Discusión

No se lograron los resultados esperados en el práctico ya que no se lograron apreciar las

bandas de DNA ni de ningún tipo. Se requería, para poder haber llegado a un resultado
satisfactorio, llevar a cabo una adecuada lisis celular y la denaturación de restos de Ac.
Nucleicos (DNA cromosómico y RNA), haber eliminado por completo alguna secuencia distinta
al DNA plasmidial, es decir, eliminar residuos orgánicos contenidos en el citoplasma de la
bacteria E. coli, como proteínas, y sobre todo concentrar por completo el DNA plasmidial
encontrado en la muestra.

Como se requería purificar el DNA plasmidial encontrado al interior de la bacteria se debió

generar una ruptura de la pared celular para poder liberar todo el contenido interno, en este
caso el proceso, llamado lisis celular, se llevó a cabo por lisis alcalina. Para generar esto se
debió someter a un ambiente propicio para llevar el proceso a cabo, mediante la adición de la
solución 1 que poseía un ambiente alcalino de pH=8.0 que prepara el medio. El EDTA
contenido en la solución 1 tenía como función inhibir la acción de las nucleasas mediante la
formación de complejos con el cofactor Mg2+ y así evitar que estas enzimas degradaran el
ADN. El Tris-HCl, que también se encontraba en la solución 1, actuaba como tampón para
evitar un cambio brusco en el pH1. Teniendo el medio propicio, la adición de la solución 2
permitió la ruptura definitiva de la membrana celular, basándose en la formación de un medio
alcalino por la adición de NaOH junto al SDS, contenidos en la misma solución 2. Esto provoco
la denaturalizacion del DNA cromosómico y el RNA. Este proceso se debió llevar a cabo ya que
lo que se deseaba purificar era solo el DNA plasmidial, por lo que los demás Ac. Nucleicos
debían eliminarse. Si bien las hebras de estos Ac. Nucleicos se separaron, debido a su
linealidad, no existía ninguna forma de que se volviesen a unir por complementariedad, no así
el DNA plasmidial, quien debido a su forma circular, al estar en contacto con esta solución no
se desnaturalizo. Si bien se separaron los puentes de hidrogeno entre hebras, al estar en un
superenrollamiento circular, seguían permaneciendo unidos en algunas zonas, por lo que al
momento de añadir el Acetato de Potasio de la solución 3 se restauró el pH y se volvieron a
formar los puentes de hidrogeno en el DNA plasmidial, no así en el resto de los Ácidos
Nucleicos, debido a su forma lineal, que al encontrarse denaturados en una solución, la
probabilidad de volverse a unir por complementariedad era mínima, y por esto se debió
someter a centrifugación para que precipiten. Por esta misma razón al hacer el práctico se
trabajó con el sobrenadante, ya que este poseía el DNA objetivo 2, 3.

Ahora, teniendo en cuenta que toda la primera parte del procedimiento se haya realizado
adecuadamente, se debería poder visualizar las bandas en el proceso de electroforesis, lo cual
no ocurrió, ya que no fue posible observar ningún tipo o indicio de banda. Esto nos lleva a
recalcar algunos de los errores que se llevaron a cabo durante el proceso. Durante la primera
parte, cuando se debía colocar la solución 2, por mal manejo de la micropipeta, la punta de
esta se cayó en el tubo que contenía el pellet. Esto podía causar que el pellet se haya quedado
en la punta de la micropipeta, dejándonos con una cantidad despreciable de DNA plasmidial.

Otro error pudo haber ocurrido al momento de recuperar el sobrenadante, el cual se realizó de
la manera incorrecta, ya que se sumergió demasiado la punta de la micropipeta, contaminando
el sobrenadante con el sedimentado.

La Adición del fenol-cloroformo, que tiene como función degradar las proteínas y volver
solubles los lípidos, formando así tres fases: la fase acuosa, donde se encuentra el DNA de
interés, una fase media donde están las proteínas y la fase más densa que se encuentra al
fondo, que contiene los lípidos de la membrana ya lisada previamente 4. Por lo tanto, la
adecuada extracción de la fase acuosa (sobrenadante), con un adecuado pipeteo, permitiría la
buena visualización en electroforesis, donde no estuviera contaminado con residuos orgánicos
en la fase inferior.
Como se mencionó anteriormente, el Acetato de Sodio permitió restaurar el pH que se había
formado para producir la lisis alcalina, llevando la solución a un pH acido de 5.1, para que se
volvieran a formar los puentes de hidrogeno entre las hebras complementarias del DNA
plasmidial. Este pH debía mantenerse adecuadamente para evitar una posterior
desnaturalización del DNA, y para esto fue que se usó el Cloroformo alcohol Isoamílico, ya que
sin este se podría haber denaturado el DNA Plasmidial si hubiesen habido cambios en el
ambiente, sobre todo cambios de pH, y no se hubiese podido visualizar en la migración por
electroforesis, ya que la solución agregada en los carriles no hubiesen contenido la muestra.

Otro influyente en la obtención del objetivo puro fue la adecuada acción del Isopropanol y del
etanol, quienes actúan precipitando los ácidos nucleicos de interés, en este caso el DNA
plasmidial, obteniéndose un pellet de él. El mecanismo de acción del alcohol es mediante la
insolubilidad del ácido nucleico en la solución, esto debido a que se genera una interacción
entre los alcoholes y el agua donde el primero pelea por los enlaces que genera el agua
alrededor del DNA, es decir, deshidrata al ácido nucleico, provocando que este precipite y se
concentre5.

En cuanto a la visualización de dos bandas en la digestión electroforética de nuestros

compañeros, una se vio más nítida que otra, aquella que migro más se observa con un color
más intenso y esto es debido a que hay más cantidad de DNA, en contraste con la banda que
migro menos que contiene menos cantidad de DNA. Estos DNA no son de distinto peso
molecular o de distinto tipo, es el mismo DNA objetivo y la distinción de 2 bandas diferentes es
producto del superenrollamiento del DNA circular, lo que quiere decir que algunos plásmidos
aparte de tener el enrollamiento común de las dobles hembras, estas se enrollan entre sí, lo
cual es producto de alguna tensión generada en la estructura, y para poder liberar aquella
tensión, las hebras tienden a generar un bucle. Como existe un superenrollamiento, el plásmido
tiende a compactarse aún más, y esta compactación genera una disminución relativa del
tamaño del DNA, observándose estos restos más compactados más abajo en la migración del
gel, viéndose más cerca del ánodo, debido a que como se genera un plásmido relativamente
más pequeño le es más fácil pasar por entremedio de los poros del gel de agarosa. Aquellos
plásmidos que tienen su estructura en una conformación más relajada, es decir, sin
superenrollamiento excesivo y sin bucles, se encuentran más cerca del cátodo ya que tienden a
simular un peso molecular más grande6.