PRÁCTICA No.

1
EXTRACCION DE ADN (Saccharomyces cerevisiae y homo sapiens sapiens)
Hernández, D .- Marín, D.
Facultad de Ciencias Básicas - Facultad de Medicina Veterinaria.
Universidad Santiago de Cali - Sede Pampalinda.

RESUMEN

El ácido desoxirribonucleico codifica información genética característica de los diferentes seres vivos y su obtención es el punto de partida
para los análisis genéticos/moleculares. En este laboratorio de genética y biología molecular se realizó la extracción de ADN mediante
muestras como lo fue la levadura activa seca y muestra sanguínea del ser humano, mediante una serie de pasos específicos para un
resultado final correcto, para ello también dio uso a materiales, insumos y equipos estériles lo cual ayudo a una mejor obtención de ADN
purificado.

Palabras Claves: genética, análisis, biología molecular, estériles.

que se puede precipitar con etanol frío o isopropanol y recuperar

INTRODUCCIÒN.
La molécula de ADN está constituida por una doble cadena en la
que cada una de sus hebras está formada por uniones covalentes
sucesivas entre un azúcar (desoxirribosa) y una molécula de
fosfato. Cada azúcar de las dos cadenas se encuentra unido a
una de las 4 bases nitrogenadas adenina (A), guanina (G),
citosina (C) y timina (T). (Martínez-Frías, M.L.2010).
La extracción o aislamiento del ADN es un proceso que se realiza
para recoger material genético (ADN) para posteriores análisis
moleculares. Es uno de los primeros pasos en muchos procesos
diagnósticos utilizados para detectar la presencia de bacterias o
virus ambientales, así como para experimentos y diagnósticos de
enfermedades y anomalías genéticas. (Instituto Aragonés de
Ciencias de la Salud, 2012). El propósito del aislamiento del ADN
es separar el material genético de todos los componentes
celulares (agua, iones orgánicos, aminoácidos, nucleótidos,
lípidos, proteínas y RNA para obtener una separación
homogénea de ADN que represente toda la información genética
contenida en la célula. La aplicación de las diferentes técnicas
moleculares empleadas en la biología molecular para el análisis
del genoma, depende en gran medida de la habilidad del
investigador (Velazco, 2005). La calidad del ADN constituye un
elemento crucial, la cual necesita un método de extracción lo más
estandarizado posible con el que se obtenga un ADN puro, no
degradado, libre de ARN y de inhibidores de la reacción en
cadena de la polimerasa ya que cambios en la pureza afectan los
perfiles de amplificación y esto se manifiesta en la presencia de
bandas falsas y en la poca reproductibilidad del ensayo (Fraga et
al., 2005)
La extracción de ADN requiere una serie de etapas básicas. En
primer lugar, se debe romper la membrana plasmática para poder
acceder al núcleo de la célula, y posteriormente romperse la
membrana nuclear para dejar libre el ADN. Además, de proteger
el ADN de enzimas que puedan degradarlo. La lisis de las células
se consigue mediante la adición de tampones con
concentraciones elevadas de iones que ayudan a romper la
estructura tridimensional de macromoléculas como las proteínas
y que forman parte de su estructura celular. La adición de un
detergente como el SDS (Dodecil Sultato Sódico) es necesaria a
menudo para eliminar las membranas. El ADN se encuentra
asociado a proteínas, por lo que se suele añadir proteasas al
tampón de extracción, a la vez que el acetato potásico para
precipitar dichas proteínas. El ADN es insoluble en alcohol, por lo
mediante un proceso de centrifugación. El sedimento o pellet
resultante se puede resuspender posteriormente en agua o
tampón tras ser secado completamente. La confirmación de la
presencia de ADN se lleva a cabo mediante la técnica de
Electroforesis. (Tuya, 2016)
Esta práctica tuvo como objetivo principal efectuar e identificar los
pasos necesarios para la extracción de ADN de levadura y ADN
genómico, además de adquirir experiencia en el manejo de
equipos y reactivos utilizados en el laboratorio de Genética y
Biología molecular.
MATERIALES.
1 Balanza analítica,1 microcentrifuga,1 baño Maria,1 Baño de
hielo,1 tubo Eppendorf de 2mL, 10 tubos Eppendorf de
1.5mL,gradilla para tubos eppendorf, 1 Micropipeta de 100-1000
µL con puntas,1 Micropipeta de 10-100 µL con puntas,1 Mortero
con mazo, 1 Vidrio reloj, 1 Microespátula, 1 Vortex, servilletas.
Reactivos: EDTA 0,5M, Tris-HCl 50 Mm EDTA 20 Mm pH 7,4,
SDS 10%, Acetato de Potasio (KAc) 5M, Isopropanol FRIO,
Etanol al 70% y 95% FRIO, Agua grado biología molecular, Buffer
de lisis TSNT (2% Tritón 100X, 1% SDS, 100mM NaCl, 10mM
Tris-HCl pH:8.0), Fenol saturado con Tris-HCl pH:8.0 Sevag
(Cloroformo: alcohol isoamilico, 24:1), Etanol 100% y al 70%,
Buffer TE 1X (10mM Tris-HCl pH:8.0, 1mM EDTA).
METODOLOGÍA 1.
Saccharomyces Cerevisiae: Inicialmente se tomaron 200mg de
levadura activa seca en un mortero y se le añadió 2ml de solución
EDTA 0.5M para macerarlo hasta homogenizarlo totalmente,
luego, en un tubo Eppendorf se tomó 1ml de la anterior
maceración y se centrifugó a 8000rpm durante 10 minutos,
pasados los 10 minutos sacamos el tubo de la centrifuga y
eliminamos el sobrenadante para resuspender el precipitado en
0.5ml de Tris-HCL-50 mM, EDTA 20 Mm, seguido de esto, se
añadió 50μL de SDS al 10%, en este momento debíamos incubar
en baño maría a 65°C por 30 minutos sin embargo saltamos este
paso e inmediatamente añadimos al precipitado 200μL de acetato
de potasio (KAc 5M), esto generó una capa de líquido
blanquecino en la zona superior del tubo e inmediatamente se
llevó a baño maría a 65°C por 30 minutos y luego a baño en hielo
por otros 30 segundos, pasado este tiempo se tomó el tubo con
el precipitado y se llevó a la centrifuga por 5 minutos a 13000rpm,
pasados los 5 minutos tomamos el tubo de la centrifuga y
trasladamos el sobrenadante a otro tubo Eppendorf, el
sobrenadante que anteriormente se trasladó se llevó a la
centrifuga a 13000rpm por 5minutos esto con el fin de eliminar
impurezas, pasado el tiempo correspondiente, se trasladó
nuevamente el sobrenadante a otro tubo Eppendorf para trabajar
con lo obtenido en el primer tubo, se añadió 500μL de isopropanol
frio y se incubo por 5 minutos a temperatura ambiente agitando
suavemente el tubo, seguido de esto, se llevó el tubo a la
centrifuga a 13000rpm por 10 minutos, pasados los 10 minutos se
saca el tubo y se descarta el sobrenadante obtenido, luego se
agregó 500μL de etanol al 95% frio y se homogenizó para
posteriormente centrifugarlo a 13000rpm por 5 minutos, luego de
que paso el tiempo correspondido se descarta nuevamente el
sobrenadante obtenido y se deja secar el precipitado a
temperatura ambiente por 3 minutos aproximadamente,
finalmente se agregó al precipitado 50μL de agua grado biología
molecular (libre de DNAsa) y se conservó a -20°C hasta el
próximo uso.
METODOLOGÍA 2.
ADN genómico (homo sapiens sapiens): Inicialmente se
obtuvo la muestra en tubo anticoagulante mediante punción
venosa minutos antes de iniciar el laboratorio. Se dio inicio al
procedimiento colocando 500μL de la sangre obtenida en un tubo
Eppendorf de 2ml, luego se le agregó 200μL de TSNTE y se
mezcló con el vortex durante 30 segundos, pasados los 30
segundos se agregó 500μL de fenol y se mezcló nuevamente con
el vortex durante 30 segundos, pasado este tiempo, se agregó
100μL de SEVAG y se mezcló una vez más con el vortex durante
1 minuto, pasado este tiempo se agregó 200μL de TE 1x y se
mezcló nuevamente con el vortex por 30 segundos, posterior a
esto se llevó la muestra a la centrifuga por 5 minutos a 13000rpm
muestra de la centrifuga y se recuperó (separó) la fase acuosa
(fase superior transparente) en un tubo Eppendorf de 1.5ml para
trabajar con ella, luego al tubo con la fase acuosa se le agregó
1ml de isopropanol al 100% frio y se mezcló suavemente por
inversión hasta que se observó la precipitación del ácido nucleico,
seguido de esto, se llevó a centrifugar por 5 minutos a 1300rpm
para empastillar en el fondo del tubo el ADN, pasados los 5
minutos se sacó el tubo y se descartó el sobrenadante con
cuidado de no tirar la pastilla de ADN de la parte inferior del tubo,
luego de esto, se agregó por las paredes del tubo 500μL de etanol
al 70% para lavar la pastilla de ADN y se mezcló suavemente sin
resuspender la pastilla, seguido de esto se llevó a centrifugar el
precipitado a 13000rpm durante 5 minutos para posteriormente
descartar el sobrenadante con cuidado nuevamente de no tirar la
pastilla de ADN, luego, se dejó secar unos segundos y se le
añadió 100μL de TE 1x (o de H2O libre de nucleasas), seguido
de esto se llevó al vortex durante 30 segundos para disolver la
pastilla de ADN con la solución del tubo y finalmente se rotuló el
tubo del ADN para guárdalo a -20°C y observarlo en la siguiente
práctica.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Saccharomyces Cerevisiae: Es una levadura que constituye el
grupo de microorganismos íntimamente asociado al progreso y
bienestar de la humanidad; su nombre deriva del vocablo
Saccharo (azúcar), myces (hongo) y cerevisiae (cerveza)
(Hernandez, 1999) . Es una levadura heterótrofa, que obtiene la
energía a partir de la glucosa y tiene una elevada capacidad
fermentativa (Querol, 2003).
En el primer paso se obtuvo una mezcla homogénea de levadura
activa seca y EDTA 0.5M (Figura1), este reactivo es el
responsable de proteger los ácidos nucleicos inactivando a las
DNAsas o RNAsas, logra esta inactivación actuando como
quelante de cationes divalentes como el Ca2+ y el Mg2+ los
cuales son indispensables para el funcionamiento de las enzimas
citadas. (SOPs, 2001). El siguiente paso dio como resultado un
tubo eppendorf en donde se observó en la parte superior una
solución liquida transparente y en la zona inferior una solución
solida color amarillo (ver figura 2), la solución liquida transparente
se pasó a otro tubo y se le añadió 0.5ml de Tris-HCl 50 Mm EDTA
20 Mm pH 7,4, con el fin de estabilizar el pH de la solución para
poder trabajarla. Enseguida se le agregó el reactivo SDS al 10%,
que cumplió la función de detergente aniónico y solubilizó los
lípidos y proteínas, y desestabilizó la estructura de la membrana
celular (Rocha, 2002), (a nivel visual no se obtuvo cambio en la
solución).El siguiente punto consistió en dejar en baño maría a
65°C la muestra por 30 minutos, sin embargo, se saltó este paso
e inmediatamente se le agregó el reactivo de Acetato de potasio
(Kac) lo cual dio como resultado adelantado la precipitación de
proteínas, la muestra dentro del tubo se observó blanquecina en
la zona superior (Ver figura 3) posteriormente se fue mezclando
hasta volverse toda la solución de color blanco. El acetato de
potasio posibilita la extracción de ADN en menor tiempo, con
elevada concentración, rendimiento y pureza (Fraga, 2004), sin
embargo, el error del adelanto de este paso no fue de mucha
importancia a la hora del resultado final. El siguiente paso fue
dejar la muestra en baño maría durante 30 segundos lo que
permitió la incubación de la muestra dentro del tubo eppendorf.
Luego la misma muestra se dejó en baño de hielo por 30
segundos con el fin de mantener el ADN intacto durante el
proceso de extracción. Seguido de esto se centrifugó la muestra,
en este punto se obtuvo la separación de las partículas por la
diferencia en la velocidad de sedimentación a causa de la
diferencia de masa de cada una. Se trasladó el sobrenadante a
otro tubo eppendorf y este sobrenadante se centrifugó por 5
minutos para eliminar impurezas que hayan quedado del
precipitado anterior, luego, se agregó isopropanol frio. El
isopropanol es un líquido transparente, volátil e incoloro
empleado para extraer y disolver lípidos, (Hernandez, 2007) Este
dio como resultado la precipitación del ADN ya que compite con
este por el agua, deshidratándolo y llevándolo al fondo del tubo
(ver figura 4). Posteriormente se centrifugo la anterior muestra, y
se descartó el sobrenadante, debido a que fueron los residuos o
impurezas obtenidas. Al pellet del material genético obtenido al
final del tubo se le agregó etanol al 95%, este es utilizado para
purificar y/o concentrar el ARN, el ADN y polisacáridos (Zeugin,
1985). Posteriormente se llevó a centrifugar la muestra anterior y
el sobrenadante obtenido se descartó nuevamente para dejar
secar el precipitado (pellet) a temperatura ambiente, esto con el
fin de que se seque o absorba todo el etanol restante, (Ver figura
5) finalmente se agregó 50μL de agua de grado biología molecular
(libre de DNAsa) al precipitado final y se conservó a -20°C hasta
su próximo uso. El agua para biología molecular se utiliza para la
preparación de tampones, purificación de ADN/ARN,
secuenciación y bibliotecas de ADN, ADN recombinante,
clonación y mapeo genético. (Bermúdez 2022).
El resultado final de la extracción de ADN de levadura
(Saccharomyces Cerevisiae) fue un tubo eppendorf con el
material genético (punto blanco) adherido a la parte inferior del
tubo y sobre esto el agua ultra pura que conserva la muestra.
(Ver figura 6)
Figura 1: Mezcla homogénea de levadura activa seca (200mg) y EDTA
0.5M (2ml) – Elaboración propia.
Figura 2: 1-Solucion liquida transparente (fase acuosa) 2-Solucion solida
amarilla (Fase orgánica) – Elaboración propia.
Figura 3: Fase acuosa junto al Acetato de potasio (Kac) - Elaboración
propia.
Figura 4: 1-Fase de separación, 2-Precipitación con Isopropanol,
Fuente: Labster Theory, 2021, El método de fenol-cloroformo para
el aislamiento de ácidos nucleicos.
Figura 5: Pellet de material genético (punto blanco en la zona inferior)
obtenido por todos los pasos realizados en la metodología de la practica
– Elaboración propia.
Figura 6: Resultado final, Pellet de material genético con agua de biología
molecular para su conservación. Fuente: DreamsTime, 2022, Manos
científicas en guantes blancos que sujetan el tubo eppendorf con
muestras de ADN en laboratorio
ADN genómico (homo sapiens sapiens): Mediante punción
venosa se obtuvo sangre periférica y se almacenó en un tubo
anticoagulante esta muestra fue llevada al laboratorio para
analizarla, se agregó a un tubo Eppendorf (figura 1) al cual se le
agregaron 200μL de TSNTE. La aplicación de esta solución dio
como resultado la desnaturalización de las proteínas y el
mantenimiento estable el ADN (Velázquez, 2014.) por
consiguiente se realizó la mezcla en el vortex para homogenizar
completamente el contenido del tubo, luego, con la agregación de
Fenol se obtuvo una mejor purificación del ADN, se mezcló en el
vortex durante 30 segundos y también se agregó 100μL de
SEVAG para separar la mezcla en 2 fases, en donde el ADN
quedó en la fase acuosa mientras que las proteínas y otros
contaminantes quedaron en la fase orgánica, por consiguiente se
llevó a mezclar en el vortex por 1 minuto, con lo que se obtuvo la
homogenización de la muestra, luego se agregó 200μL del
reactivo TE 1X el cual eliminó los cationes divalentes y lavaron el
exceso del medio de cultivo, se llevó a centrifugar la muestra para
separar las fases (figura 2) se seleccionó la fase acuosa
colocándola en un tubo Eppendorf de 1.5ml y se agregó 1 ml de
isopropanol al 100% frio en este paso se observó la hebra de ADN
(punto rojo) ya que esta se usó para la extracción y disolución de
los lípidos y se mezcló suavemente por inversión hasta que se
observó la precipitación del ácido nucleico. Luego se centrifugo
para empastillar en el fondo del tubo el ADN de un color
blanquecino, se le succiono el sobrenadante con la punta de la
pipeta sin absorber la pastilla de ADN y así se retiró la mayor
cantidad de isopropanol, luego, con se 500μL de etanol al 70%,
se lavó la pastilla de ADN en ese proceso se realizó la
precipitación, esta técnica fue usada para concentrar y desalinizar
los ácidos de la solución acuosa, luego se centrifugo por 5
minutos y aquí también se eliminó el etanol usando la punta de la
pipeta, se descartó el sobrenadante sin tirar la pastilla del ADN
para que así fuera quedando más puro (figura 3), posteriormente
se dejó secar y así se eliminó el restante de etanol, se re
suspendió y se agregó a un tubo con TE 1x o de H2O libre de
nucleasas el cual hidrato el ADN y se mezcló en vortex hasta
disolver la pastilla de ADN , por ultimo se rotuló el tubo y se guardó
la muestra final de ADN a -20°C para su conservación (figura 4).

Figura 1: Tubo eppendorf con muestra de sangre de Homo Sapiens
Sapiens. – Elaboración propia.
Figura 2: Lisis y separación de los componentes del ADN. – Elaboración
propia.
Figura 3: Extracción del sobrenadante conservando la pastilla de ADN
en el tubo. – Elaboración propia.
Figura 4: Resultado final, pellet de ADN previo a su conservación fría
para posterior observación en el laboratorio siguiente. –Elaboración
propia.
CONCLUSIÓN.
Finalmente se logró la ejecución e identificación del paso a paso
para la extracción de ADN de levadura (Saccharomyces
cerevisiae) y ADN genómico (homo sapiens sapiens), además, se
adquirió la destreza en el manejo de equipos y reactivos utilizados
en el laboratorio de Genética y Biología molecular.
-La calidad del ADN obtenido será verificada en el siguiente
laboratorio con la técnica de Electroforesis.
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