Purificación de la enzima de restricción EcoRI

Universidad Nacional Autónoma de México, Facultad de Química, Cd de México, México.

Introducción
La endonucleasa EcoRI es una enzima de restricción de tipo II que se encuentra presente en
algunas enterobacterias; para el presente trabajo se considera a la enzima presente en
Escherichia Coli . Las enzimas de restricción de tipo II se identifican por catalizar la hidrólisis de
enlaces fosfodiéster encontrados en secuencias de ADN específicas; esto permite que la
enzima actúe como una defensa primitiva contra el ADN extraño. Las enzimas de restricción de
la familia del tipo II pueden ser purificados mediante procedimientos cromatográficos, dichos
métodos permiten la protección de los enzimas frente a la desnaturalización durante el
fraccionamiento de la muestra. Para este estudio se ahondó en la investigación de métodos
efectivos para la purificación de la enzima, partiendo de sus propiedades fisicoquímicas.

Purificación de la enzima de restricción EcoRI

Las endonucleasas de secuencia específica, o de Tipo II, se conocen comúnmente como
enzimas de restricción. Varias enzimas de restricción Tipo II reconocen una secuencia
específica de ADN e hidrolizan los enlaces fosfodiéster a una distancia definida de ese sitio.​1
Este tipo de enzimas pueden ser purificados mediante procedimientos cromatográficos, una
vez que los extractos han sido liberados de los ácidos nucleicos celulares se utiliza una matriz
de intercambio iónico a un pH casi neutro para la separación.

Sin embargo, estas condiciones para realizar la separación tienen que ser las ideales para
lograr una correcta purificación pues hay cambios aparentes en la especificidad de las
endonucleasas de restricción que están asociados con cambios de las condiciones de la
reacción. Entre las condiciones que pueden provocar dichos cambios son la concentración
iónica, el pH del buffer y la temperatura.​2
Teniendo en cuenta estos factores, al igual que consultando artículos referidos a la purificación
de proteínas, se describe en el presente trabajo un método para realizar dicho procedimiento.

La enzima de restricción Ecori tiene un peso molecular de 29,135.7 Da, un punto isoeléctrico
de 6.23. Comúnmente dicha enzima es encontrada en enterobacterias; en este caso se
decidirá trabajar con una cepa de Escherichia coli 294, ​llevando el plásmido pPG430 que
contiene EcoRI endonucleasa y metilasa. La cepa E. coli 294 fue cultivada a 37° C hasta un
valor de absorbancia de 1.2 a 595 nm.

Como se menciona es necesario que los ácidos nucleicos hayan sido extraídos para su
purificación, es por eso que se realiza la rotura de las células por sonicación y centrifugación
durante 15 minutos a 4° C para que su material genético pueda quedar expuesto.
Es necesario que las muestras de suspensiones celulares estén previamente preparadas antes
de ser descongeladas, las muestras deberán contener: buffer A (20mM K-fosfato que se
preparó añadiendo 20mM KH​2​PO​4 a K​2​HPO​4 hasta el pH de la solución neutro, 1 mM
2-mercaptoethanol, 1mM de EDTA, 0.2% Triton X-100, pH 7.0); es necesario llegar a pH neutro
para que posteriormente se lleve a una columna de intercambio iónico.
Al utilizar una columna de fosfocelulosa, la cual al ser un intercambiador aniónico, es necesario
que el pH de nuestro buffer en las muestras celulares sea mayor respecto al punto isoeléctrico
de la enzima(6.33). Por ende se encontrará en forma desprotonada y dadas las características
de la resina esta podrá capturarla..
También es necesario que las eluciones sean realizadas de igual manera con el Buffer A y
gradientes de NaCl (0.4-1M). Esto va a provocar que aumente la solubilidad de la proteína y se
de una solubilización por salado, permitiendo realizar extracciones de la muestra. Al realizar
una segunda cromatografía en columna se realizará eluyendo cuatro veces con el Buffer A
para así asegurarnos de la purificación de la enzima.
Para poder homogeneizar la enzima Eco RI, se realizará una electroforesis (SDS-PAGE), el
cual es un método analitico que en bioquimica nos permite separar moléculas cargadas en un
campo eléctrico,a través de una matriz de gel en donde las moléculas más pequeñas migran
más rápido debido a la resistencia del gel.

Materiales y Métodos
Purificación de una enzima.
1. Paso 1, rotura de las bacterias por sonicación y centrifugación.
Preparación de la muestra: El extracto crudo se descongelo, se suspendió en buffer
A (20mM K-fosfato que se preparó añadiendo 20mM KH​2​PO​4 a K​2​HPO​4 hasta el pH
de la solución neutro, 1 mM 2-mercaptoethanol, 1mM de EDTA, 0.2% Triton X-100,
pH 7.0) y suplementado con 0.8M NaCl y 0.1 M de Fluoruro de fenil metil sulfonilo
(PMSF) a la concentración final. Las suspensiones celulares se mantuvieron en
sonicación y en baño de hielo. El extracto crudo se quedó durante 16 horas contra el
buffer A que contenía NaCl 0.4 M, después de lo cual los restos celulares se
eliminaron por centrifugación a 9500 rpm en un rotor durante 15 minutos a 4 ° C.
2. Primera cromatografía en columna de fosfocelulosa: la fracción obtenida del paso
anterior se vertió a un columna de fosfocelulosa (50 cm x 2 cm de diámetro)
equilibrada con el tampón A que contiene NaCl 0,4 M. Las eluciones posteriores se
llevaron a cabo con el buffer A que contiene concentraciones crecientes de NaCl (de
0,4 a 1 M).
3. Cromatografía de hidroxiapatita por lotes: las fracciones eluidas con NaCl 0.6 M se
fueron agrupando y aplicado a cromatografía de hidroxiapatita por lotes que se
equilibró con el tampón A que contiene NaCl 0.6M. La elución se realizó paso a paso
aumentando las concentraciones de K-fosfato variando de 0.1M a 0.6M en el buffer
A.
4. Segunda cromatografía en columna de fosfocelulosa: las fracciones enzimáticas
activas fueron agrupando y diluyendo cuatro veces con buffer A, aplicado a una
segunda columna de fosfocelulosa (10 cm x 1 cm de diámetro).
5. Electroforesis: la homogeneidad de la enzima purificada se probó mediante
electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio y poliacrilamida (SDS-PAGE).
Conclusiones
Las enzimas de restricción como Eco- RI son las principales herramientas en la tecnología
del DNA recombinante. Las bacterias usan las enzimas de restricción como factor de
virulencia, de manera que se protegen rompiendo las cadenas de DNA de otros
microorganismos.
Eco-RI es la principal enzima usada en la síntesis de insulina. Existen diferentes metodos de
purificacion de proteinas y enzimas, en donde se analizan sus propiedades fisicoquímicas
para tomar la mejor elección de una cromatografía, se usó cromatografía de intercambio
iónico , sin embargo este no es el unico metodo de purificacion

Bibliografía
1. Vitek Andrew; “Endonucleasa EcoRI”, (07/09/10) Consultado en:
https://collab.its.virginia.edu/access/content/group/f85bed6c-45d2-4b18-b868-6a2353586804/2/
Ch28_Vitek_A_Eco-RI_Endonuclease-_-/Ch28_Vitek_A_Eco-RI_Endonuclease_References.ht
ml
2. The biotechnology Education Company, “Purificación de la enzima de restricción
EcoRI”, (07/09/19). Consultado en: ​https://www.edvotek.com/site/pdf/302.pdf
3. Candan T. , Z. I. Olsan, Bet Kirdar, “A Comparative Study on the Recovery of EcoRI”
Turk J Chem, 25 (2001) , 63 – 71. Consultado en:
https://pdfs.semanticscholar.org/b42c/7e45bfbe290c2d5a32497b9c3d3e4eb19342.pdf