INTRODUCCIN La cromatografa de lquidos es un mtodo de separacin fsica basado en la distribucin de los componentes de una mezcla entre una fase

estacionaria y una fase mvil que en este caso es un lquido. La cromatografa lquida clsica se lleva a cabo en una columna generalmente de vidrio, la cual est rellena con la fase estacionaria. Luego de sembrar la muestra en la parte superior, se hace fluir la fase mvil a travs de la columna por efecto de la gravedad. Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones el tamao de las partculas de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamao de los micrones lo cual gener la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que la fase mvil fluya a velocidades razonables. De esta manera, naci la tcnica de cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC), que requiere de instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones requeridas. Dependiendo del tipo de fase estacionaria y del tipo de fenmeno fsico que provoca la separacin, la cromatografa lquida de alta resolucin puede clasificarse en: TIPOS Cromatografa de fase normal La cromatografa de fase normal o "Normal phase HPLC" (NP-HPLC) fue el primer tipo de sistema HPLC utilizado en el campo de la qumica, y se caracteriza por separar los compuestos en base a su polaridad. Esta tcnica utiliza una fase estacionaria polar y una fase mvil apolar, y se utiliza cuando el compuesto de inters es bastante polar. El compuesto polar se asocia y es retenido por la fase estacionaria. La fuerza de absorcin aumenta a medida que aumenta la polaridad del compuesto y la interaccin entre el compuesto polar y la fase estacionaria polar (en comparacin a la fase mvil) aumenta el tiempo de retencin. La fuerza de interaccin no slo depende de los grupos funcionales del compuesto de inters, sino tambin en factores estericos de forma que los ismeros estructurales a menudo se pueden diferenciar el uno del otro. La utilizacin de disolventes ms polares en la fase mvil disminuye el tiempo de retencin de los compuestos mientras que los disolventes ms hidrofbicos tienden a aumentar el tiempo de retencin. La NP-HPLC cay en desuso a los aos setenta con el desarrollo del HPLC de fase reversa o Reversed-phase HPLC debido a la falta de reproductibilidad de los tiempos de retencin puesto que los disolventes prticos cambiaban el estado de hidratacin de la silica o almina de la cromatografa.

Cromatografa de fase reversa

La HPLC de fase reversa (RP-HPLC) consiste en una fase estacionaria apolar y una fase mvil de polaridad moderada. Una de las fases estacionarias ms comunes de este tipo de cromatografa es la silica tratada con RMe 2SiCl, dnde la R es una cadena alquil tal como C18H37 o C8H17. El tiempo de retencin es mayor para las molculas de naturaleza apolar, mientras que las molculas de carcter polar eluyen ms rpidamente. El tiempo de retencin aumenta con la adicin de disolvente polar a la fase mvil y disminuye con la introduccin de disolventes mas hidrofobicos. La cromatografa de fase reversa es tan utilizada que a menudo se lo denomina HPLC sin ninguna especificacin adicional. La cromatografa de fase reversa se basa en el principio de las interacciones hidrofbicas que resultan de las fuerzas de repulsin entre un disolvente relativamente polar, un compuesto relativamente apolar, y una fase estacionaria apolar. La fuerza conductora en la unin del compuesto a la fase estacionaria es la disminucin del rea del segmento apolar del analito expuesto al disolvente.Este efecto hidrofbico est dominado por la disminucin de la energa libre de la entropa asociada con la minimizacin de la interfase compuestodisolvente polar. El efecto hidrofbico disminuye con la adicin de disolvente apolar a la fase mvil. Esto modifica el coeficiente de particin de forma que el compuesto se mueve por la columna y eluye. Las caractersticas del compuesto de inters juegan un papel muy importante en la retencin. En general, un compuesto con una cadena alquil larga se asocia con un tiempo de retencin mayor porque aumenta la hidrofobicidad de la molcula. Aun as, las molculas muy grandes pueden ver reducida la interaccin entre la superficie del compuesto y la fase estacionaria. El tiempo de retencin aumenta con el rea de superficie hidrofbica que suele ser inversamente proporcional al tamao del compuesto. Los compuestos ramificados suelen eluir ms rpidamente que sus ismeros lineales puesto que la superficie total se ve reducida. Aparte de la hidrofobicidad de la fase inmvil, otras modificaciones de la fase mvil pueden afectar la retencin del compuesto; por ejemplo, la adicin de sales inorgnicas provoca un aumento lineal en la tensin superficial, y como que la entropa de la interfase compuesto-disolvente est controlada precisamente por la tensin superficial, la adicin de sales tiende a aumentar el tiempo de retencin. Otra variable importante es el pH puesto que puede cambiar la hidrofobicidad del compuesto. Por este motivo, la mayora de mtodos utilizan un tampn como el fosfato de sodio para controlar el valor del pH. Estos tampones controlan el pH, pero tambin neutralizan la carga o cualquiera resto de silica de la fase estacionaria que haya quedado expuesta y actan como contraiones que neutralizan la carga del compuesto. El efecto de los tampones sobre la cromatografa puede variar, pero en general mejoran la separacin cromatogrfica. Las columnas de fase reversa se echan a perder con menor facilidad que las columnas de silica normales. Aun as, muchas columnas de fase reversa estn formadas por silica modificada con cadenas alquil y no se deben utilizar nunca con

bases en medio acuoso puesto que stas podran daar el esqueleto de silica subyacente. Las columnas se pueden utilizar en cidos en medio acuoso pero no deberan estar expuestas demasiado tiempo al cido porque puede corroer las partes metlicas del aparato de HPLC.

Cromatografa de exclusin molecular La cromatografa de exclusin molecular, tambin conocida como cromatografa por filtracin en gel, separa las partculas de la muestra en funcin de su tamao. Generalmente se trata de una cromatografa de baja resolucin de forma que se suele utilizar en los pasos finales del proceso de purificacin. Tambin es muy til para la determinacin de la estructura terciaria y la estructura cuaternaria de las protenas purificadas. La cromatografa de filtracin molecular es un mtodo de cromatografa en columna por el cual las molculas se separan en solucin segn su peso molecular, o ms precisamente, segn su radio de Stokes. En esta cromatografa, la fase estacionaria consiste en largos polmeros entrecruzados que forman una red tridimensional porosa. A los fines prcticos, la columnas se empaquetan con pequeas partculas esferoidales formadas por esos polmeros entrecruzados. En consecuencia, estas partculas son porosas, y el tamao de los poros es tal que algunas molculas (las demasiado grandes) no podrn ingresar a esos poros, en tanto que otras (las suficientemente pequeas) podrn pasar libremente. Los poros quedan conectados formando una malla o red, lo cual determina una serie de caminos a ser recorridos por las molculas que acceden al interior de esta.

Cromatografa de intercambio inico Artculo principal: Cromatografa de intercambio inico En la cromatografa de intercambio inico, la retencin se basa en la atraccin electrosttica entre los iones en solucin y las cargas inmovilizadas a la fase estacionaria. Los iones de la misma carga son excluidos mientras que los de carga opuesta son retenidos por la columna. Algunos tipos de intercambiadores inicos son: i) Resinas de poliestireno, ii) intercambiadores inicos de celulosa y dextranos (geles) y iii) Silica porosa o vidrio de tamao de poro controlado. En general los intercambiadores inicos favorecen la unin de iones elevada carga y radio pequeo. Un incremento en la concentracin del contrain (respeto a los grupos funcionales de la resina) reduce el tiempo de retencin. Un incremento en el pH reduce el tiempo de retencin en las cromatografas de intercambio catinico mientras que una disminucin del pH reduce el tiempo de retencin en las cromatografas de intercambio aninico. Este tipo de cromatografa es ampliamente utilizado en las siguientes aplicaciones: purificacin de agua, concentracin de componentes traza, Ligand-exchange chromatography, Ion-

exchange chromatography of proteins, High-pH anion-exchange chromatography of carbohydrates and oligosaccharides, etc Cromatografa basada en bioafinidad Este tipo de cromatografa se basa en la capacidad de las sustancias biolgicamente activas de formar complejos estables, especficos y reversibles. La formacin de estos complejos implica la participacin de fuerzas moleculares como las interacciones de Van der Waals,interacciones electrostticas, interacciones dipolo-dipolo, interacciones hidrofbicas y puentes de hidrgeno entre las partculas de la muestra y la fase estacionaria.

INSTRUMENTAL

La fase mvil puede ser un solvente puro o una mezcla de solventes. Cuando se trata de una mezcla, puede programarse la bomba para que tome solventes de diferentes botellas en una proporcin determinada y realice la mezcla en una cmara de mezclado. Cuando durante toda la separacin se utiliza siempre el mismo solvente, se denomina isocrtica, sin embargo es normal realizar gradientes de composicin de solvente para aumentar el rango de polaridades de sustancias a separar acortando el tiempo total de anlisis. Estos gradientes de solvente tambin son realizados en forma automtica por las bombas. La bomba

enva al solvente hacia la vlvula inyectora a travs de tuberas de dimetro pequeo, de acero inoxidable o de plsticos especiales. La vlvula inyectora suele ser una vlvula de seis vas

El objeto de utilizar este tipo de vlvulas es de no interrumpir el flujo de fase mvil a travs de la columna e introducir en el flujo de la misma un volumen de muestra que estar contenida en un tramo de tubera de volumen fijo (loop). Luego de que se produce la separacin en la columna, los componentes de la mezcla pasan por el detector que genera una seal elctrica ante el pasaje de los analitos proporcional a la cantidad de sustancia. Esa seal es enviada al registrador o a la PC en donde queda registrado el cromatograma. En el caso ideal los picos cromatogrficos son gaussianos y cada pico corresponde a un componente de la muestra original. El integrador puede calcular adems el rea correspondiente a cada pico, la cual es proporcional a la cantidad de sustancia. Dado que los detectores de HPLC son no destructivos, es posible recuperar los productos que salen de l. De esta manera, dependiendo del tamao del loop de inyeccin y de la columna, y del tipo de bomba, es posible realizar adems de separaciones analticas, cromatografas preparativas.

USOS DEL MTODO es la tcnica d separacin mas ampliamente utilizada, Las razones de la popularidad de esta tcnica son su sensibilidad, su fcil adaptacin a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separacin de especies no voltiles o termolbiles y, sobre todo, su gran aplicabilidad a sustancias que son de primordial inters en la industria, en muchos campos de la ciencia . Algunos ejemplos de estos materiales incluyen los aminocidos, protenas, cidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, drogas, terpenoides, plaguicidas, antibiticos esteroides, especies organometlicas y una cierta variedad de sustancias inorgnicas. se utiliza para separar bien las protenas de los aminocidos y de los pptidos de bajo peso molecular