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EXTRACCIN Y PURIFICACIN DE ADN PLASMDICO DE

Escherichia coli TRANSFORMADA Y UNA


CARACTERIZACIN ELECTROFORTICA DEL MISMO EN
GEL DE AGAROSA.
Castellanos Portillo, Laura Carolina-93101708894
Universidad de Pamplona, Facultad de Ciencias Bsicas, Departamento de
Microbiologa, Biologa Molecular.
Marzo 31 del 2014


OBJETIVOS
Familiarizarse con mtodos de extraccin, purificacin y precipitacin de
cidos nucleicos a pequea escala y conocer las propiedades de un ADN
plasmdico.
Obtener suficiente cantidad del DNA plasmdico para un anlisis posterior
mediante electroforesis en gel de agarosa.

METODOS
El DNA problema que se va a analizar mediante electroforesis en gel de agarosa
en esta prctica es DNA plasmdico de E.coli transformada, es decir, se le ha
introducido de forma estable) con un plsmido artificial. Los mtodos utilizados
para la obtencin de este plsmido se denominan Lisis alcalina por SDS y lisis
por ebullicin.

Para el protocolo de Lisis alcalina por SDS, se hizo la previa, preparacin del
cultivo bacteriano portador del plsmido. Despus se tomaron 1,5 ml del cultivo de
bacterias y se ponen en un eppendorf de 2ml, centrifugndose a continuacin
durante 30seg a 13000 rpm. Se retira el sobrenadante, dejando el sedimento lo
ms seco posible. Luego se resuspendio el sedimento de bacterias en 100 l de
solucin de lisis alcalina I + Glucosa, seguido de un vortex, despus se adiciona
en el mismo tubo 200 l de solucin de lisis alcalina II y se
mezcla suave el contenido del tubo manualmente.

A continuacin, se aadi 150 l de solucin de Lisis alcalina III, se mezcl el
contenido del tubo por inversin suavemente y se sumergi por unos segundos en
hielo. Se adiciona fenol-cloroformo en una relacin 1:1, se llev a vortex y
centrifugo por 2 minutos, despus se transfiri el sobrenante a otro tubo de
eppendorf donde se le aadi 2:1 de Etanol absoluto y se llev a vortex. Esto se
mantuvo en temperatura ambiente por unos segundos y posterior a ello se llev a
centrifugar por 5 minutos. Donde despus se retir el sobrenante y se procedi a
lavar el pellet registrado con etanol al 70% y 2 minutos de centrifuga.
Para terminar se retira el sobrenante este se resuspende en 50 l en una solucin
de Buffer TE + 1 l RNAsas, seguidamente se almacena a 4C para su posterior
visualizacin electrofortica.

Para el protocolo de Lisis por ebullicin tambin se debio tener preparada el
plasmido de la bacteria transformada. De esta se extraen 1,5 l y se depositan en
un tubo de eppendorf seguido de 30 seg en la centrifuga. En este paso comienza
la etapa de preparacin. Despus se retir el sobrenante y se resuspendio en 350
l STET con ayuda de un vortex. En este paso comienza la fase de lisis celular
donde se aade 25 l de Solucin de lisozima y se lleva a vortex por 3 seg.
Luego se sumergi los tubos en agua hirviendo por 40 seg, seguido de una
centrifugacin por 15 minutos. Por lo que luego se transfiri el sobrenante a otro
tubo de eppendorf donde se le aadi 40 l de Acetato de sodio + 420 l
isopropanol y se lleva a vortex y se reposa unos 5 minutos. Es ah donde se
encuentra la fase de recuperacin donde se centrifugo por 10 minutos y se retir el
sobrenante obtenido. Seguido se aadi, agito y elimino 1000 l l de etanol al 70%
para finalizar con una resuspencion en 50 l de TE + 1 l RNAsas seguidamente
se almacena a 4C.

Para la electroforesis se quit la cinta adhesiva con la que se ha sellado el soporte
del gel y se coloca en la cubeta de electroforesis. Los pocillos deben de estar
cerca del ctodo (polo negativo, color negro). Se aadi tampn de electroforesis
TBE al 1x, de forma que cubra bien el gel de agarosa. Se aplic 9 l de cada
muestra preparada con 4 l de Buffer de carga y 4 l de la muestra ADN
plasmdico. Luego se aplican 9 l de marcador de peso molecular en uno de los
pocillos. Se tap la cubeta de electroforesis y se conectan los electrodos a la
fuente de alimentacin. Se comprob que este bien conectada. Se program la
fuente a unos 72 voltios y se comienza a correr la electroforesis que duro unos 30-
45 minutos hasta que el buffer de carga haya recorrido la distancia adecuada a
travs del gel. Una vez acabada la electroforesis se desconect la corriente y se
retir los cables y la tapa de la cubeta. Se visualizaron los fragmentos de DNA
mediante luz UV y se realiz una fotografa de la imagen. Despus se descartara
el gel en el recipiente para residuos slidos destinados al bromuro de etidio
previsto a tan fin.
Por ltimo, se esperaba preparar una recta de calibrado con los pesos
moleculares de los marcadores (fragmentos del fago digerido con Hind III) en
funcin de la distancia recorrida en la electroforesis e interpolaremos las distancias
recorridas por los distintos estados de enrollamiento del plsmido para conocer su
tamao molecular.











RESULTADOS

FIGURA 1. Fallo de Corrida electrofortica en gel de agarosa teido con Bromuro
de Etidio de ADNs obtenidos.
DESCRIPCION:
El gel de resolucin es la matriz de
agarosa que se emple al 10 %,
sobre el cual se formaron 10 pocillos
en los cuales iban dispuestas las
muestras de ADNs plasmidicos
extrados anteriormente por
diferentes manipuladores-operadores
del laboratorio. Las molculas de
ADN, van a migrar generando un
perfil de bandas o patrn
electrofortico. Dicho patrn vara de
acuerdo al peso molecular de cada
una de las molculas y a la
concentracin del gel mismo.

CARRIL 2: ADN plasmdico, extrado
por Lisis alcalina del operador Alex
Carmona.
CARRIL 3: ADN plasmdico, extrado
por Lisis por ebullicin del operador
Alex Carmona.
CARRIL 4: ADN plasmdico, extrado
por Lisis por alcalina del operador
Laura Castellanos
CARRIL 5: ADN plasmdico, extrado
por Lisis por alcalina del operador
Laura Castellanos
CARRIL 6: ADN plasmdico, extrado
por Lisis por ebullicin del operador
Laura Castellanos
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
CARRIL 7: ADN plasmdico, extrado
por Lisis alcalina del operador Erika
Torres
CARRIL 8: ADN plasmdico, extrado
por Lisis alcalina del operador Erika
Torres
CARRIL 9: ADN plasmdico, extrado
por Lisis por ebullicin del operador
Erika Torres
CARRIL 10: Marcador de Peso
Molecular 1kb DNA Step Ladder .
ANALISIS DE RESULTADOS
El DNA de un plsmido presente en
una bacteria se asla por un mtodo
rpido y sencillo (miniprep) que
consiste en lisis bacteriana,
precipitacin de protenas y DNA
genmico, y finalmente precipitacin
del DNA plasmdico. El objetivo es
obtener suficiente cantidad del DNA
para su anlisis posterior mediante
electroforesis. Es por ello se
realizaron dos mtodos de extraccin,
purificacin y precipitacin de ADN
plasmdico, entre esos esta la
extraccin por lisis alcalina, la cual
se basa en la desnaturalizacin
selectiva del DNA cromosmico
mediante alcalinizacin con NaOH y
adicin de SDS (detergente), en
condiciones en las que el DNA
plasmdico permanece prximo a su
estructura nativa, debido
principalmente a su pequeo tamao
y su naturaleza circular y
superenrollada. Al neutralizar el
medio y aadir una concentracin de
sal, se produce la precipitacin de
gran parte de las protenas debido al
tratamiento con SDS y a la alta
concentracin de sales. Tambin
precipita el DNA cromosmico,
probablemente porque se producen
reasociaciones al azar entre las
diferentes regiones de este DNA y as
se forman agregados insolubles. Por
el contrario, no precipita el DNA
plasmdico, que queda en el
sobrenadante, por eso es necesario
el usar tres solucin de lisis alcalina
las cuales permiten una mejor
precipitacin y obtencin de este
ADN.

La otra tcnica es la de lisis por
ebullicin la cual no es la ms
utilizada segn algunos kits de
extraccin, en este protocolo hubo
fallas a la hora de usar la temperatura
la cual es una variable imprescindible
en este, donde las planchas
calentadoras no estaban en su mejor
condicin, no estaban calibradas y
otras se encontraron daadas por lo
que no hubo temperaturas adecuadas
para sumergir la muestra y por ello no
fue correcto el desarrollo del proceso.
En este protocolo usa
concentraciones de sal altas como
Acetato de sodio el cual causa
precipitacin de las macromolculas
consideradas basuras como ADN
cromosmico y protenas.

Por lo que si el procedimiento se
hace de forma no correcta, en cuanto
a variables de tiempo,
concentraciones es posible que al
tratar de identificar el ADN en una
electroforesis se va a tornar
imposible, tal como pas en este
laboratorio.
Solo en la corrida electrofortica se
visualiz el marcador de peso
molecular el Lambda DNA/HindII; el
cual se obtiene del fago a partir de
vectores de ADN digeridos
completamente con enzimas de
restriccin hasta generar bandas
entre 250 bp y 10 kb, aptas para ser
utilizadas en estos casos. Este
marcador se compone de 14
fragmentos individuales purificados
por cromatografa (en pares de
bases): 10000, 8000, 6000, 5000,
4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500,
1000, 750, 500 y 250. Los fragmentos
de 1000, 3000 y 6000 bp presentan
una intensidad superior y se
comportan como bandas de
referencia.

En una corrida electrofortica es justo
usar Buffer de corrida y Buffer de
carga los cuales amenizan el
proceso. El buffer de carga
Blue/Orange Loading Dye, 6X es un
colorante marcador que contiene
0,4% de naranja G, 0,03% azul de
bromofenol, 0,03% de xileno cianol
FF, 15% de Ficoll 400, 10 mM Tris-
HCl (pH 7,5) y EDTA 50 mM (pH 8,0).
Se proporciona en un premezclado, la
cual es una forma lista para usar. El
colorante se utiliza para la carga de
muestras de ADN en los pocillos de
electroforesis en gel y el seguimiento
de la migracin durante la
electroforesis. En un gel de agarosa
al 0,5-1,4% en 0,5 X TBE, xileno
cianol FF migra a aproximadamente 4
kb, azul de bromofenol en
aproximadamente 300 pb y naranja G
en aproximadamente 50 pb.

Algunos de los posibles errores del
no xito durante la obtencin de ADN
plasmdico fue debido a que no se
suspendi en hielo cada vez que se
agregaba las soluciones de lisis
alcalina II y III por lo que no se vio un
visible precipitado blanco el cual
debi contener el DNA cromosmico
junto con las protenas ya que el hielo
le provoca al mtodo un rpido
descenso de estas molculas
definidas indeseables para la
extraccin. Tambin al momento de
agregar la Solucin de Lisis alcalina
II, la cual no fue preparada de la
mejor manera en cuanto a sus
volmenes, esta solucin se debi
tornar viscosa y ligeramente clara
esto debido a que deba ocurrir la lisis
celular. En cada uno de los carriles
del gel donde se carg el DNA
plasmdico, se debi ver tres bandas
de distinto tamao que
corresponderan a las tres formas
principales con las que migra el
mismo en funcin de su grado de
enrollamiento. Son las formas
circular, enrollada y superenrollada
que migraran con menor a mayor
velocidad, respectivamente, en una
electroforesis.
Esto pudo haber sido por un mal
ajuste en los voltios de la batera la
cual fue de 72 EC ya que pudo influir
que la fuerza inica y a su vez la
conductancia elctrica fueran
mnimas y el ADN migrara ms lento
o no se desplaza, por lo que
necesitase ms conductancia
elctrica o ms tiempo.
Adems, el hecho que no se
adicionara ninguna enzima de
restriccin a la muestra al inicio de la
protocolo, para que realizara la
digestin del ADN y as se habran
podido observar los fragmentos de
ADN, contrario a la banda contina
obtenida. Tambin debido a que un
plsmido no tratado con enzimas de
restriccin es una molcula circular
de DNA y, debido a esta
caracterstica, puede presentarse en
dos conformaciones, principalmente:
una forma superenrollada y una
forma relajada. Aunque las dos
tienen la misma masa molecular,
migran de forma diferente debido a su
forma o disposicin espacial. La
movilidad relativa de las dos formas
depende principalmente del
porcentaje de agarosa en el gel,
aunque tambin influyen la corriente
aplicada, la fuerza inica del tampn
y el grado de enrollamiento de la
forma superenrollada. Bajo las
mismas condiciones la forma
superenrollada, ms compacta, migra
ms deprisa que la forma relajada.
El dficit de calidad de este
procedimiento conllevo a un fallo en
la lectura de electroforesis por lo que
fue imposible su cuantificacin por lo
que no se puedo preparar una recta
de calibrado con los pesos
moleculares del marcador
(fragmentos del fago digerido con
Hind III) en funcin de la distancia
recorrida en la electroforesis e
interpolar las distancias recorridas por
los distintos estados de enrollamiento
del plsmido para as conocer su
tamao molecular.

BIBLIOGRAFIA
GUIA: Plasmids and Their
Usefulness in Molecular
Cloning CHAPTER 1:
PROTOCOLO 4 y
PROTOCOLO 1. PAG.1,44-
1,45-1,46.
Sambrook, J., Fritsch, E.F. y
Maniatis, T. (1989). Gel
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Sambrook, J., Fritsch, E.F. y
Maniatis, T. (Eds.) Molecular
Cloning: a Laboratory
Manual. New York: Cold
Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, NY,
USA, captulo 6. Westermeier,
R. (1997). Electroforesis in
Practice: a Guide to Methods
and Applications of DNA and
Protein Separation, VCH,
Weinheim.