Universidad de Chile

Facultad de Ciencias

Laboratorio de Bioquímica y Biología Molecular

Pedagogía en Educación Media en Biología y Química

Laboratorio N°4:
“Extracción simple de DNA y electroforesis”

Integrantes:

 Colilaf Caro, Camilo Augusto

 Venegas Martínez, Katalina Victoria

Profesores:

 Dr. Ricardo Cabrera

 Dr. Víctor Castro

Ayudantes:

 Alonso Fariña
 José Acevedo

Miércoles 2 de mayo, 2018

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 INTRODUCCION

“El ácido desoxirribonucleico o DNA, es la sustancia química responsable de la transmisión de la

información hereditaria” (H.H.M. Villafañe, 2008), además, es a partir de una sección (gen) de esta
macromolécula que se codifica la información necesaria para la síntesis de las proteínas en un
organismo. Gracias al proceso de replicación del DNA es que esta información se transmite de célula
en célula.

El DNA es una macromolecula o polímero, el cual se

C5’ encuentra formado por una unidad monomérica llamada
nucleótido; a su vez, esta unidad posee diferentes
componentes; dentro de ellos podemos encontrar una
pentosa desoxirribosa, una base nitrogenada que puede
C3’ ser adenina, timina, guanina o citosina; y por último un
grupo fosfato en posición 5’ de la pentosa (ver figura 1).
Los nucleótidos se unen entre si mediante enlaces
fosfodiéster, los cuales se producen mediante un ataque
nucleofílico del oxígeno del grupo hidroxilo del carbono 3’ al fosforo del grupo fosfato del carbono 5’, y
de este modo se va formando una larga cadena de nucleótidos (polimerización).

La estructura del DNA fue establecida “hace más de cincuenta años […], se publicó una nota firmada
por James Watson y Francis Crick en la revista Nature, cuyo título era ≪Estructura molecular de los
acidos nucleicos: una estructura para el ácido desoxirribonucleico≫. Sus autores describían un modelo
de ADN con dos cadenas antiparalelas helicoidales y apareamiento por bases complementarias” (F. B.
Villa A. P. Barbero, 2004), y es este el modelo que rige, hasta el día de hoy, la estructura de esta
macromolécula; una doble hélice compuesta por dos hebras polinucleótidas antiparalelas – una va de
5’ a 3’ y la otra de 3’ a 5’ – cuyas bases interaccionan mediante enlaces de hidrogeno según una
complementariedad de bases (A con T y C con G).

Dentro de la célula, ya sea dentro del núcleo para eucariontes, o en el citoplasma para procariontes, el
DNA se encuentra empaquetado – gracias a la ayuda de proteínas llamadas histonas – en estructuras
mas compactas llamadas cromosomas.

Actualmente existen diferentes formas de detectar la secuencia de bases que determinan la función del
DNA en cada individuo; gracias a esto es posible el diagnostico de diferentes enfermedades o bien
conocer a nivel genético la relación a nivel evolutivo entre las diferentes especies. Una de las formas
de conocer la secuencia del DNA es la extracción de este mediante una serie de pasos. En primer
lugar, se debe “triturar el tejido, rompiendo las células, luego se debe separar el DNA de la fase lipídica
y de las proteínas que se asocian a este” 1, finalmente se debe usar el método de centrifugación para
separar las fases y también se debe hacer uso de un solvente que afecte la solubilidad del DNA, de
modo que este pueda precipitar.

La electroforesis es uno de los métodos mas utilizados para realizar este análisis, el cual consiste en
“una técnica de separación de moléculas en una mezcla por aplicación de un campo eléctrico. Las
moléculas disueltas se desplazan o migran en un campo eléctrico a una velocidad determinada por su
relación carga:masa” (H. Lodish, 2005). Para el caso del DNA, el cual posee una carga
mayoritariamente negativa, por la presencia de los grupos fosfato migrará hacia el electrodo positivo,
donde los fragmentos más pequeños migrarán más rápido que de gran tamaño.

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 OBJETIVOS

 Determinar el efecto de la concentración de etanol sobre la solubilidad del DNA

 Determinar el efecto del tamaño molecular en la migración electroforética
MATERIALES Y METODOS
Se procedió de acuerdo con lo especificado en la guía de laboratorio (Departamento de biología, 2018)
RESULTADOS BRUTOS

Tabla 1. Contenido específico de cada tubo con los respectivos resultados cualitativos que se lograron observar durante
la experiencia de laboratorio

Tubo 1 2 3 4 5
Alcohol (%) 20 40 60 80 95
Solución de extracción (mL) 8,2 8,2 8,2 8,2 8,2
Resultados inmediatos 0 0 0 0 0
Resultados tras 5 minutos 0 0 x x x
0=no ve se observa precipitado x=se observa presencia de precipitado

1 2 3 4 5

Figura 2. Fotografías de cada uno de los tubos con una alícuota de 2mL del sobrenadante obtenido luego de la
centrifugación con alcohol a diferentes porcentajes de concentración.

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 Figura 3. Fotografía de los resultados obtenidos en la electroforesis a voltaje 100 mV con gel de agarosa al 1% en buffer
TAE (Tris, EDTA y Acetato) que corrió durante 1 hora. (1) Standard de peso molecular. (2) y (3) DNA genómico
fragmentados. (4) Plásmido pET (expresión de genes en procariontes). (5) y (10) Plásmido pTrc (expresión de genes en
bacterias. (6) y (11) Plásmido pPICZ (expresión de genes en levaduras). (7) y (12) Plásmido pFA6 (expresión de genes
en levaduras. (8) PCR usando partidores adyacentes al ORF del gen pgi de E. coli silvestre. (9) PCR usando partidores
adyacentes al ORF gen pgi de E. coli ∆pgi. (13) Plásmido pET y (14) Standard de peso molecular.

ANALISIS DE RESULTADOS

Al realizar el procedimiento de acuerdo con lo indicado en la guía de laboratorio, se trituró la frutilla y

se le añadió una solución de extracción, la cual consistía en una mezcla de 0,15g de cloruro de sodio
y 1 mL de lavaloza diluido en 10mL de solución; para el caso de la frutilla utilizada, la cual masó 20,41g
se le agrego 8,2mL de solución de extracción, ya que se indicaba que por cada 25g de muestra se
añadían 10mL de solución de lavaloza. Al realizar la trituración de la fruta en conjunto con el lavaloza
se obtuvo una pasta homogénea y sin grumos.

Posteriormente, al realizar la centrifugación, se consiguió un sobrenadante de color rosa pálido y un

poco turbio. Dicho sobrenadante fue filtrado y distribuido en 5 tubos de ensayo, a los que (ver tabla 1)
se les añadió alcohol con diferentes porcentajes; lo primero que se logró observar fue que ambos
componentes no se mezclaban entre sí, sino que se generaban dos fases, en las cuales el alcohol
quedaba por encima del sobrenadante.

Luego de dejar reposar los cinco tubos en un baño de agua-hielo se observó una interfaz de color
blanco – la cual corresponde al DNA extraído – entre el alcohol y el sobrenadante en los tubos que,
esta interfaz fue más notoria en los tubos que contenían alcohol a mayores %, es decir, en los tubos 3,
4 y 5.

En cuanto a la electroforesis realizada (ver figura 3) lo primero que se debe mencionar es que el gel de
agarosa no corrió hasta el final; en este marco de condiciones las muestras (2) y (3), las cuales
corresponden a DNA genómico fragmentado no presentaron señal. Esto puede deberse a dos factores:
el primero de ellos es que su peso molecular haya sido demasiado elevado y, por ende, no ocurrió
desplazamiento de la banda. La otra opción es que, por el contrario, el tamaño de la muestra fue tan
pequeño, que se desplazó por todo el gel antes del tiempo definido; por ende, no se observó en los
“parámetros” de la placa.
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En relación con las otras muestras de DNA, se puede concluir que:

 Las muestras 4, 5 y 10 presentan una cantidad de pares de bases similares: siendo bastante
poco preciso, podríamos decir que el tamaño va en el orden de los 3000 pares de bases, siendo
este valor el máximo del marcador de peso molecular. A simple vista se puede definir que estas
bandas son las de mayor peso molecular.
 Las muestras 6 y 11, pese a que en el caso de la N°6 no se observa banda alguna,
probablemente debiesen presentar un tamaño idéntico, puesto que ambas bandas pertenecen
a la misma muestra. Se observa en el caso de la banda 11, un múltiple desplazamiento. Esto
puede deberse a que esta muestra presentaba más de algún sitio de corte, entonces
considerando que estas muestras son de DNA plasmidial, es entendible pensar que se genere
más de un fragmento, con evidente diferencia en el tamaño de los pares de bases.
 En relación con las muestras 8 y 9 se observa una clara diferencia entre los tamaños de los
fragmentos: esto puede deberse principalmente a una distinción muy notoria entre las
secuencias de inicio y de término que presentan dos cepas distintas de una misma bacteria
(wild type y otra cepa definida como “Δpgi”, ambas de E.coli) . Si la distancia entre inicio y
término de la banda es muy cercana, la cantidad de pares de bases que tendrá el fragmento
será sustancialmente menor. Se puede observar a simple vista que la muestra 9 es la que posee
menor tamaño de todas las muestras, posiblemente con un tamaño de entre 700 a 1400 pares
de bases.
 De forma análoga a lo ocurrido en la banda 11, en las bandas 7 y 12 podemos observar dos
zonas de desplazamiento: nuevamente, lo más lógico es que se añadieron 2 zonas de corte
que produjeron una variación en el tamaño de los fragmentos de DNA plasmidial generado, y
esto a su vez provocó las dos zonas marcadas para cada banda.
 En el caso 13, se observa que posee un desplazamiento similar al de los otros DNA plasmidial.
Esto nos puede indicar que, independiente del tipo de organismo que utilice DNA plasmidial, la
cantidad de pares de bases suele ser bastante conservada.

De haberse realizado la electroforesis el tiempo correspondiente, se hubiese podido calcular el Rf, que
es la relación que existe entre el desplazamiento de cada banda de cada muestra, respecto al
desplazamiento del gel puro. Bajo este concepto, la muestra que hubiese tenido un Rf más cercano a
la unidad habría sido el 9, quien posee un tamaño mucho más bajo en relación a las otras muestras.
Por el contrario, los valores más altos hubiesen sido los de las muestras 4, 5, 10 y 13, debido a que
fueron aquellas que presentaron menor desplazamiento por su alto peso molecular.

DISCUSIÓN

Durante la experiencia de laboratorio se realizaron diferentes acciones y además en la mezcla de

extracción se adicionaron diferentes componentes, cada uno con un fin es especifico.

Como ya fue mencionado, en células eucariontes el DNA se encuentra al interior del núcleo, y además
se encuentra asociado a proteínas (histonas), las cuales lo mantienen compactado; es por esto que es
preciso aislar al DNA de la membrana plasmática y de la envoltura nuclear para poder extraerlo. Para
este finde fue necesario triturar la fruta, ya que de este modo de destruye el tejido celular y se hace
posible remover la membrana.

La solución de extracción preparada contenía detergente, cloruro de sodio y agua. El primero permite
romper las la bicapa lipídica de la membrana plasmática, deshaciendo las uniones que existen entre

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ambas capas de fosfolípidos, y de este modo separa la membrana. La sal ayuda a cambiar la solubilidad
del DNA, ya que, como este posee caga negativa debido a los grupos fosfatos que rodea a la hélice,
es soluble en agua, de modo que, si se le añade una sal, en este caso NaCl, las nubes negativas del
DNA comienzas a interactuar con los cationes Na+, impidiendo que el agua establezca puentes de
hidrogeno con los oxígenos de los grupos fosfatos de los nucleótidos.

Al igual que la sal, la adición de etanol ayuda a anular la solubilidad del DNA. Como ya se mencionó el
DNA es una molécula polar, al igual que el etanol, pero la reacción con este a bajas temperaturas hace
que se vuelva apolar e insoluble en el etanol formando un precipitado justo entre la capa de etanol y el
sobrenadante. El DNA es el único componente de la solución que no es soluble en el etanol. También
hay que considerar que etanol puede establecen enlaces de hidrogeno con el agua, y de este modo
disminuyendo el número de moléculas de agua disponibles para hidratar al DNA. El alcohol es menos
denso que el agua del extracto y por eso “flota” sobre la capa del sobrenadante.

La centrifugación de la pasta obtenida es necesaria para dejar al ADN difundido en una capa de la
solución por encima del exceso de material más pesado, como restos membrana o proteínas que
pudieron estar asociadas al DNA.

¿Qué resultado hubiera obtenido si hubiera usado pisco frio en ligar de una solución de etanol?
Considerando que el pisco posee de 30 a 50% de alcohol etílico o etanol; si realizáramos la extracción
utilizando este componente frio el resultado no sería muy notorio, ya que según los resultados obtenidos
en este laboratorio la extracción es efectiva agregando alcoholes con un % entre el 60 y el 95%.

Para reconocer la presencia de proteínas se podría realizar el test de Biuret, el cual se basa en la
reacción coloreada del reactivo de Biuret, se “produce un complejo de color purpura al reaccionar con
una solución alcalina de sulfato de cobre. Los péptidos y proteínas reaccionan con el relativo de Biuret.
Los iones cúprico forman un complejo de coordinación con los pares de electrones no compartidos del
nitrógeno” (A.Guarnizo y P. Martínez, 2009). presente en los enlaces peptídicos de los aminoácidos
de la cadena principal de una proteína.

CUESTIONARIO

1. ¿Todas las células contienen DNA? Investigue casos de las células del cuerpo humano

Existe un solo tipo de células en el cuerpo humano (y en general, en los mamíferos) que no poseen
DNA: estos son los eritrocitos 7. Esto se debe a que básicamente la célula que le precede, a nivel de
desarrollo celular (normoblasto) sufre un proceso de contracción de un anillo de actina que actúa en
el núcleo, lo que produce una externalización de este, logrando que sea devorado por macrófagos.8

2. Investigue sobre la miniprep como método de purificación de DNA. Compare con el

procedimiento llevado a cabo por usted en este laboratorio.

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Ambos métodos presentan más diferencias que similitudes entre sí (en esta pregunta consideramos no
añadir un método de “miniprep”, puesto que no es requerido como tal). La primera diferencia la
podemos hallar en el principio mismo de cada evento. Mientras que en el práctico recién realizado el
primer paso fue moler la fruta en cuestión (mientras en paralelo se prepara la solución de lavalozas, sal
y agua desionizada), para el caso de la “miniprep” se parte bajo la premisa que se trabajará con DNA
plasmidial, por lo que se toma un cultivo bacteriano y se somete a centrifugación. Luego, para este
mismo método, se desecha el sobrenadante y luego se somete al precipitado a una solución que
contenga EDTA,Tris y Glucosa. Por otro lado, en el método empleado por nosotros, mientras se muele
la fruta se vierte el contenido de la solución de lavaloza, sal y agua destilada. A pesar de esto, de igual
forma en este método se aplica una centrifugación y se utiliza el precipitado. Aquí nuevamente
encontramos diferencias sustanciales: mientras que en el práctico realizado por nosotros se añadió a
tubos separados con igual cantidad de precipitado, etanol en distintas concentraciones, en el método
“miniprep” se añade SDS y NaOH, y luego CH3CO2K (lisar las células y eliminar agentes contaminantes,
respectivamente). En este punto ya se finaliza todo procedimiento realizado por los estudiantes. Sin
embargo, en el método miniprep aún quedan pasos: uno de ellos consiste en provocar la precipitación
del DNA plasmidial, de forma símil a la realizada por nosotros: añadiendo cierto volumen de etanol,
claro que con la salvedad que también se debe añadir una sal. 9

CONCLUSIONES

 Fue posible determinar el efecto de la concentración de etanol en la obtención de DNA: a

mayor concentración, mayor es la cantidad de DNA que debe obtenerse. Claro está que, a
modo general, no obtuvimos mucho DNA de nuestros tubos.
 Fue posible determinar el efecto del tamaño molecular en relación a una electroforesis: a
mayor tamaño, menos se desplaza un fragmento de DNA hacia la zona del electrodo positivo
 Se logró entender el principio del funcionamiento de una electroforesis, para así poder
ocuparla a futuro
 Se lograron conocer no un método, sino dos, a la hora de obtener DNA: uno aplicable para
frutas (el realizado en el práctico), y otro aplicable para bacterias y la obtención de DNA
plasmidial (miniprep).

BIBLIOGRAFIA

(1) Dr. Ricardo Cabrera/Dr. Víctor Castro. (2018). Guía de Laboratorio: Curso de Química Biológica.
Universidad de Chile.

(2) Nelson, D. L., Lehninger, A. L., Cox, M. M., & Cuchillo Foix, C. M. (2001), Ed. 3. Lehninger principios
de bioquímica. Barcelona: Omega.

(3) Hugo Humberto Montoya Villafañe. (2008). Microbiología básica para el área de la Salud y afines.
Colombia: Universidad de Antioquia.

(4) Fernando Bejar Villa/ Andrés Peñalosa Barbero. (2004). Traducción: ADN. Cambios en la ciencia y
en la sociedad. España: Akal. S.A.

(5) H. Lodish/A. Berk/P. Matsudaira/C. Kaiser/M. Krieger/M. Scott/S. Zipursky/J. Darnell. (2005).
Biología Celular y Molecular. Argentina: Editorial Medica Panamericana.

(6) Anderson Guarnizo F./ Pedro N. Martínez. (2009). Experimentos de Química Orgánica. Con
enfoques en ciencias de la vida. Colombia: Elizcom.
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(7) Solomong,E. , Berg L., Martin,D.. (2013). Las células sanguíneas rojas transportan oxígeno. En
Biología(pp 941). México: Cengage Learning.

(8) Carr,C. (2008). How red blood cells nuke their nuclei. Whitehead Institute News Archive

(9) Ríos Velázquez, Rivera, López. (-). Laboratorio de Genética de Bacterias . Puerto Rico: Universidad
de Puerto Rico.