Facultad de Química, UNAM

Bioquímica experimental (0141)

Aislamiento del plásmido.
Barrientos Cruz E., Maya Torres D., Pacheco Zacarías A., Pino Colín T.

Resumen
Se realizó el aislamiento del plásmido de células transformadas de E. coli, se obtuvo
mediante el uso de la lisis alcalina para desnaturalizar el DNA, además, se utilizó SDS como
detergente para disolver las membranas de las células y así obtener el plásmido.
Finalmente, se realizó una electroforesis para verificar si se había realizado la purificación
del plásmido usando el marcador λ HindIII.

Introducción
S​e han desarrollado un gran número de métodos de aislamiento de plásmidos. La
mayoría toma en cuenta su acomodo en el espacio entre los plásmidos circulares y
los fragmentos cromosomales lineales, así como el tamaño de ambos. Cuando los
puentes de hidrógeno entre las cadenas complementarias del DNA del plásmido
circular se rompen, ya sea por calentamiento o por un pH alcalino, las cadenas
permanecen cercanas ya que el enrollamiento entre las dos cadenas no se perturba
grandemente. En contraste, las cadenas lineales o rotas de DNA se liberan o
separan completamente. Si una mezcla de plásmido desnaturalizado y de DNA
cromosomal se renaturalizan rápidamente, ya sea por enfriamiento o al restaurar el
pH neutro de la solución, la fidelidad de la reasociación es diferente para ambas
macromoléculas. La renaturalización de los plásmidos circulares es rápida debido a
que las cadenas están próximas, mientras que las moléculas lineales de DNA se
renaturalizan menos precisamente, formando redes de DNA o agregados que
pueden ser removidos de la suspensión por centrifugación. El plásmido permanece
en la solución y puede ser precipitado con alcohol después de que el DNA
cromosomal ha sido removido.

Hipótesis

Objetivos
- Conocer los fundamentos para la purificación del DNA plasmídico y su
separación del DNA genómico.
- Realizar el aislamiento del DNA plasmídico.

Metodología
Para DNA plasmidico
Se coloco 1000μL de suspensión bacteriana, se centrifugan y se descartó el
sobrenadante, se agreguan 100 ul de Buffer 1 (Tris-HCl 50 mM, EDTA 10 mM,
RNasa A 100 μg, pH 0,0) y se agita, posteriormente se agregar 200 ul de Buffer 2
(1% de SDS, NaOH .2 M) y se agita suavemente para impedir que se pierda el DNA
plasmídico liberado producto de la lisis celular, se dejan reposar los tubos en hielo
aproximadamente 5 min y posteriormente se agregan 150 ul de Buffer 3 (acetato de
potasio 3,0 M, pH 5,5), se mezcla invirtiendo rápidamente (paso clave). Se
centrifuga y se conserva el sobrenadante al que se le agrega isopropanol , se
mezcla agitando vigorosamente y se centrifuga, se descarta el sobrenadante y se
realiza un lavado con etanol por último se agregó 20 ul de buffer TE (Tris-HCl 10
mM, EDTA 1 mM, pH 0) y se agita con micropipeta, la mezcla se vierte en tubos de
microfuga con 5uL cada uno (4 tubos).
Se coloca el contenido de los tubos en cada pozo sin digerir, doble digerido, R1 Y
R2 en el gel de agarosa, el cual fue preparado utilizando un buffer para disolver la
agarosa, un colorante que indica el frente y bromuro de etidio que se intercala entre
los surcos del DNA y produce la fluorescencia.
Resultados

*Datos obtenidos del equipo 2

Discusión de resultados
El aislamiento del plásmido está basado en la desnaturalización por pH, este
procedimiento se llevó a cabo con base en la topología del DNA plasmídico (circular
y se encuentra superenrollado) y el DNA cromosomal (menos enrollado y más
grande) a pH neutro. Al encontrarse a pH alcalino los puentes de hidrógeno se
rompen provocando que el DNA cromosómico precipite mientras que el DNA
plasmídico no se desenrolla por completo y al volver el pH a valores de neutralidad
se restablece, provocando que el plásmido quede en la solución, el propósito de
añadir isopropanol es formar puentes de hidrógeno con el agua y así conseguir que
en DNA plasmídico empiezan a interaccionar con el mismo y ya no se solubiliza. Ya
que se obtuvo en DNA plasmídico se llevó a cabo el ensayo de restricción del
plásmido utilizando las enzimas de restricción, las cuales reconocen secuencias
específicas y cortan, la restricción fue de tipo secuencial, se realizó una
electroforesis de ac. nucleicos-DNA en los pozos se colocaron de izquierda a
derecha, la muestra sin digerir, R1, R2 y el doble digerido. Se observa que para la
muestra sin digerir hay una banda la cual no avanzó mucho, esto debido a que se
encuentra el plásmido en ausencia de enzima de restricción y por lo tanto es más
grande y avanza más lento, en R1 y R2 las bandas se observan a una distancia muy
similar es to debido a que cada una contiene sólo una enzima de restricción y el
plásmido es cortado solo en un sitio en el reconoce cada enzima; por último en la
muestra a la que se le añadieron las dos enzimas (doble digestión ) se observan
dos bandas que corresponden a los corte de las dos enzimas la de mayor y la de
menor fuerza, la presencia de las dos bandas indica que en las condiciones en las
que se trabajó fueron las óptimas para que las dos enzimas pudieran cortar en su
sitio de reconocimiento, el tamaño de los fragmentos permitió que en el gel de
agarosa avanzaran más.

Bibliografía
- http://www.biotools.eu/documentospdf/LambdaDNAHindIIIMarker.esp.ed.04Marzo14.
pdf​ Consultada por última vez: Noviembre 4 de 2017.
- https://ibcmunq.files.wordpress.com/2010/03/tp4.pdf Consultada por última vez:
Noviembre 4 de 2017.
- http://www.ibt.unam.mx/sintesis/cuantificacion.html Consultada por última vez:
Noviembre 4 de 2017.
- https://bqexperimental.files.wordpress.com/2010/01/seccion5_815421.pdf
Consultada por última vez: Noviembre 5 de 2017.

Cuestionario

1. ¿Cuáles son las propiedades del DNA plasmídico que nos permiten separarlos
del DNA cromosomal o genómico?
Por topología:
- Los plásmidos tienen un pequeño tamaño en relación con el cromosoma
bacteriano.
- El ADN cromosómico de las bacterias es circular, pero al ser extraído la mayor
parte se obtiene fragmentado, en moléculas lineales.
- Los plásmidos son moléculas de ADN circular, cerrado en forma covalentes (CCC
covalently closed circular).

2. Explica por qué se usa NaOH y SDS, acetato de potasio y etanol en la

purificación de plásmidos.
NaOH: Desnaturalizan por completo las moléculas lineales de ADN, pero no las moléculas
CCC (las cuales sufren una desnaturalización parcial)
SDS: Es un detergente iónico que altera membranas celulares y desestabiliza uniones
hidrofóbicas.
Acetato de potasio: El acetato de potasio neutraliza el NaOH y cuando el pH vuelve a ser
casi neutral, se vuelve a renaturalizar el DNA plasmídico.
Etanol:​ Concentra el DNA purificado por el cambio de polaridad del medio y lo precipita.

3. ¿Cuáles son los principales contaminantes de una preparación de plásmidos?

Existen contaminantes que se pueden encontrar en las preparaciones de DNA, tales como
otras proteínas, el fenol, el cloroformo, el etanol, el EDTA, el SDS y la alta concentración de
sales.

4. ¿Cómo los eliminas?

Los efectos de la contaminación pueden disminuir si se aumenta la cantidad de enzima
añadida a la reacción, arriba de 10 a 20 U /µg DNA, incrementando el volumen de reacción,
lo que diluye a los inhibidores potenciales, o aumentando la duración de la incubación.

5. ¿Cuáles son los usos que se le dan a los plásmidos una vez purificados?
Los plásmidos poseen un interés singular en la Ingeniería Genética por ser uno de los
sistemas vectores más sencillos de usar, el vector de clonación el cual es un sistema que
permite introducir en una célula hospedera un fragmento de DNA que se pretende clonar
(obtener múltiples copias); en esta célula hospedera el vector se replica y se expresa.

6. ¿Cuáles son los métodos utilizados para cuantificar los ácidos nucleicos?
- Los ácidos nucleicos absorben eficientemente luz ultravioleta debido a la
presencia de bases aromáticas nitrogenadas a lo largo de las cadenas de
DNA. La absorción de Uv de DNA es una característica de la molecula, que
es usada eficientemente para determinar su concentración

7. ¿Qué experimento realizarías para determinar si el plásmido que obtuviste se

encuentra puro?
 8. ¿Porqué a veces es necesario utilizar RNAasa para visualizar el DNA
plasmídico?
Se utilizó RNAasa para eliminar posibles restos de ARN en la muestra así como para la lisis
celular

9. Busca el factor de conversión de pares de bases a número de aminoácidos y

de número de aminoácidos a peso molecular de proteína en kDa.

La longitud de los ácidos nucleicos extensos se expresa en kilobases (símbolo: kb, 1 kb

equivale a 1x10​3 bases) o en megabases (símbolo: Mb, 1 Mb equivale a 1x10​6 bases). La
longitud de los ácidos nucleicos bicatenarios se expresa usualmente en «pares de bases»
(símbolo pb o, en inglés, ​bp​). La masa de un ácido nucleico, expresada en daltons (Da), se
obtiene multiplicando el número de bases por 309 (o el número de pares de bases del ácido
nucleico por 618)​.