CROMATOGRAFÍA DE PERMEACIÓN EN GEL

Universidad de Cuenca
Facultad de Ciencias Químicas
Química de Polímeros

Integrantes:
Inés Arteaga, Verónica Bravo, Jonathan Guaraca, Gustavo García, Edison
Dumaguala, Raúl Ordoñez, Dominica Seminario, Melissa Ortega
Resumen

Se dará a conocer la técnica de separación por cromatografía de

permeación en gel. Este tipo de cromatografía solido-liquido se utiliza para
determinar pesos moleculares y la respectiva distribución de polímeros en este
caso sintéticos. Actualmente el uso de esta tecnología es muy eficiente dado
que se puede llegar a trabajar a presiones elevadas. Este tipo de
cromatografía tiene distintas aplicaciones como en la industria de alimentos,
en farmacéutica.
Introducción

 La GPC es un tipo de cromatografía sólido – líquido, la cual separa los

polímeros poli-dispersos en fracciones por tamizado mediante un gel, cuya
matriz consta de un gran número de esferas porosas microscópicas. Esta
técnica de purificación altamente extendida y apreciada. Además es la
más indicada para fines analíticos.
Definición

 La cromatografía de exclusión, es una técnica empleada para separar,

purificar y analizar mezclas de sustancias, cuyo único objetivo es el de
determinar los pesos moleculares y las polidispersidades de los polímeros
sintéticos. Este tipo de cromatografía hace referencia a un tipo de
cromatografía líquida.
 En un principio esta técnica se estableció a partir de la preparación de microesferas de
geles de compuestos orgánicos y biológicos solubles en agua, los cuales se usaban para
separar polímeros disueltos en solventes orgánicos utilizando un relleno de poliestireno,
Actualmente esta técnica es rápida y nos permite trabajar a presiones altas ya que se
han desarrollad rellenos con distribuciones de poros precisa y una resistencias mecánica
apropiadas para altas presiones
Mecanismos de separación

 Las moléculas de pequeño tamaño molecular tienden a difundirse a través

de los poros de las partículas del gel llegando a retardar su paso a través
de la columna, mientras que las moléculas de mayor tamaño son
retenidas en los poros de las partículas del gel llegando a eluir
rápidamente. De esta forma, las moléculas se separan en función de su
tamaño, eluyendo en orden decreciente de peso molecular.
Relleno de columna

 Suele estar constituida por partículas

pequeñas de copolimeros (estireno) o de
sílice presentando una red polimérica
uniforme de poros. El tamaño de poro se
controla entre las cadenas poliméricas.
Desde un principio el gel que se obtenía
era hidrofóbico empleado únicamente
para fases móviles no acuosas, sin
embargo, en la actualidad se disponen de
geles hidrofílicos haciendo posible el uso de
disolventes acuosos
 El relleno de columna actúa como si fuera un tamiz dónde podemos
apreciar tres tipos de moléculas:

 Moléculas permeables. - moléculas pequeñas que pasan por el

interior del relleno poroso, atravesándolo lentamente y llegando a
quedar retenidas en este.
 Moléculas fraccionables. – moléculas de tamaño intermedio que
infiltran de manera parcial en los poros de la fase estacionaria.
 Moléculas excluidas. – moléculas con tamaños superiores a las del
poro que no penetran en este y son excluidas rápidamente.
 Fase estacionaria
 Es un material poroso en el cual se debe tomar en cuenta el tipo de
separación a efectuar, la selectividad del gel. Por otro lado, las
características a presentar el material poroso son las siguientes:

 Granulometría uniforme de las esferas y poros insoluble,

 Estabilidad química con respecto al pH y a la temperatura,
 Se mantiene inerte frente a los compuestos a separar;
 Mayor resistencia mecánica en presencia de presiones elevadas.
 Fase móvil
El eluyente a emplear es el que cumple la función de
arrastrar los diferentes componentes de la muestra, por lo
que la muestra debe ser soluble en la fase móvil.
Además se debe tener en cuenta ciertos factores :
 Mientras mas viscosidad se tenga, menos reproducibles
son los resultados.
 A mayor temperatura mejor resolución de la muestra
 Los valores bajos de fuerza iónica favorecen las
interacciones iónicas soluto- fase estacionaria
 El pH influye en la ionización de los solutos y grupos
activos de la fase estacionaria.
 Si se aumenta el flujo del eluyente se dará una
disminución en la eficiencia de la columna.
Columnas
 Pueden ser de vidrio borosilicato o de material plástico transparente. Sin
embrago, se toman en cuenta algunas consideraciones para seleccionar
una columna.

 El rango de separación que presenta la columna, se la selecciona en

función del peso molecular de la muestra.
 El tamaño de partícula del empaque determina la resolución de la
columna.
Análisis de obtención de los pesos
moleculares
 Se utiliza un detector de índice de refracción, ya que la mayoría de
polímeros varían dicho paramento en función de su peso molecular.
También es común emplear el detector espectrofotométrico de longitud
de onda variable.

 Una vez detectada la muestra en el cromatógrafo, se obtiene un

cromatograma en donde los picos iniciales representan el componente de
la muestra con partículas de tamaño molecular superior al de los poros. Los
últimos picos corresponden a las partículas de tamaño molecular pequeño
que tienden a penetrar en los poros llegando a eluir al final.
 Este comportamiento se debe a que el tiempo de elución de un
determinado pico proporciona una idea aproximada de su peso
molecular. Consecuentemente para cuantificar los componentes, se
determina en utilización de curvas de calibración de tal manera los pesos
moleculares correspondientes a cada tiempo (o volumen) de retención.
 Curva de calibración universal

Se la emplea al no disponer de los estándares del polímero analizado y/o cuando

se desconoce su naturaleza; sin embargo, también se lo puede aplicar a
copolimeros, polímeros ramificados y biopolímeros o cuando un polímero es
analizado por viscosímetro en línea
La curva de calibración de Log M(η) ,el producto de M(η) hace referencia al
volumen hidrodinámico (J) para cualquier cadena de polímero.
J = M(η)
En el caso de que las moléculas que presenten igual volumen hidrodinámico
tienden a eluir al mismo tiempo de retención, presentan la siguiente expresión
M1(η)1 = M2(η)2
La ecuación de Mark – Houwink relaciona la viscosidad intrínseca con el peso
molecular dando lugar a una combinación polímero/disolvente:
(η) = 𝐾𝑀𝑎
En utilización de los detectores de viscosímetria/índice de refracción en línea,
se puede llegar a determinar las constantes de Mark – Houwink y a su vez
mediante el detector de índice de refracción los pesos moleculares de una
muestra
Ejemplo de aplicación

Esta técnica se emplea en la separación de proteínas de alimentos,

determinación de glucosa y fructosa en zumos de fruta, etc.
Mucho del trabajo en la industria de los alimentos y las bebidas o en muestras
fisiológicas en las que la mayoría de los ácidos del ciclo de Krebs están
presentes, se realiza con facilidad con columnas de exclusión de aniones.
 Hidrolisis de proteínas

 El parámetro más usado para describir el resultado de un proceso de hidrólisis

es el grado de hidrólisis (DH). Para esto se emplean técnicas como SDS-PAGE
o cromatografía de exclusión por tamaño. Estas técnicas se usan
frecuentemente para comparar la acción hidrolítica de varias proteasas.
 La distribución de tamaños de los péptidos de un hidrolizado puede ser útil
para predecir la capacidad antigénica del mismo, así como para mostrar
diferencias en la actuación de distintos pretratamientos del sustrato
Normalmente se utilizan métodos cromatográficos para este fin.
 La cromatografía de exclusión las moléculas son separadas con base al
volumen hidrodinámico. Desafortunadamente, la separación también está
influenciada por interacciones no específicas entre componentes
proteináceos y el material de la columna, como interacciones ión-
hidrofóbico. Estas interacciones dependen de la elección de eluentes y
del material de la columna. El efecto de las interacciones no específicas
en el cálculo aparente de la distribución de tamaño molecular (MWD)
puede ser reducido por inclusión de un gran número de péptidos para
calibración que difieren en sus propiedades moleculares.
Concluciones
GRACIAS