Universidad Andrés Bello

Facultad de Ciencias Biológicas

Laboratorio de Biología Molecular y Genética General
Profesoras: María Raquel Ibáñez.
Sofía Jeréz.

Trabajo Practico N° 4:
Purificación de DNA plasmidial
BIO041

Autores: Stephanie Castro Gallardo

Valentina Cofre Peñaloza
Iván Villavicencio Baquerizo
Fecha: 25 de abril 2016
INTRODUCCIÓN

Cuando estudiamos la estructura bacteriana nos encontraremos en su citoplasma unas

estructuras de forma circular y de tamaño pequeño llamados plásmidos, los cuales son
parte de los elementos facultativos de una bacteria1. Estos son moléculas de DNA que
son parte del material genético accesorio de la bacteria y tiene la capacidad de replicarse
por sí solos. Su tamaño varía entre las 0,5 a 500 kb y son capaces, por ejemplo, de
codificar para proteínas que poseen resistencia a ciertos antibióticos, lo cual es propio del
plásmido y no se encuentra en el material genético de la bacteria2.

En laboratorios de biología molecular se ha aprovechado de las características de estos

elementos, por esto se ha establecido un método para aislarlas del citoplasma de su
célula hospedera, o en otras palabras, generar una purificación del DNA plasmidial. Este
proceso consta de 3 pasos:

1. Crecimiento del cultivo bacteriano

2. Recolección y lisis bacteriana
3. Purificación del DNA plasmidial

Luego de finalizar este proceso, el material purificado se utiliza como vector de

incoroporación de insertos de DNA con un tamaño máximo de 10 kb3.

En este práctico se nos facilitó un cultivo líquido de E. coli con el cual ejecutaremos la
técnica de purificación de DNA plasmidial. La éxito de la aplicación de la técnica será
finalmente comprobada en una electroforesis en gel de agarosa que luego, el resultado
será colocado sobre un transiluminador de luz ultravioleta para poder observar las bandas
con claridad.

OBJETIVOS

1. Uso de la técnica de purificación de DNA plasmidial, con la adecuada aplicación

de los reactivos que de este participan.
2. Obtener un concentrado de DNA que posea una cantidad adecuada para poder
ser digerido por enzimas de restricción.
3. Observar y analizar las bandas generadas por la electroforesis, y si no hay
presencia de bandas, analizar el posible causante de este resultado.
MATERIALES Y MÉTODOS

Para comenzar el laboratorio de purificación de DNA plasmidial, se obtuvo un tubo que

contenía 3 ml de cultivo de un líquido de una bacteria que se sembró en un medio
enriquecido con LB (Luria Broth) y que fue transformada, procesada e incubada desde el
día anterior a 37°C.

Posteriormente en un tubo de microcentrífuga de 2 ml se introdujeron 1,4 ml del cultivo y

se centrifugó a máxima velocidad (14500 rpm) a lo largo de 5 minutos a temperatura
ambiente, dando como resultado dos fases; el sobrenadante fue eliminado en un
recipiente que contenía cloro y continuamos trabajando con el pellet que decantó en el
fondo.

Resuspendimos el pellet que contenía la bacteria transformada agregando 300 µl de

solución S1, esta solución corresponde a 50 mM de Tris-HCL pH 8.0, 10 mM EDTA, las
cuales amortiguaron y actuaron como quelantes, respectivamente. Una vez resuspendido
completamente, se le agregaron 300 µl de la S2, la cual estaba compuesta por 200 mM
NaOH, 1% SDS. Esta solución permitió que se produjera la lisis bacteriana, y esta se
mezcló invirtiendo el tubo en 10 repeticiones por 2 minutos, y luego se incubó a
temperatura ambiente por 5 minutos. Transcurrido el tiempo de incubación se añadieron
300 µl de S3, la cual generó precipitación de inmediato, esta solución estaba compuesta
por 2.8 M KCH3COO, pH 5.1 que permite neutralizar la alcalinidad del contenido del tubo
de microcentrífuga. Para la precipitación de los complejos moleculares formados, se
mezcló invirtiendo de la misma forma en que se hizo en el paso anterior y se procedió a
incubar la muestra por 15 minutos en hielo.

Posterior a la incubación, la muestra se centrifuga a velocidad máxima (14500 rpm) por 20

minutos a temperatura ambiente, tras esto, se recuperó el sobrenadante y se colocó en un
tubo de microcentrífuga limpio. Se agregaron 900 µl de fenol-cloroformo básico, que es un
solvente orgánico que remueve lípidos, compuestos fenólicos y desnaturaliza proteínas.
Se resuspendió la muestra una vez más y se agitó en vortex; luego se procedió a
centrifugar a velocidad máxima por 5 minutos a temperatura ambiente y se recuperó la
fase acuosa, con la cual tuvimos una dificultad al momento de la extracción ya que se
desprendió la punta de la micropipeta y cayó al fondo del tubo dando lugar a la
contaminación de la fase acuosa con la orgánica al momento de sacar la punta, a pesar
de esto, obtuvimos la fase acuosa que fue colocada posteriormente en un tubo limpio. A
continuación se agregó 900 µl de cloroformo alcohol isoamílico que poseía una proporción
24:1, y se resuspendió nuevamente agitando la muestra en vortex por un minuto. Luego
se centrifugó a velocidad máxima por 5 minutos, se recuperó la fase acuosa la cual fue
depositada en un tubo Eppendorf de 1.5 ml y se le agregaron 900 µl de isopropanol que
se utilizó para precipitar el DNA. Nuevamente agitamos la muestra en vortex. A
continuación, se centrifugó por 20 min a velocidad máxima y a temperatura ambiente, se
le eliminó el sobrenadante y al pellet se le agregó 500 µl de etanol al 70%, lo cual se
procedió a centrifugar nuevamente. Se esperaron unos minutos hasta el que el pellet se
tornara translúcido y se le eliminó el etanol. Al secar completamente el pellet se
resuspendió 10 µl de H2O estéril.

Para la visualización del DNA plasmidial se preparó el gel TAE-agarosa 0.8%, y luego se
depositaron 3 µl de la muestra de mini preparación de DNA plasmidial en un tubo
Eppendorf de 1.5 ml, donde se le agregaron 2 µl de buffer de carga 5X y 2.5 µl de agua
destilada para visualizar finalmente en el transiluminador.
RESULTADOS

Luego de hacer migrar el DNA plasmidial durante 30 minutos en el gel de agarosa, no

obtuvimos visualización alguna al exponerlos al transiluminador.

MPM M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8

Figura 1:
Visualización del gel de agarosa de la purificación
de DNA plasmidial.

En la Fig.1 se observa la migración de las bandas en sus respectivos carriles. En el

primero se encuentra el marcador de peso molecular (MPM) y nuestro trabajo se
evidencia en el carril M5, donde no se observan bandas de acuerdo con lo establecido
con la técnica.
DISCUSIÓN

No se lograron los resultados esperados en el práctico ya que no se pudieron apreciar las

bandas de DNA luego de traspasar las muestras al gel. Se requería, para poder haber
llegado a un resultado satisfactorio, llevar a cabo una adecuada lisis celular y la
denaturación de restos de ácidos nucleicos (DNA cromosómico y RNA), haber eliminado
por completo alguna secuencia distinta al DNA plasmidial, es decir, eliminar residuos
orgánicos contenidos en el citoplasma de la bacteria E. coli, como proteínas, y sobre todo
concentrar por completo el DNA plasmidial encontrado en la muestra.

Como se requería purificar el DNA plasmidial encontrado al interior de la bacteria se debió

generar una ruptura de la pared celular para poder liberar todo el contenido interno, en
este caso, el proceso llamado lisis celular, se llevó a cabo por lisis alcalina. Para generar
esto se debió someter a un ambiente propicio para llevar el proceso a cabo, mediante la
adición de la S1 que poseía un ambiente alcalino de pH = 8.0 que prepara el medio. El
EDTA contenido en la S1 tenía como función inhibir la acción de las nucleasas mediante
la formación de complejos con el cofactor Mg+2 y así evitar que estas enzimas degradaran
el ADN. El Tris-HCl, que también se encontraba en la S1, actuaba como tampón para
evitar un cambio brusco en el pH 1. Teniendo el medio propicio, la adición de la S2
permitió la ruptura definitiva de la membrana celular, basándose en la formación de un
medio alcalino por la adición de NaOH junto al SDS, contenidos en la misma S2. Esto
provocó la denaturalizacion del DNA cromosómico y el RNA. Este proceso se debió llevar
a cabo ya que lo que se deseaba purificar era solo el DNA plasmidial, por esto los demás
ácidos nucleicos debían eliminarse. Si bien las hebras de estos ácidos nucleicos se
separaron, debido a su linealidad, no existía ninguna forma de que se volviesen a unir por
complementariedad, no así el DNA plasmidial, quien debido a su forma circular, al estar
en contacto con esta solución no se desnaturalizo; si bien se separaron los puentes de
hidrogeno entre hebras, al estar en un superenrollamiento circular, seguían
permaneciendo unidos en algunas zonas, por lo que al momento de añadir el acetato de
potasio de la S3 se restauró el pH, lo que generó que se volvieran a formar los puentes de
hidrogeno en el DNA plasmidial, no así en el resto de los ácidos nucleicos. Debido a la
forma lineal de estos, el hecho de encontrarse denaturados en una solución, la
probabilidad de volverse a unir por complementariedad era mínima, y por esto se debió
someter a centrifugación para que precipitaran. Por esta misma razón al hacer el práctico
se trabajó con el sobrenadante, ya que este poseía el DNA objetivo2, 3.

Teniendo en cuenta que toda la primera parte del procedimiento se ha realizado

adecuadamente, se debería poder visualizar las bandas en el proceso de electroforesis, lo
cual no ocurrió. Esto nos lleva a recalcar algunos de los errores que se llevaron a cabo
durante el proceso. Durante la primera parte, donde se debió añadir la S2, por el mal
manejo de la micropipeta, la punta de esta se cayó en el tubo que contenía el pellet. Esto
podía causar que el pellet se haya quedado en la punta de la micropipeta, dejándonos con
una cantidad despreciable de DNA plasmidial.

Otro error pudo haber ocurrido al momento de recuperar el sobrenadante, lo cual se

realizó de la manera incorrecta, ya que se sumergió demasiado la punta de la
micropipeta, contaminando el sobrenadante con el sedimentado.

El fenol-cloroformo tiene como función degradar las proteínas y volver solubles los lípidos,
formando así tres fases: la fase acuosa, donde se encuentra el DNA de interés, una fase
media donde están las proteínas y la fase más densa que se encuentra al fondo, que
contiene los lípidos de la membrana ya lisada previamente4. Tras adherir esta sustancia,
la adecuada extracción de la fase acuosa (sobrenadante), permitiría la buena
visualización en electroforesis, donde no estuviera contaminado con residuos orgánicos
en la fase inferior.

Como se mencionó anteriormente, el acetato de sodio permitió restaurar el pH que se

había tornado para producir la lisis alcalina, llevando la solución a un pH ácido de 5.1,
para que se volvieran a formar los puentes de hidrogeno entre las hebras
complementarias del DNA plasmidial. Este pH debía mantenerse adecuadamente para
evitar una posterior desnaturalización del DNA, y para esto fue que se usó el cloroformo
alcohol isoamílico, ya que sin este se podría haber denaturado el DNA plasmidial por
cambios en el ambiente, sobre todo cambios de pH, y no se hubiese podido visualizar en
la migración por electroforesis, ya que la solución agregada en los carriles no hubiesen
contenido la muestra.

Otro factor que puede haber influido en la obtención del objetivo puro fue la adecuada
acción del isopropanol y del etanol, quienes actúan precipitando los ácidos nucleicos de
interés, en este caso el DNA plasmidial, obteniéndose un pellet de él. El mecanismo de
acción del alcohol es mediante la insolubilidad del ácido nucleico en la solución, esto
debido a que se genera una interacción entre los alcoholes y el agua, donde el primero
combate por los enlaces que genera el agua alrededor del DNA, es decir, deshidrata al
ácido nucleico, provocando que este precipite y se concentre4.

En cuanto a la visualización de dos bandas en la digestión electroforética de nuestros

compañeros, una se vio más nítida que otra, aquella que migro más se observa con un
color más intenso y esto es debido a que hay más cantidad de DNA, en contraste con la
banda que migro menos que contiene menos cantidad de DNA. Estos DNA no son de
distinto peso molecular o de distinto tipo, es el mismo DNA objetivo y la distinción de 2
bandas diferentes es producto del superenrollamiento del DNA circular, lo que quiere decir
que algunos plásmidos aparte de tener el enrollamiento común de las dobles hembras,
estas se enrollan entre sí, lo cual es producto de alguna tensión generada en la
estructura, y para poder liberar aquella tensión, las hebras tienden a generar un bucle.
Como existe un superenrollamiento, el plásmido tiende a compactarse aún más, y esta
compactación genera una disminución relativa del tamaño del DNA, observándose estos
restos más compactados más abajo en la migración del gel, viéndose más cerca del
ánodo, debido a que se genera un plásmido relativamente más pequeño, a este le es más
fácil penetrar a través de los poros del gel de agarosa. Aquellos plásmidos que tienen su
estructura en una conformación más relajada, es decir, sin superenrollamiento excesivo y
sin bucles, se encuentran más cerca del cátodo ya que tienden a simular un peso
molecular más grande5.
CONCLUSIÓN

Debido a que nuestros objetivos no fueron cumplidos a cabalidad, hemos podido discernir
sobre la cautela que debemos tener cuando trabajamos con unidades tan pequeñas de
muestras y mediciones. Sin embargo, como pudimos generar un contraste con los
resultados de nuestros compañeros, igual hemos logrado evidenciar cómo debió resultar
la culminación del práctico.

Estos errores nos hicieron poner a prueba la búsqueda de explicaciones posibles para el
resultado obtenido, tomando en cuenta todas las partes del trabajo, como la manipulación
de los instrumentos, las temperaturas utilizadas, los tiempos y los equipos de trabajo;
llegando a la conclusión de que nuestra equivocación fue en el momento de la
manipulación de instrumentos, ya que se evidenció que en esos pasos fue donde
perdimos el material que posteriormente es utilizado para el análisis.
BIBLIOGRAFÍA
Introducción:
1.- http://www.losmicrobios.com.ar/microbios/?page_id=1242

2.- http://es.slideshare.net/munevarjuan/biologia-de-plasmidos

3.- Universidad Andrés Bello. Guía de laboratorio N°4: Purificación de DNA plasmidial,
curso BIO041 Laboratorio de biología molecular y genética general, 2016.

Discusión:

1.- M. Somma, Analisis de la Presencia de organismos Geneticamente Modificados en

muestras de Alimentos: http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual
%20ES/User%20Manual%20ES%20full.pdf

2.- Angel Herráez. Biologia Molecular e Ingenieria Genetica. (2012) ELSEVIER, 2°

edición. España. pp. 134-135.

3.- Pere Coll y colaboradores, Metodos Moleculares de tipificación epidemiologica en

bacteriologia. (2005). SEIMC. España. pp 8:
https://www.seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/
seimc-procedimientomicrobiologia18.pdf

4.- Angel Herráez. Biologia Molecular e Ingenieria Genetica. (2012) ELSEVIER, 2°

edición. España. pp. 136.

5.- Angel Herráez. Biologia Molecular e Ingenieria Genetica. (2012) ELSEVIER, 2°

edición. España. pp. 79-82.