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EXTRACCIN,
I DENTI FI CACI N Y
CUANTI FI CACI N
DE DNA POR DOS
METODOS
DI FERENTES
ASBTRACT
It is of great importance to obtain
deoxyribonucleic acid (DNA) of high
purity human from white blood cells, for
use in molecular genetic studies
employing techniques of extraction and
purification and characterization such as
electrophoresis.
There were two different methods of
obtaining and purifying DNA, the first
sodium perchlorate and the second
organic extraction by phenol-
chloroform.Only the sample obtained
from sodium perchlorate found to have a
high concentration and purity of DNA so
that this sample was used to perform the
tests.
The identification of DNA was performed
by chemical methods: monosaccharides
colorimetric reaction of DNA and RNA
with the diphenylamine reagent and Bial
respectively.
But we familiarize us with some
techniques used in molecular genetics and
some other disciplines to ensure the
proper handling of samples as sensitive as
DNA.
PALABRAS CLAVE
Purificacin de DNA, Perclorato de
sodio, extraccin de DNA, fenol-
cloroformo, electroforesis, agarosa,
pureza.

INTRODUCCIN
El DNA, es una molcula fundamental, sirve
como la base para la herencia, especificando
que rasgos son transmitidos de los padres a
los hijos a travs de las generaciones. Es una
doble hlice que se enrolla helicoidalmente
en sentido dextrgiro las dos hlices son
antiparalelas, cada hlice posee una serie de
nucletidos unidos por enlaces fosfodister en
los que un grupo fosfato forma un puente
entre grupos OH de dos azcares sucesivos
(posiciones 3 de un azcar y 5 del
siguiente), la Adenina de una hlice aparea
con la Timina de la hlice complementaria
mediante dos puentes de hidrgeno.
Igualmente, la Guanina de una hlice aparea
con la Citosina de la complementaria
mediante tres puentes de hidrgeno. El
dimetro de la doble hlice es de 20 y las
bases nitrogenadas presentan estructuras
planas perpendiculares al eje de la doble
hlice y estn apiladas unas sobre otras a una
distancia de 3,4 . Cada 10 bases (cada 34 )
se produce una vuelta completa de la doble
hlice (360). Adems los cidos Nuclecos
presentan caractersticas fisicoqumicas que
son: Densidad, Desnaturalizacin,
Absorbancia, Cintica de Renaturalizacin.
Mediante la preparacin de soluciones se
pueden obtener los reactivos necesarios para
diversas metodologas de la Biologa
molecular, por lo que es de vital importancia
el realizarlas de manera adecuada, debido a
que cualquier error cometido puede llevar a
la obtencin de resultados errados y que
2

0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
0.08
0.09
0.1
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Grafica 1. Curva Patrn de difenilamina
absorbancia a 595nm (eje Y) vs [ g/mL] (eje X)
pueden ser significativamente importantes ya
que en el laboratorio de Biologa molecular se
trabaja con distintas tcnicas que requieren de
gran precisin como lo son la extraccin,
identificacin y cuantificacin de DNA asi
como,PCR punto final, PCR en tiempo Real,
micro arreglos, hibridacin de cido
nucleicos, secuenciacin.
Antes de analizar y cuantificar DNA es
necesario su extraccin y purificacin. Para
una correcta extraccin es necesario la lisis
de las clulas, las sales caotrpicas ayudan a
romper la estructura tridimensional de
macromolculas como las protenas y ARN
consiguiendo su desnaturalizacin. La adicin
de un detergente como el SDS posteriormente
se realiza una precipitacin proteica con la
ayuda de sales como el Perclorato de Sodio y
despus una purificacin ya que el DNA es
insoluble en alcohol, por lo que se puede
precipitar con etanol fro o isopropanol.
La identificacin de DNA se realizo mediante
mtodos qumicos: reaccin colorimtrica de
los monosacridos de DNA y RNA con los
reactivos de difenilamina y Bial
respectivamente, adems de realizar la lectura
en el espectrofotmetro. Aunado a esto para
comprobar que realmente se tena DNA en la
muestra, se realizo una electroforesis en gel
de agarosa que nos permite identificar,
separar y purificar fragmentos de DNA.
METODOLOGA
La correspondiente al manual de Gentica
molecular practicas: #1. Preparacion de
Material y Reactivos (se modific la
preparacin de soluciones a una dcima de lo
desrito en el manual), #2. Aisalmiento y
purificacin de DNA por la tcnica de
perclorato de sodio, #3. Extraccion de DNA
por la tcnica de Fenlo-Cloroformo ( se
modific la cantidad de SDS a 100l y NaCl
a 600), #4. Identificacion y cuantificacin
de DNA (se resuspendio el DNA por el
mtodo de perclorato), #5 Electroforesis de
DNA (se cambi la concentracin deagarosa
a 8% y se utiliz un Gel Red en lugar de
Bromuro de etidio).
OBSERVACIONES Y RESULTADOS
Mediante el uso de la tcnica de perclorato de
sodio para la extraccin de DNA se obtuvo
una mayor cantidad de DNA 790.5 ng/L
(Tabla 2), en un medio traslucido, en esta
tcnica se obtuvo DNA de alta pureza
comprobada por la relacin 260/280 de las
absorbancias obtenidas siendo esta de 1.73 en
comparacin con 494.2 ng/L y una relacin
de 1.83 de la tcnica de Fenol-cloroformo.
As mismo se realiz una curva patrn para
cuantificar el DNA presente en la muestra
mediante una tcnica espectrofotmetrica.
(Grfica 1)

Tabla 1 Resultados de reacciones de
identificacin de DNA
REACTIVO COLOR +
/
-
SIGNIFICADO
BIAL Incoloro - No hay presencia
de RNA
DIFENIL-
AMINA
Azul claro + Presencia de
DNA
3


Tabla 2 Relacin de pureza y
cuantificacin de DNA
RELACION
260 / 280
CANTIDAD DE
DNA ng / L
Perclorato 1.73 790.5
Fenol-
Cloroformo
1.83

CALCULOS Y GRFICOS

Tabla 3 Curva Patron de difenilamina a
595nm
[ ]
g
DNA
0.05 0.2 0.4 0.6 0.8 DNA
Perclorato
DNA
Fenol-
clorof
ormo
Abs 0.066 0.0715 0.08 0.083 0.0915 0.235 0.220




Perclorato

5.185

Fenol-Cloroformo

4.728
La electroforesis que se realiz para la
muestra obtenida a partir de la tcnica de
perclorato de sodio, mostro que a pesar de ser
eficiente, no se obtuvo DNA de doble hlice
sino que se pudo haber degradado en el
proceso al igual que en la tcnica de
extraccin por Fenol-cloroformo (imagen 1,
equipo 3).

Imagen 1.- Electroforesis en gel de agarosa
DISCUSIN
La extraccin de cidos nucleicos se realiz a
clulas de sangre perifrica, utilizando
distintos buffers de lisis para la ruptura de la
membrana celular y nuclear de los leucocitos,
de igual manera inhibir las protenas para
evitar la degradacin de su material gentico.
Se utiliz en buffer de lisis 1 que nos permiti
llisar los glbulos rojos al contener sucrosa
que rompe la membrana mediante un choque
osmtico. Se agrego tambin un detergente
inico que es til para la ruptura de las
membranas lipdicas adems de poder inhibir
RNAsas y tener actividad de DNAsa.
1

Al agregar el buffer de lisis 2 lisamos a los
ncleos celulares pero adems al contener
EDTA que tiene cuatro grupos carboxilo y
dos grupos amino, cuya forma
completamente de-protonizada puede unirse a
cualquier complejo metlico en solucin,
4

quitando a los cationes de la solucin para
desestabilizar la membrana celular e inhibir a
las ADNasas al agregar el NaCl que forman
una capa inica suave que recubre al ADN
protegindolo y precipita protenas y
ayudando a evitar su degradacin; como el
ADN que est cargado negativamente va a
obtener una capa inica positiva al adicionar
el Perclorato de Sodio que permite su
precipitacin esto con la finalidad de cuando
agregamos el isopropanol frio solubilizado
con el NaCl precipitara todo el DNA presente
en la muestra ya que el DNA es insoluble en
alcoholes. Por otra parte, al recuperar el
sobrenadante mediante una centrifugacin, el
etanol al 70% se remover la concentracin
de residual de sales, al implementar esta
tcnica se obtuvo un botn blanco que se
resuspendio con agua estril para
posteriormente identificar con mtodos
fsicos y qumicos la presencia de DNA,
adems de cuantificar la cantidad de este en
nuestra muestra.
Como se logr obtener una buena extraccin
mediante este mtodo, se le aplico la prueba
de bial para comprobar si haba presencia de
contaminantes como RNA, ya que al ser
cometido a calentamiento la pentosa de RNA
forma un complejo con HCL llamado furfural
el cual en presencia de orcinol se forma un
complejo de color verdoso, observando as
que al obtener una ausencia de color
comprobamos la ausencia de contaminantes
en la muestra.
De igual manera evaluamos la pureza de la
muestra de DNA al obtener la relacin
260/280 nm obteniendo un valor de 1.73
donde se muestra que al obtener un valor
entre 1.8 a 2 tenemos una muestra con una
alta pureza ya que el RNA tambin tiene una
gran absorbancia a 260 nm y los aminocidos
aromticos presentes en la solucin de
DNA..
2

presente se degradara y no se obtuviera la
calidad esperada y por lo tanto la
identificacin no se lograra completamente.

La extraccin realizada por la tcnica de
fenol-cloroformo se lleva a cabo por
diferentes etapas que consisten en lisar a los
eritrocitos con el uso del buffer RCLB,
posteriormente se lleva a cabo la lisis celular
de glbulos blancos y la ruptura del ncleo
que se lleva a cabo mediante SDS y NaCl.
Una vez lisadas las clulas se mesclan con
fenol cloroformo donde los cidos nucleicos
se quedan en la fase acuosa por su alto
contenido en fosfato, y las protenas y dems
contaminantes se quedaran en la fase
orgnica del medio, logrando asi separar y
purificar el DNA
2
, sin embargo se obtuvo una
relacin 260/280 de 1.83, y a pesar de que ser
una buena relacin se obtuvo menor cantidad
debido a posiblemente la forma de emplear
las diferentes soluciones y la muestra ya que
pudo no ser la correcta por nuestra parte, ya
que no obtuvimos un rendimiento eficaz de
DNA (494ng/L), debido a la presencia de
nucleasas y mala manipulacin de la muestra
o talvez puede ser que el mtodo es menos
eficaz que el de perclorato.

Para caracterizar el DNA que se tena se
utiliz la electroforesis en gel de agarosa que
es una de las ms., forma, adems, geles
transparentes con estabilidad mecnica,
insolubles en agua, relativamente no inicos y
que permiten buena visualizacin de las
bandas durante un tiempo prolongado.
Adems tiene la ventaja de que variando la
concentracin de polmeros, se puede
modificar de manera controlada en el tamao
del poro.
5


Por otro lado la agarosa tiene la propiedad de
mantenerse en estado slido a temperatura
ambiente pero que a altas temperaturas se
torna lquida. Una ventaja que posee la
agarosa sobre la acrilamida es que no es un
compuesto txico a diferencia de la
acrilamida y adems permite el anlisis de
cidos nucleicos con pesos moleculares muy
variados. Sin embargo, su poder de
resolucin es menor que el de los geles de
5

poliacrilamida. La concentracin a usar se
escoge segn el tamao del cido nucleico a
analizar.
3

Esto porque la concentracin de agarosa
define el tamao de los poros de la matriz, a
mayor concentracin, menor el tamao de los
poros y viceversa, por lo que en este caso nos
interesaba por las caractersticas mencionadas
de la agarosa emplear este gel para la
electroforesis ya que este gel se comporta
como un tamiz que permite separar molculas
cargadas en funcin de su tamao y forma.
Como se puede observar en la imagen 1 en el
primer carril se coloco el marcador de peso
molecular que son fragmentos de DNA de
tamao conocido con el fin de calcular el
tamao aproximado del DNA. Lo que
esperbamos al aplicar el campo elctrico es
que el DNA fuera atrado hacia el polo
opuesto (nodo) debido a su carga negativa
ya que hay dos fuerzas de accin opuesta que
determinan la velocidad de la partcula.
La diferencia en velocidad de migracin
estar dada por diferencias en la fuerza de
rozamiento, o sea por la forma y tamao de la
molcula de DNA. En el caso del DNA
doble cadena, la forma es la misma para
cualquier molcula, entonces las distintas
molculas tendrn una velocidad que slo
depender de su tamao, es decir, de su
longitud en pares de bases.
4

En los siguientes carriles se cargaron 10 L
(8 L de muestra + 2 L de buffer de carga,
el cual mantiene el equilibrio de la muestra y
le da color caracterstico en el corrimiento de
la muestra y colorante Gel Red que permite
visualizar la muestra con luz U.V.).
En nuestro caso que se muestra en la banda
del equipo 3, cuando se identifico y
cuantifico DNA se comprob por lo mtodos
mencionados anteriormente que
efectivamente se tena una concentracin muy
alta por el mtodo de perclorato de sodio por
lo que se esperaba que en la electroforesis se
observaran bandas bien definidas, pero al
contrario se observa un barrido total de la
muestra al igual que la muestra obtenida por
el mtodo de fenol-cloroformo lo cual se
atribuye a la degradacin de DNA por una
mala manipulacin de la muestra en algn
momento se pudo tomar la muestra
bruscamente provocando que el DNA
presente se degradara y no se obtuviera la
calidad esperada y por lo tanto la
identificacin no se lograra completamente.

CONCLUSIONES

Se logro la extraccin y purificacin de DNA
por la tcnica de Perclorato de Sodio
obteniendo una eficiencia de 790 ng/L de
DNA y de Fenol-Cloroformo de 494ng/L
aunque en esta ltima tcnica no se obtuvo el
rendimiento esperado de DNA debido a
distintos factores ya que se comprob por
medio de la electroforesis que mostr un
corrimiento irregular.

Con esto nos logramos familiarizar con
tcnicas empleadas en Gentica Molecular y
otras disciplinas para la correcta
caracterizacin no slo de DNA sino tambin
de otras molculas de inters biolgico.

REFERENCIAS

1.- Luisa I. Falcn y Aldo Valera (2004),
Las herramientas moleculares: Extraccin de
cidos nucleicos

2.- Concepcin J., Puerta. practicas de
biologa molecular. Pontificia Universidad
Javeriana. Espaa. p.p. 15-19, 23-25

3.-Bio-Rad: Protocolo que acompaa al
Quantum Prep Miniprep Kit.
Nelson DL, Cox MM (2001): Principios
de Bioqumica, 3 ed. Editorial Omega
(Barcelona, Espaa), pp 1119-1128.

4.-
http://facultad.bayamon.inter.edu/amlugo/
biol2013/electroforesisDNA.htm
Consultada 21/09/2012

5.-Introduccin a la Biologia Celular y
Molecular, Universidad Nacional de
Quilmes TP5: Cuantificacin de ADN y
electroforesis en gel de agarosa