UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

E.A.P. DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA

SEMINARIO 2:

ASIGNATURA: Biología molecular

nivelación
ESTUDIANTES:
❏ Acedo Zegarra Gian franco
❏ Azabache Sinti Eduard
❏ Baylon Cipriano, Ana Paula
❏ Bocanegra Vital, Luciana
❏ Rojas Peña Juan Carlos

DOCENTE: Rodriguez Soto Juan Carlos

 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)

Es una de las técnicas de cromatografía más utilizadas

debido a su capacidad de separar analitos de distinta
naturaleza presentes en una mezcla. Es el resultado de las
interacciones específicas entre las moléculas de la muestra en
ambas fases, móvil y estacionaria

Un cromatógrafo líquido de alto rendimiento opera

generalmente con cinco instrumentos:

- Una Bomba de impulsión

- Inyector
- Columna
- Detector
- Dispositivo de recopilación de datos.
 FUNDAMENTO (HPLC)

La HPLC es uno de los tantos métodos de cromatografía para

la separación y análisis de los componentes químicos de una
mezcla. Básicamente, en este método participan las fases
móvil y estacionaría (inmiscibles entre sí) y la muestra de
interés.

La fase móvil es líquida y su función es llevar la muestra a

través de la fase estacionaría, que puede ser sólida o una
película líquida soportada en un sólido inerte.

Las distintas fuerzas químicas y físicas que actúan entre la

mezcla a analizar y las dos fases determinan la retención y
separación de cada uno de los componentes de la mezcla
(Fallon, Booth y Bell, 1987).
PROCEDIMIENTO DE UNA HPLC
 FUNDAMENTO (HPLC)

Las principales fuerzas que actúan en las moléculas son:

• Las fuerzas de dispersión de London

• Las interacciones dipolo

• Las interacciones por puente de hidrógeno

• Interacciones dieléctricas

• Interacciones electroestáticas

Cualquier variación de estas fuerzas afectará directamente el

grado de separación obtenido (Fallon et ál., 1987).
 Bomba recíproca
USO:Sistema de desgasificación de O2 Y N2 a presiones mayores a 400 kg/cm2.(COLLINS, C.H, etal,2006)
 Inyector

El problema es el ensanchamiento de banda que acompaña a la sobrecarga de las columnas por eso se emplean volúmenes a
pocas décimas de micrómetro.Además con estos bucles se puede introducir la muestra a presiones de hasta 500 kg/cm
3./COLLINS, C.H.etal,2006)

– Permite la elección del volumen (5 a 500 μ)9L)

- Buena precisión

- Automuestreadores
 Columna cromatográfica
USO: Cuando esté presente la fase estacionaria, en la que tenga lugar la separación.

Columna de 1mx 2.1 mm de acero inoxidable

Características:

• Longitud • 10 a 30 cm

• Diámetro • 2 a 5 mm

• Llenado • partículas de 3 - 10 μm

• Microcolumnas • d.i = 0.1-5 mm, l = 3 - 8 cm, relleno = 3 - 5 μm

•Ventajas:

- Mayor eficiencia de la columna

– Menor consumo de disolventes

– Mayor velocidad de elución

 Detector
USO: Dispositivo conectado en la salida de la columna donde emite una señal eléctrica, que se registra de forma
continua la composición del eluyente, generando un cromatograma.

Detectores de la absorción UV con

monocromadores están basados en una
propiedad del soluto.
Con filtros con una
lámpara de mercurio
como fuente

Es limitado para aquellos solutos que

absorben algunas de estas longitudes.
Importancia de la técnica

“ Las razones de la popularidad de esta técnica son su sensibilidad, su fácil adaptación a las determinaciones
cuantitativas exactas, su idoneidad para la separación de especies no volátiles o termolábiles y, sobre todo,
su gran aplicabilidad a sustancias que son de primordial interés en la industria, en muchos campos de la
ciencia y para la sociedad en general”
 Sistema de elución:

- Isocrático : La constitución solvente permanece constante

- Gradiente: Se cambia la composición del disolvente

a) Cromatografía de Reparto
Está basada en la separación de una mezcla de sustancias
mediante el reparto de la fase móvil y la fase estacionaria.

Se subdivide en cromatografía líquida y cromatografía con

fases unidas .

Los soportes se preparan casi siempre con sílice.

 FUNDAMENTO
La separación de las moléculas se produce porque cada una de ellas tiene una
afinidad diferente por las dos fases.
Moléculas más hidrofóbicas = fase estacionaria
Moléculas más hidrofílicas = fase móvil.

APLICACIONES
b) Cromatografía de Absorción
Técnica de separación basada en la capacidad
de las moléculas para interactuar con una fase
estacionaria y una fase móvil.

FUNDAMENTO
Una muestra se coloca en la parte superior de una
columna de adsorbente y se deja pasar a través del
material poroso por medio de un disolvente. Las moléculas
de la muestra se adsorben en la superficie del adsorbente
en diferentes grados.

Los componentes de la muestra se separan en la columna

en función de su afinidad por el adsorbente. De esta
manera, se logra la separación de los componentes de la
muestra.
c) Cromatografía iónica
Las separaciones por intercambio iónico se llevan a
cabo con materiales insolubles y de textura porosa,
las cuales presentan grupos reactivos asociados a
iones lábiles capaces de intercambiarse con los del
medio que les rodea, por lo que inevitablemente este
tipo de cromatografía ha de realizarse en medio
líquido.

Se utilizan tres tipos de materiales para cromatografía

de cambio iónico: resinas, geles y celulosas.
FUNDAMENTO y APLICACIÓN
Se basa en la interacción de los iones presentes en
una muestra con una matriz cargada eléctricamente
llamada resina de intercambio iónico. La matriz de
resina contiene grupos funcionales cargados, que
pueden ser aniones o cationes.

Para separar los iones de la muestra, se utilizan

diferentes técnicas, como la cromatografía de
intercambio iónico, la cromatografía de exclusión
iónica y la cromatografía de afinidad iónica.

Se ha aplicado a una variedad de sistemas orgánicos y

bioquímicos incluyendo drogas y sus metabolitos,
sueros, conservantes de alimentos, mezclas de
vitaminas, azúcares y preparaciones farmacéuticas.
d) Cromatografía de Exclusión por Tamaño
Es una técnica muy valiosa que se aplica
particularmente a especies de alto peso
molecular. Se basa en el tamaño de las
moléculas, por el uso de una matriz de gel
poroso en la que se pueden separar las
moléculas según su tamaño molecular.

El principio básico es la distribución de tamaños

FUNDAMENTO moleculares en una muestra. Las moléculas grandes se
eluyen antes que las pequeñas y, por lo tanto, la elución de
una muestra en una columna da lugar a un perfil de elución
que representa una distribución de tamaños moleculares.
APLICACIÓN
Los métodos de exclusión por
tamaños se subdividen en la
cromatografía de filtración en
gel y la de gel permeable.
GEL: separa moléculas de
alto peso molecular de
productos naturales.
GEL PERMEABLE: Separación
de homólogos y oligómeros.
 Utilidad en la caracterización molecular de
productos y moléculas

Su aplicación industrial abarca la farmacéutica, la

bioquímica, los alimentos, los productos de la
industria química, la medicina clínica y la química
forense (separación de aminoácidos, etc).
La Cromatografía Líquida de Alta Performancia o
(HPLC) es una técnica muy utilizada en el ámbito
químico, pero también puede usarse en biología
molecular y nos puede ayudar a detectar polimorfismos
y/o mutaciones puntuales.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

Fallon, A., Booth, R., y Bell, L. (1987). Applications of HPLC in biochemistry (1.ª ed.). EE. UU.: Elsevier Science Ltd.

Collins, C.H., Braga, G.L., & Bonato, P.S. (2006). Fundamentos de cromatografía. UNICAMP.

Martinez, H., Sámano,R., Tolentino, M., Morales, R., Ramirez, C. & Pizano, M. (2017). Utilidad de un método que determina
simultáneamente retinol y alfa-tocoferol en leche materna por cromatografía líquida de alta resolución. Perinatol Reprod
Hum; 30(4):151-158.

Suarez,D., Y Morales, Y. (2018). Pricipios básicos de la cromatografía líquida de alto rendimiento para la separación y
análisis de mezclas. Revista Semilleros, 4: 7-13.
GRACIAS