellenos de las columnas cuya actuación es muy eficaz han permitido tiempos cortos de
separación y una gran selectividad. La cromatografía que emplea estos métodos se denomina
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC o High Performance Liquid Chromatography).
Esta cromatografía separa, identifica y cuantifica los componentes de la muestra. Se realiza en un
cromatógrafo HLPC que consta de una columna capilar de longitud variable rellena de una silicona
que se encuentra en el interior de un horno a una temperatura determinada. La fase estacionaria
está unida a las paredes del tubo y las partículas de la sustancia que la forman suelen ser de muy
pequeño tamaño (unos pocos mm). La muestra atraviesa la columna bajo condiciones de elevada
presión ejercida por bombas. La fase móvil está constituida por un líquido transportador que puede
ser una sustancia (etanol, acetato de etilo, tetracloruro de carbono, éter dietílico, tolueno) o
mezclas de dos sustancias en proporciones variables. Las mezclas más empleadas son: metanol-
tampón fosfato, agua-metanol, agua-acetonitrilo, agua-tetrahidrofurano y hexano-isopropanol.
El funcionamiento básico de la cromatografía HPLC es el siguiente: una vez inyectada la fase
móvil con una jeringa especial, arrastra a la muestra por toda la columna, a la salida de la cual hay
un colector de fracciones que es un tambor giratorio con recipientes en los que se recogen los
componentes separados. Este colector se mueve a las órdenes del detector, que está conectado a
un ordenador, de forma que todo el proceso de separación queda recogido en un cromatograma.
Las ventajas del uso de la cromatografía HLPC son muy numerosas y las principales son:
 Tienen una elevada sensibilidad.
 Proporciona determinaciones cuantitativas exactas.
 Es muy útil para separar sustancias no volátiles, o termolábiles.
 La muestra se introduce automáticamente en el cromatógrafo.
 Se requiere un volumen de muestra muy pequeño.
 Las columnas empleadas se pueden usar muchas veces.
 Es muy rápida y se obtienen los resultados en muy poco tiempo.

Las aplicaciones de la cromatografía de líquidos de alta resolución en los laboratorios


clínicos:
 Separación de aminoácidos y proteínas, ácidos nucleicos, glúcidos, terpenoides,
catecolaminas y hemoglobina, para detectarlos en muestras humanas (sangre, orina,…)
 Confirmación de drogas: derivados del cannabis, drogas depresoras como los barbitúricos
o benzodiacepinas, alucinógenos como LSD y fenciclidina, alcohol, etc.
 Monitorización de fármacos como medicamentos cardíacos, antiasmáticos, antiepilépticos,
antineoplásicos, inmunosupresores y analgésicos.
 Estudio de los aminoácidos presentes en la sangre para determinar enfermedades
relacionadas con el exceso o defecto de estas sustancias.
Los componentes básicos de un cromatógrafo de líquidos de alta resolución son:
 Reservorio de fase móvil.
 Bomba impulsora.
 Formador de gradiente (no es indispensable).
 Sistema inyector de la muestra.
 Precolumna.
 Columna.
 Detector.
 Procesador de datos.
 Registro-integrador
1.- Reservorios de fase móvil. Tienen un filtro que separa las impurezas que pueda contener
la fase móvil al estar almacenada en su recipiente de reserva. Algunos modelos tienen un
mecanismo que permite cambiar o mezclar el tipo de fase móvil cuando se desee, para lo cual
deberán estar provistos de varios recipientes de reserva que contengan las diferentes clases
de eluyentes. Estos recipientes tendrán que estar unidos al sistema central del instrumento
mediante una válvula de mezcla proporcional que permita el cierre total o parcial del suministro
de uno de ellos y la apertura del otro.

2.- Bombas impulsoras. Es la parte más sensible del cromatógrafo. Estas bombas pueden actuar
de modo isocrático (la composición de la fase móvil permanece constante durante todo el proceso)
o de modo gradiente (va cambiando durante la cromatografía) . Las válvulas del instrumento deben
ser resistentes a la alta presión empleada. Además, tanto la bomba como los demás elementos
(recipientes, tuberías, etc.), deben estar construidos de acero inoxidable para que sean inertes con
la fase móvil.

3.- Sistemas inyectores de muestra. La presión de trabajo de la cromatografía líquida es tan alta
que hay que utilizar inyectores de bucle. En la posición de carga, el bucle de la muestra está
aislado de la fase móvil y está abierto a la atmósfera. Con una jeringa cuya capacidad es varias
veces mayor que la del bucle, se coloca la muestra en este. Cualquier cantidad que sobre saldrá
por la línea de desecho. Tras cargar la muestra, se gira el inyector a la posición de inyección, en la
que la fase móvil se dirige a lo largo del bucle y la muestra es arrastrada a la columna.
4.- Formadores de gradientes. Los HPLC pueden utilizar fases móviles cuya composición varía
continuamente (gradiente). Este mecanismo permite cambiar automáticamente las proporciones del
eluyente.
5.- Precolumnas y Columnas.
-Tipos de columnas. En la HLPC suele haber dos columnas: una columna analítica en la que se
produce la separación y una precolumna que se coloca delante para proteger de la contaminación.
Las principales columnas que se usan en la HPLC son de acero inoxidable y tienen un diámetro
interno de entre 0,3 y 5 mm, y una longitud entre 5 y 25 cm. Estas columnas están rellenas con
partículas de sílice porosas de 3 a 10 μm, También se emplean microcolumnas construidas con
capilares de sílice fundidos, con diámetros internos de 0,1 a 0,5 mm y con una longitud de varios
metros. La precolumna tiene el mismo material de relleno y la misma fase estacionaria que la
columna analítica, es bastante más corta y barata que esta y se cambia con frecuencia.
- Material de relleno de las columnas y fase estacionaria. Puede ser de tres tipos:
Pueden ser soportes de película (bolas de vidrio o de polímero, no porosas y esféricas en cuya
superficie se deposita una capa delgada de sílice o de una resina de intercambio iónico), soportes
rellenos de partículas microporosas (de sílice, alúmina o resinas de intercambio) y fases unidas
(el material de soporte es sílice que se hace reaccionar con un organoclorosilano)
La combinación de una fase estacionaria polar y una móvil apolar se llama cromatografía líquida
en fase normal, y es la más utilizada. En este caso, suelen usarse como fases estacionarias
líquidas el agua y el etilenglicol, y como fases móviles, el hexano, el metanol y las mezclas
hexano/isopropanol. Cuando la fase estacionaria es apolar, como un hidrocarburo, y se utilizan
como fase móvil sistemas acuosos, se denomina cromatografía líquida en fase reversa.

6.- Detectores más utilizados en cromatografía de líquidos.


-Detectores espectrofotométricos. Los más usados son los de absorción en el UV/visible, los de
infrarrojos, los de fluorescencia, los de índice de refracción y los espectrómetros de masas.
- Detectores electroquímicos y otros detectores. Los más usados son los amperímetros (miden
intensidad de corriente) y los detectores culombímetros (miden cantidad de cargas eléctricas).
Figura 18

Figuras 19 y 20: Cromatógrafos de líquidos de alta resolución (HPLC)


1.5.1.2.- CROMATOGRAFÍA DE GASES
La cromatografía de gases es una técnica que se emplea para la separación de sustancias en
estado gaseoso y de sustancias volátiles. Su fase móvil es un gas. En esta técnica, la muestra se
volatiliza y posteriormente es inyectada en una columna cromatográfica.
En función de la naturaleza de la fase estacionaria, la cromatografía de gases puede ser de dos
tipos: cromatografía gas-sólido (GSC) y cromatografía gas-líquido (GLC).

1.5.1.2.1.- CROMATOGRAFÍA DE GAS-SÓLIDO.


Necesita de una fase estacionaria sólida en la cual, mediante adsorción, son retenidos los distintos
componentes de la mezcla problema. Su aplicación -bastante limitada- se reduce a la separación
de ciertas sustancias gaseosas de bajo peso molecular.

1.5.1.2.2.- CROMATOGRAFÍA DE GAS-LÍQUIDO.


Es conocida también como Cromatografía de gases (GC). Se caracteriza por utilizar una fase
móvil gaseosa y una fase fija estacionaria líquida retenida sobre la superficie de un sólido inerte.
Como eluyente para movilizar la muestra se ha de utilizar o bien un gas inerte (gases nobles), o
bien otro tipo de gases como nitrógeno o hidrógeno, es decir, un tipo de gas que no interaccione
con los componentes de la muestra que se quiere analizar. La muestra también ha de estar en
estado gaseoso por lo que debe poder vaporizarse a una temperatura de unos 450 ºC y ser, por
tanto, termorresistente. El mecanismo físico en el que se basa es el de reparto o partición.
- Aplicaciones de la cromatografía de gases.

 Estudio de la pureza de los reactivos empleados para los análisis químicos y clínicos.
 Análisis de muestras volatilizables: mezclas de alcoholes, perfumes, aromas, esencias, etc.
 Detección de fármacos en muestras biológicas, como por ejemplo, los antiepilépticos.
 Método de confirmación de drogas de abuso. Por ejemplo, alcohol, derivados del cannabis
(marihuana y hachís), derivados del opio (morfina, heroína), cocaína y derivados (como el crack),
anfetaminas y derivados (como la metanfetamina o cristal), los ansiolíticos (como barbitúricos,
benzodiacepinas), alucinógenos (como el LSD).
 Determinación de monóxido de carbono (CO) en sangre.
 Métodos antidopaje
 Separación de sustancias esteroideas.

- Componentes básicos de un cromatógrafo de gases.


Constan, básicamente, de un mecanismo de inyección de la muestra, una entrada para el gas
eluyente y una columna cromatográfica en el interior de un horno para conseguir una temperatura
alta que mantenga la muestra en estado gaseoso. Un equipo informático controla, recoge y
procesa los datos del cromatógrafo (temperatura de la columna, caudal e inyección de la muestra,
etc.) y expresa los resultados obtenidos en forma de un gráfico. La aparición de un pico en dicho
gráfico indica la presencia de una sustancia (cualitativa) y la altura del mismo indica la cantidad de
dicha sustancia en la muestra analizada (cuantitativa). Por tanto, los componentes son:
 Sistema de suministro del gas portador.
 Sistema de inyección de la muestra.
 Columna de desarrollo o separación.
 Horno para la columna.
 Sistema de detección.
 Sistema informático registrador – integrador.
 Procesador de datos.
Figura 21

Figura 22
1.- Sistema de suministro del gas portador (fase móvil). La fase móvil está formada por un
gas, el gas portador, que debe ser químicamente inerte para que no reaccione ni con la muestra ni
con la fase estacionaria y debe estar libre de agua e impurezas. Su elección depende también del
tipo de detector utilizado en cada caso. Como gases portadores se usan gases nobles (helio, neón
y argón) nitrógeno, hidrógeno y dióxido de carbono. El gas se encuentra en una bombona que lo
suministra a presión, controlada con unos manómetros de flujo. El flujo de dicho gas es la fuerza
que arrastra y transporta los componentes de la muestra (cuando están en fase de vapor) que se
separarán a lo largo de la fase estacionaria de la columna. Mediante el fenómeno de partición o
reparto, las sustancias de la muestra serán retenidas con distinta fuerza y podrán ser separadas.
2.- Sistema de inyección de la muestra. Todos los constituyentes que se inyectan en el
cromatógrafo deben ser volátiles. Es aconsejable que la cantidad de muestra inyectada sea lo más
pequeña posible ya que la inyección lenta de muestras demasiado grandes da lugar a bandas
anchas y, por tanto, a una deficiente resolución en el proceso de separación. La muestra (líquida o
gaseosa) se introduce disuelta en un pequeño volumen de fase móvil a través de un tabique de
goma, utilizando una microjeringa aplicada en la parte inicial de la columna, que introduce
rápidamente una cantidad pequeña de muestra (de 1 a 2 μl). Cuando el volumen de muestra
requerido es muy pequeño (columna capilar) se utiliza un "divisor" que sólo deja pasar a la columna
una parte de la muestra y desecha el resto. La inserción y la inyección de la aguja en el bloque han
de hacerse lo más rápido que se pueda. Hay inyectores automáticos de la muestra que se colocan
en un carrusel, introducidos en recipientes adecuados. Según el programa que se establezca, las
muestras se inyectan cada cierto tiempo de modo secuencial. El bloque inyector se debe calentar a
una temperatura de al menos 50 ºC por encima del punto de ebullición de las sustancias a separar
en la muestra (en concreto, hay que superar el punto de ebullición del componente que lo tenga
mayor), lo cual hace que estas sustancias se separen muy rápidamente. Una vez evaporado, el
gas noble portador lo capta y transporta a la columna.

3.- Columnas de desarrollo y material de relleno (con la fase estacionaria). Pueden ser de dos
tipos: las columnas de relleno (empaquetadas) y las columnas capilares (tubulares abiertas),
que son las más usadas actualmente debido a su rapidez y eficacia. Las columnas suelen ser de
acero inoxidable, vidrio, cobre o aluminio. Las capilares pueden tener hasta 100 m de longitud y un
diámetro interno de 0,1 a 0,5 mm. Las columnas está rellenas de un soporte particulado inerte,
finamente dividido, como tierra de diatomeas, microesferas de vidrio y polímeros porosos.
Las fases estacionarias deben ser químicamente inertes, térmicamente estables, tener poca
volatilidad y una polaridad adecuada para los solutos que vayan a separarse. Los solutos apolares
se separan mejor con una fase estacionaria apolar, y los solutos polares, con una fase estacionaria
polar. Las fases estacionarias más usadas en CG son el apiezón L, el polidimetil siloxano (SE-30),
el metil fenil polisiloxano (OV-171), el trifluoropropil de metil polisiloxano y el polietilenglicol.

4.- Horno. En la CG es esencial controlar la temperatura de la columna para conseguir una buena
separación, para lo cual las columnas se alojan en un horno termostatizado. La cromatografía
puede realizarse a temperatura constante o programarse para que varíe con el tiempo (ajustando la
temperatura inicial por debajo del punto de ebullición del componente de la mezcla que lo tenga
menor). Al avanzar la separación, se aumenta la temperatura de forma lenta y uniforme o a pasos.
5.- Detector. Una vez conseguida la separación, las sustancias todavía estarán unidas a la fase
móvil, por lo que se les hace pasar por un detector que mide los cambios en las propiedades físicas
que ha sufrido la fase móvil por el hecho de estar unida a las sustancias de la muestra. Si el
detector sólo reconoce a la fase móvil, aparece una línea horizontal de base en el registro del
monitor. Cuando se detecta que la fase móvil está unida a una sustancia arrastrada de la muestra,
aparece en la pantalla un pico. La superficie o área bajo la curva (ABC) de cada pico es
proporcional a la cantidad de sustancia presente. Los detectores más utilizados son: de ionización
de llama, de captura electrónica, el espectrómetro de masas, espectrómetro de infrarrojos,
espectroscopia de emisión atómica, etc.
La CG tiene una gran sensibilidad ( permite apreciar cantidades inferiores a 0,1 μg) pero no puede
detectar las sustancias que al pasar a estado gaseoso pierden sus características físico-químicas.
Fig 23:Suministro de
gas

Fig 24: Inyectores de Fig 25: Columnas cromatográficas


muestra
portador

Figura 26

Figura 27 Figura 28
-
2.- ESPECTROMETRÍA DE MASAS
2.1.- INTRODUCCIÓN.
El espectrómetro de masas, diseñado por primera vez por Francis William Aston en 1919, fue
desarrollado para medir las masas de los isótopos. Es una técnica que se emplea desde principios
del siglo XX en el mundo de la investigación y en la industria farmacéutica y actualmente, gracias al
desarrollo tecnológico, ha adquirido mayor importancia dentro del laboratorio clínico.
La espectrometría de masas atómicas es una herramienta muy versátil y útil para identificar los
elementos presentes en una muestra y determinar las concentraciones de cada una de las
materias que la componen. En principio, el espectro de masas de cada compuesto es único y
puede ser usado como una “huella química” para caracterizar un determinado analito. Nos permite
determinar prácticamente todos los elementos del sistema periódico.
En sentido estricto no es una técnica espectrométrica, puesto que no se sirve del espectro
electromagnético, sino que el resultado que se obtiene del análisis es un espectro, entendido como
una gráfica con un conjunto de picos. Además, es una técnica destructiva ya que durante el
proceso del análisis es necesario destruir la molécula original que se estudia.

2.2.- CONCEPTO DE ESPECTROMETRÍA DE MASAS


La espectrometría de masas es una técnica analítica usada para identificar y cuantificar
compuestos químicos, incluso a concentraciones muy bajas. Se basa en medir la relación de la
masa (m) respecto a la carga de las moléculas (z): relación m/z. Para ello es necesario transferir
alguna forma de energía a las moléculas que se pretende analizar para producir la ionización de las
mismas, obteniendo iones en estado gaseoso para luego separarlos en función de su relación
masa/carga (m/z).
La espectrometría de masas (EM) se fundamenta en un principio simple: cuando un flujo de
partículas cargadas se somete a la acción de un campo magnético, experimenta una desviación; la
amplitud de dicha desviación depende de la masa y de la carga de las partículas que integran el
flujo.
La EM se lleva a cabo mediante tres procesos:
1.- La ionización de las muestras.
2.- La separación de los iones resultantes de acuerdo con su relación masa/carga.
3.- La detección y cuantificación de los iones.

2.3.- EL ESPECTRÓMETRO DE MASAS.


La instrumentación que hace posible esta técnica es el espectrómetro de masas.
2.3.1.- COMPONENTES.
Se compone de tres elementos básicos, que en orden secuencial de actuación en un análisis por
espectrometría de masas son los siguientes:
1.- Una fuente o cámara de vaporización e ionización.
2.- Un analizador de masas.
3.- Un sistema de detección y de registro.
2.3.2.- INSTRUMENTACIÓN
1.- Sistema (fuente o cámara) de vaporización e ionización.
Es el componente que permite volatilizar e ionizar la muestra. En la cámara de ionización, los
átomos de la sustancia que se pretende identificar reciben una energía de excitación que les hace
perder electrones. Como consecuencia de la pérdida de electrones, los átomos se convierten en
iones positivos, que se encuentran en fase gaseosa. Para conseguir estos iones positivos se
utilizan principalmente dos tipos de técnicas:
- La ionización por pulverización eléctrica (Electrospray ionization o ESI). Se emplea para
disoluciones y consigue muchos iones a partir de las moléculas en estudio, por lo que el espectro
de masa obtenido presenta muchos picos, cada uno de los cuales corresponde a un ión.
Previamente a la aplicación de este procedimiento es necesario que la muestra haya sido separada
por Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución. Ver su funcionamiento en los anexos.
- La desorción/Ionización por láser asistida por matriz (Matriz Assisted Laser
Desorption/Ionization o MALDI. La muestra se solidifica y se excita con un láser que provoca la
ionización y volatización de la muestra. Con esta técnica se puede identificar cualquier
microorganismo. Ver su funcionamiento en los anexos.
- Otras técnicas: ionización por láser inducida en superficie y el bombardeo con átomos acelerados
(FAB), Ionización Química a Presión Atmosférica (APCI)…
2.- Analizador de masas.
Los iones generados por el sistema de vaporización son acelerados hacia el analizador de masas.
Este es el dispositivo que separa la mezcla de iones, que se ha obtenido tras la ionización, en
función de su relación masa/carga (m/z o masa/n° de cargas del ión). Para realizar esta separación
hay varios procedimientos posibles, pero tienen en común que separan las moléculas mediante
campos eléctricos y magnéticos en cámaras de vacío para facilitar la movilidad, y dirigirla hacia un
detector. El proceso básico es el siguiente:
- Los iones producidos en la cámara de ionización pasan a la cámara de desviación. Los iones
son acelerados por un campo eléctrico y entran en un campo magnético uniforme e intenso
dentro de la cámara de desviación. Cuando el flujo de iones positivos atraviesa la cámara, la
trayectoria de cada uno de ellos experimenta una desviación por efecto del campo magnético;
en lugar de atravesar la cámara en línea recta, lo hacen siguiendo una curva. El grado de
curvatura de cada trayectoria depende de la masa y la carga del ion positivo; los iones pesados
siguen una trayectoria que no se aparta mucho de la línea recta, mientras que los más ligeros
resultan más desviados. De esta forma, los iones gaseosos procedentes de la molécula que
queremos detectar y cuantificar, son separados según su relación masa/carga.

• Tipos de analizadores de masas.


o Analizadores de sector magnético. Utilizan un sistema de aceleración de los iones y un
imán que hará que el haz de iones se desplace con una trayectoria circular.
o Espectrómetro de masa cuadripolar (Q). Se compone de 4 barras alargadas en formación
cuadrada, concectadas eléctricamente entre sí en pares opuestos. A dichos pares (polos)
se les aplica una tensión de radiofrecuencia variable que sintoniza con un determinado ión.
Cuando existe sintonía entre el ión que está pasando por ellas y la frecuencia aplicada,
dicho ión continúa su camino y todos los demás no sintonizados se desvían fuera del
cuadripolo; de esta manera no impactan con el detector.
o Analizadores de masas de tiempo de vuelo (TOF). Son capaces de separar los iones
según el tiempo que tardan en llegar al detector.
o Otros: analizadores de trampa de iones (IT), resonancia iónica ciclotrónica con
transformada de Fourier (FT-ICR) o los analizadores orbitrap.
Los espectrómetros de masa se construyen combinando los diferentes sistemas de ionización y de
análisis y, a su vez, se combinan con diferentes sistemas cromatográficos (de líquidos de alta
resolución, de gases) para obtener muestras ya separadas y facilitar la identificación y
cuantificación. Algunos ejemplos de espectrómetros de masa son: MALDI-TOF, ESI-Q y ESI-IT.´
3.- Sistema de detección y de registro.
Los iones procedentes del sistema acelerador llegan de manera secuencial al detector (tubo
fotomultiplicador, copa de Faraday), que generalmente está constituido por un cátodo emisor que,
al recibir el impacto producido por las partículas cargadas, emite electrones. El detector registra la
magnitud de las desviaciones con respecto a la línea recta experimentadas por las trayectorias de
las partículas que integran la muestra, indicando así la masa y la carga de dichas partículas. Esta
señal será posteriormente amplificada, registrada y digitalizada. Dado que cada elemento y cada
átomo poseen una masa y una carga características, la lectura del registro recogido por el detector
permite identificar los átomos presentes en la muestra.
Por tanto, las señales llegan de manera secuencial al detector, en el que son captadas e integradas
por un sistema informático, que genera los correspondientes espectros de abundancia, que es un
gráfico que representa la abundancia relativa de los iones producidos, en porcentaje y
representado en ordenadas, respecto de su relación masa/carga (m/z/), en abscisas. La señal
correspondiente a un ión aparece en forma de varios picos que corresponden a la distribución
estadística de los distintos isótopos del ión. Por comparación con los espectros recogidos en las
bases de datos y empleando los motores de búsqueda se procederá a la identificación de las
moléculas analizadas.

2.3.3.- APLICACIONES DE LA ESPECTROMETRÍA DE MASAS.


Es una técnica analítica que en los últimos años ha avanzado enormemente. Actualmente se
realizan numerosos análisis en poco tiempo con excelentes resultados. Tanto es así que está
sustituyendo a muchas técnicas habituales en los laboratorios. Tiene una gran cantidad de
aplicaciones, entre las que destacan las siguientes:
- Identificación y cuantificación de macromoléculas en fluidos biológicos, como proteínas, lípidos
y glúcidos.
- Identificación y cuantificación de macromoléculas y moléculas pequeñas en tejidos biológicos.
Resulta muy útil para los patólogos para poder diferenciar por el perfil molecular un tipo de
cáncer de otro.
- Monitorización de fármacos en fluidos biológicos.
- Detección de productos tóxicos en fluidos biológicos. Por ejemplo, es el método de referencia
para la detección de drogas de abuso como cocaína. Marihuana, heroína, etc.
- Técnicas de screening neonatal para la detección de enfermedades metabólicas hereditarias.
Por ejemplo, La prueba del talón se hace actualmente con espectrometría de masas.
- En microbiología para identificar colonias de microorganismos patógenos.
- En el proyecto proteoma humano, a partir del proyecto genoma humano, se usa para detectar
el funcionamiento de cada proteína que viene determinada en cada uno de los genes.

2.5.- VENTAJAS DE LA ESPECTROMETRÍA DE MASAS.

Las ventajas de la espectrofotometría de masas son las siguientes:


- Sensibilidad: Puede detectar moléculas en cantidades de attomoles (10-18 moles).
- Especificidad. Puede detectar y diferenciar cualquier molécula ya que puede medir la masa
molecular de un analito y sus fragmentos iónicos.
- Versatilidad. Es aplicable a todo tipo de muestras: volátiles y no volátiles, polares y apolares,
sólidos, líquidos y gases.
- Puede analizar muestras complejas (con muchos tipos de diferentes tipos de componentes) si
se le acopla la cromatografía o la electroforesis como técnica de separación previa.