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Práctica N°14: Aislamiento de Ácidos Nucleicos Microbianos

1. Procedimiento a seguir para obtención de DNA microbiano.

 6 mL de Cultivo de Bacillus.
 Resuspender en 780 μL de Solución Salina Citrada (SSC).
 Agregar 26 μL de Lisozima e incubar por 1 hora a 37°C. [Realizado en por el personal del
laboratorio sin intervención de los alumnos]
 Agregar 187 μL de SDS e incubar por 5 minutos a 80°C.
 Agregar 20 μL de Pronasa y 5 μL RNAsa e incubar por 40 minutos a 37°C
 Colocar 1 mL de Cloroformo-Alcohol Isoamílico a un tubo de 2 mL y agregar 1 mL de
Lisado celular. Centrifugar a 14 000 rpm por 3 minutos.
 Colocar 750 μL de Isopropanol a un tubo de 2 mL y agregar aproximadamente 1 mL de Fase
Acuosa y centrifugar a 14 000 rpm por 2 minutos.
 Descartar Sobrenadante y agregar 1 mL de Etanol 70°. Centrifugar.

2. Observaciones.

 En las primeras centrifugaciones exclusivamente con solución salina citrada (SSC), se


eliminó el sobrenadante para quedarse con un concentrado de células.

 Tras la agregación de cloroformo y alcohol isoamílico al 4% se separaron dos fases, la


fase acuosa con el DNA y el pellet con las proteínas precipitadas. (Imagen 1.)

Imagen 1.
 Tras la separación de la fase acuosa producto del agregado de cloroformo y alcohol
isoamílico (varias veces) se agregó etanol absoluto frío de 2 a 4 veces el volumen,
apareciendo así el DNA en forma de hilos o masa mucosa (dependiendo de la cantidad
de DNA, que es precisamente aquella masa viscosa).
 Se debió posteriormente cuantificar el DNA a través de espectrofotometría, donde cada
unidad de absorbancia equivaldría a 50 ng/mL como concentración de DNA nativo.
Esta lectura se haría a 260nm, mientras que para poder comprobar pureza del DNA se
realizaría una lectura a 280nm buscando la contaminación proteica.

3. Recomendaciones.

 Utilizar guantes y mascarilla a la hora de manipular las muestras y soluciones a agregar,


así se evita la contaminación por células, proteínas y DNA de origen humano.

 Evitar hablar mientras se realiza el protocolo, así como realizarlo en corrientes de aire,
puesto que el movimiento de la masa de aire puede traer consigo microorganismos del
ambiente y otros contaminantes.

 Contrastar los resultados al espectrofotómetro a 260 y 280 nm para confirmar la


cantidad de DNA extraído y la contaminación de mismo.

4. Conclusiones.

 Se puede aislar DNA microbiano si se puede lisar la pared y membrana, eliminar las
proteínas y ácidos ribonucleicos, esto con ayuda de agentes químicos, bioquímicos o
físicos, representados por las soluciones agregadas, el cloroformo-alcohol isoamílico,
las enzimas como la pronasa o la ribonucleasa pancreática y la centrifugación.

 Para ahorrarse un paso, es importante el uso de Pronasa, puesto que esta y la RNAsa
pueden trabajar a la misma temperatura.

 La presentación física desde la cual se recoge el DNA microbiano es una sustancia


mucosa que puede semejar hilos pegajosos de haber una baja concentración de DNA en
la extracción.

 La cuantificación del DNA extraído, así como la medición de su pureza, nos da


información muy importante para verificar la viabilidad de posteriores pruebas como
una PCR o una electroforesis.