Histoquímica enzimática: consideraciones generales

Este capítulo introduce al amplio asunto de la histoquímica enzimática. Se mencionará una breve reseña de las
propiedades generales, seguido de una discusión de los procedimientos químicos y físicos bajo los métodos
utilizados para su localización en tejidos.

Algunas propiedades enzimáticas

Una enzima es una proteína que sirve como catalizador. La catálisis se produce por la combinación de una
molécula de la enzima con una molécula de uno de los reactivos, conocido como sustrato. El sustrato, que
siempre es un compuesto orgánico o un ion, de esta forma el sustrato es más químicamente activo de lo que
sería otro reactivo. Los productos de reacción son liberados de la molécula que se unió a la enzima, quedando
esta libre para unirse a otra molécula del sustrato. Una característica importante de la catálisis enzimática es que
las reacciones ocurren a temperatura ambiente o corporal, usualmente en un medio en el cual el pH es cercano a
lo neutro. En ausencia de enzimas no debieran ocurrir las reacciones químicas, sólo ocurrirán a temperaturas no
fisiológicas elevadas, soluciones ácidas o alcalinas fuertes, o en solventes no acuosos.

Las enzimas por si solas son altamente específicas para sus sustratos y los tipos de reacción que catalizan. Sin
embargo, la especificidad por el sustrato no siempre es absoluta, lo que es beneficioso para los bioquímicos e
histoquímicos. Al suministrar un sustrato artificial, similar al natural, a menudo es posible estudiar la catálisis
enzimática de la reacción que entrega productos que son más fáciles de detectar que aquellos generados del
sustrato fisiológico. En la histoquímica enzimática lo ideal es obtener productos finales coloreados e insolubles.

Si desea mayor información de las enzimas y su función biológica se recomienda consultar en los libros de
bioquímica o enzimología. Dixon y Webb (1979) poseen un trabajo de referencia comprensible. Burstone (1962),
Lojda et all (1979) y Stoward y Pearse (1991) tratan la histoquímica enzimática en gran detalle.

Nombres de las enzimas

El nombre de las enzimas y sus propiedades, como toda la información científica, ha sido adquirido
gradualmente. El reconocimiento de más y más enzimas ha llevado a ha desconcertante liberalidad de nombres
para aquellas sustancias. La unión internacional de bioquímica introdujo un esquema en el cual cada enzima se
nombra de acuerdo a la reacción que cataliza. El esquema también incluye una clasificación de las enzimas y
permite el uso de nombres triviales aprobados cuando los nombres sistemáticos completos son incómodos. A
cada enzima se le asigna un número, el cual establece que se localiza en una clasificación. Por ejemplo,
E.C.3.1.1.3 es una enzima dl grupo mayor de las hidrolasas (grupo 3). Actúa sobre uniones éster (3.1) de los
ácidos carboxílicos (3.1.1) y es el tercer miembro de la lista de hidrolasas éster carboxílicas. Su nombre
sistemático es triacilglicerol éster hidrolasa y el nombre trivial recomendado es triacilglicerol lipasa. Cataliza la
siguiente reacción enzimática:

Los nombres triviales aprobados de las enzimas se utilizan en este y los siguientes dos capítulos. Los números E.C.
y nombres sistemáticos se mencionan al principio de cada texto. Algunos nombres no aprobados también serán
usados y discutidos. Esto es una consecuencia desafortunada del hecho de que el estudio de la histoquímica
enzimática es una ciencia menos precisa que la enzimología bioquímica.
Alcance y limitaciones de la histoquímica enzimática

La identificación precisa de la localización celular y subcelular de muchas enzimas ha sido uno de los logros más
acertados de la histoquímica moderna. Al usar un método de detección de una enzima en particular el
histoquímico busca responder dos preguntas:

(1) ¿La actividad se detecta en el tejido al igual que como se detecta con los métodos bioquímicos de la
enzima purificada? Esto es una re expresión del requerimiento para la especificidad química asociada
con cada técnica histoquímica. Es importante recordar que el bioquímico purifica enzimas de tejidos
homogeneizados y usualmente estudia sus propiedades en solución. En un corte de tejido hay muchas
enzimas presentes, y todas ellas tienen la posibilidad de actuar sobre los reactivos histoquímicos elegidos
con el propósito de demostrar solo una de ellas.

El secuestro de una enzima en los organelos puede impedir el acceso de los reactivos histoquímicos y,
aparentemente, suprimir la actividad de esa enzima en un corte. Las técnicas histoquímicas usualmente
se enfocan en detectar la mayor cantidad de actividad enzimática posible, pero una enzima no
necesariamente estará completamente activa todo el tiempo en todas las partes de todas las células en
las cuales esta está presente.

(2) ¿En qué parte del tejido se localiza la enzima in vivo? Por lo general, esta es la pregunta más difícil de
responder. Los problemas asociados con la precisión en la localización son diferentes para los tres
métodos principales utilizados para la demostración histoquímica de enzimas. No se discutirán.

Métodos no basados en la actividad enzimática

Las enzimas son proteínas y son antigénicas. Por lo tanto es posible preparar anticuerpos para enzimas
purificadas y usar esos anticuerpos en técnicas inmuno fluorescentes y otras técnicas inmunohistoquímicas. Para
la localización precisa es necesario que las propiedades antigénicas de la enzima (aunque no necesariamente las
catalíticas) estén inafectadas por la fijación u otro tratamiento previo del tejido y que la enzima no difunda de su
posición normal, antes de formar un complejo insoluble con el anticuerpo. Tras la fijación, u otros
procedimientos de fijación, la antigenicidad es más resistente que la actividad catalítica. Existe un gran número
de enzimas que a menudo se identifican inmuno histoquímicamente con anticuerpos disponibles en el comercio,
incluyendo muchas para las cuales no existen métodos basados en la actividad histoquímica. Estos métodos son
inmunológicos, por lo tanto no se discutirán en este capítulo.

Otra técnica es aquella de la afinidad por el marcaje con inhibidores específicos de enzimas. EL primer método
es aquel que describe la unión de DFP radioactivo a los cortes . Luego se detecta la unión del inhibidor mediante
auto radiografía. Lamentablemente este inhibidor se une e inhibe muchas enzimas que contienen residuos de
serina en o cerca de la unión al sustrato, por lo tanto esta técnica es de baja especificidad. Sodio, adenosin-
potasio trifosfatasa (Na, K-ATPasa, una variante de E.C. 3.6.1.3, ATP fosfohidrolasa), la cual es la expulsora de
sodio-potasio en la membrana celular, se detecta debido a su unión a la ouabaína, un inhibidor específico de la
enzima. El ouabaína se une covalentemente a un péptido con actividad peroxidasa. Luego, el péptido puede ser
identificado mediante métodos histoquímicos para peroxidasa. Esta reacción da un producto osmiofílico visible a
través de microscopía electrónica (Mazurkirwitz et al, 1978).

La Anhidrasa carbónica se demostró mediante un inhibidor fluorescente, dimetilaminonaftaleno-5-sulfonamida,

por Pochhammer et al (1979). Este inhibidor se daba oralmente a los animales y se les mataba 7-12 horas
después. Si era posible se examinaban los cortes de criostato sin fijar, con los filtros apropiados, para distinguir la
fluorescencia de la unión enzimática de aquella del inhibidor que no se une. Dermietzel et al (1985) aplicaron el
mismo inhibidor fluorescente directo a cortes de criostato sin fijar. Los controles para la especificidad se realizan
mezclando el inhibidor con inhibidores competitivos no fluorescentes.

El uso de polímeros de una enzima para detectar su sustrato, es una aplicación relacionada de la afinidad
enzima-sustrato. De esta manera, cada molécula de glucosa oxidasa posee dos sitios de unión a sustrato.
Agregados (creados por la mezcla de la enzima con glutaraldehído) atacarán a los grupos α-D-glucosil en cortes
de tejidos fijados. Por lo tanto se demuestran histoquímicamente los sitios libres activos de los agregados
enzimáticos.

Métodos basados en la actividad enzimática

Métodos de sustrato-película.

En este tipo de técnica la enzima actúa sobre un sustrato adherido a una película de algún material útil que se
aplica lo más cerca posible del corte de tejido. Tras la incubación por el tiempo apropiado el cambio en el
sustrato se detecta de acuerdo a lo que indique el expediente. De esta manera se pueden observar los sitios que
cambian en la película de acuerdo a los lugares de subyacente o supra yacente en el corte.

Las técnicas de película-sustrato son potencialmente muy versátiles, pero poseen dos limitantes importantes. En
primer lugar la enzima puede difundir del locus original al de la película. La difusión ocurre en todas las
direcciones, es decir, no ocurren solo hacia arriba o hacia abajo, por lo tanto los cambios en la película hacia
alguna dirección en que la enzima estaba localizada en el corte. Esta inexactitud se minimiza si la distancia entre
el corte y la película es uniformemente cercano y si la película es tan delgada que se puedan observar los
cambios en ella. En segundo lugar el cambio producido en el sustrato debe ser inmediato e irreversible, de no
ser así la difusión lateral de los productos de la acción enzimática en la película podrían volver este método
inservible. Probablemente la resolución más alta que se puede esperar en la técnica de sustrato-película es
aquella en que se identifica una enzima intracelular.

Existe un método relacionado al procedimiento de sustrato-película que se conoce como técnica de

transferencia enzimática para la localización de actividad ribonucleasa, desarrollado por Schultz-Harder Y Graf
von Keyserlingk (1988). La enzima se transfiere electroforéticamente de un corte de criostato a un gel de
poliacrilamida que contiene RNA. El gel se incuba por el tiempo necesario y el RNA remanente se tiñe con
bromuro de etidio. El corte original se tiñe y su apariencia microscópica se compara con la del gel. Este
procedimiento también debiese ser útil para otras enzimas.

A menudo se utilizan otros sustratos y reactivos solubles en la película gelatinosa que se aplica al corte, pero el
este caso el sustrato difunde por el tejido y la enzima (idealmente) no se mueve. Este procedimiento reduce la
difusión enzimática y de los productos intermediarios de reacción. Técnicamente es similar a los métodos de
sustrato-película, pero en realidad es un método de disolución de sustrato, debido a que el producto final visible
se observa en el corte y no en una película.

Métodos de disolución de sustrato

En este método todos los reactivos se utilizan en solución y el producto final de la reacción enzimática se
deposita entre medio del tejido cortado. La gran mayoría de los métodos histoquímicos para enzimas caen en
esta categoría. Casi en todas las técnicas en que la enzima del corte actúa sobre un sustrato (que a menudo no
corresponde al sustrato original de la enzima) que es entregado en un medio de incubación. Dependiendo de la
enzima, el sustrato será hidrolizado, o este puede ser oxidado o reducido por otra sustancia agregada al medio
de incubación, o que ya está presente en el tejido. También puede haber otras reacciones químicas. La reacción
enzimática da como resultado la formación de productos (de hidrólisis, oxidación, etc), uno de los cuales debe ser
inmovilizado en el sitio de producción y eventualmente hacerlo visible bajo el microscopio. La inmovilización al
microscopio se logra por medio de un agente de captura, que usualmente es un compuesto que reacciona
rápidamente con el producto para formar un producto final coloreado e insoluble. En ocasiones el precipitado
final realizado por un agente de captura es incoloro y debe hacerse visible mediante una tercera reacción
química. Ocurren al menos dos procesos químicos en cada método histoquímico en el cual se usa un sustrato
disuelto: la reacción catalítica de la enzima y la captura del producto. Las técnicas de este tipo están expuestas a
5 tipos de artefactos.

(1) La enzima puede difundir, tanto durante la preparación del tejido como durante la incubación con el agente
de captura. La difusión de muchas enzimas solubles se puede evitar agregando un polímero sintético inerte en el
medio de incubación, como el alcohol polivinilo. La fijación del tejido también inmoviliza enzimas, pero la
mayoría de los fijadores también causan denaturación suficiente como para destruir las propiedades catalíticas.
En lo posible que el tejido sea siempre fijado: muchos métodos histoquímicos funcionarán mejor incluso cuando
una pequeña fracción de la actividad enzimática sobreviva.

(2) El producto de la actividad enzimática puede difundir fuera de su sitio de producción antes de que sea
precipitado por el agente de captura. El producto difundido puede unirse por sí mismo a estructuras cercanas
distintas a los sitios en que la enzima está localizada. Por ejemplo, si el producto es un ion de carga positiva, se
puede unir a sitios aniónicos en el núcleo de la célula siendo que se formó en el citoplasma. Con objeto de
minimizar la difusión del producto primario de la acción catalítica enzimática es importante que: (a) la reacción
de captura ocurra rápidamente y, (b) el depósito final tenga una muy baja solubilidad en el medio de incubación.
La última condición depende, en algunos casos, de la solubilidad del producto de depósito final. Por ejemplo, si
los iones fosfato, liberados por una hidrolasa éster-fosfato, serán precipitados como fosfato de calcio, el medio
de incubación debe tener la mayor concentración de iones de calcio posible para ser capturados. De esta forma,
el producto [Ca2+]3[PO43-]2 probablemente excederá la baja solubilidad del producto Ca 3(PO4)2 en presencia de
solo pequeñas trazas de fosfato.

(3) El depósito final precipita necesariamente en algún lugar del corte. Si el depósito es insoluble en agua, pero
de alguna manera es soluble en lípidos, podría existir una localización errónea de la enzima de acuerdo al último
(lípidos). Las proteínas son ubicuas en las células, por lo tanto es preferible que el depósito final se una a las
proteínas una vez que ha sido precipitado. El término sustantividad se usa para denotar la afinidad de los
diferentes tipos de depósitos finales para lípidos o proteínas. Por lo tanto, se prefiere una alta sustantividad para
las proteínas.

(4) Si se requiere una tercera reacción para hacer visible el producto de captura, también puede ocurrir difusión.
Este no es un artefacto que ocurra a menudo en microscopía de luz, pero toma gran significancia en la
histoquímica enzimática a nivel de resolución de la microscopía electrónica.

(5) En algún paso del procedimiento se puede formar un precipitado coloreado que no corresponde a la actividad
enzimática que está siendo estudiada. Las reacciones falso positivo se pueden deber a que (a) otras enzimas
están actuando sobre los constituyentes del medio de incubación, (b) otras enzimas actúan sobre algún producto
de la reacción primaria enzima catalizadora, (c) ocurrencia espontánea de la reacción catalizadora de la enzima o,
(d) reacciones no enzimáticas, no deseadas, de cualquier otro tipo. Como los controles excluyen algunos de estos
tipos de artefactos es necesario realizar el método en ausencia de sustrato y también con cortes en que la
actividad enzimática específica se prevenga (por ejemplo por calor, o preferentemente un inhibidor enzimático
específico). Se ha clasificado a un gran número de compuestos que inhiben las enzimas, que han sido revisados e
indexados por Jain (1982). Siempre se debe considerar la ocurrencia de artefactos de falsa localización debido a
la difusión de productos y reacciones no deseadas en el desarrollo de nuevos métodos histoquímicos para la
actividad enzimática. Holt y O’sullivan (1958) evaluaron críticamente los principios de localización específica
enzimática, una publicación recomendada para todo aquel que desee entender el desarrollo de un nuevo
método histoquímico.
Tipos de enzimas

Los bioquímicos clasifican las enzimas de acuerdo al tipo de reacción química que catalizan. La clasificación
enzimática de las enzimas es demasiado profunda para el histoquímico, cuyo repertorio de técnicas es mucho
más limitado que el del enzimólogo. Las enzimas demostrables histoquímicamente caen en dos categorías:

Enzimas hidrolíticas (hidrolasas)

Estas enzimas catalizan la reacción de sus sustratos en presencia de agua. La molécula del sustrato se divide en
dos partes, una de las cuales puede ser capturada.

(1) Fosfatasas. Catalizan la hidrólisis de ésteres y amidas de ácido fosfórico.

(2) Sulfatasas. Catalizan la hidrólisis de ésteres sulfato.
(3) Esterasas carboxílicas. Catalizan la hidrólisis de uniones éster entre ácidos carboxílicos y cualquiera de las
variedades de alcoholes o fenoles.
(4) Glicosidasas. Catalizan la hidrólisis de uniones glicosídicas.
(5) Enzimas proteolíticas. Existen muchos tipos, los cuales catalizan la división del péptido y puentes amino.

Oxidoreductasas

Estas enzimas, que catalizan las reacciones de oxidación y reducción, incluyen las deshidrogenasas, peroxidasas y
oxidasas.

Transferasas

Una transferasa es una enzima que remueve parte de una molécula para formar un compuesto nuevo. A la
actividad de las transferasas se asocian ciertas reacciones químicas (degradación, síntesis, cambios en las
coenzimas) y existe un surtido variado de métodos histoquímicos para enzimas de este tipo.

Liasas

Este grupo incluye a las enzimas que catalizan la descomposición de grandes moléculas en moléculas más
pequeñas. Uno de los productos es comúnmente una molécula de agua o amoniaco.

Consideraciones técnicas

Preparación del tejido

La preservación de la enzima en el tejido se puede conseguir mediante tres formas.

(a) El tejido debe ser rápidamente congelado y cortado en criostato. Luego, los cortes sin fijar, pueden ser
incubados para detectar la actividad enzimática. Chayen y Bitenski (1991) recomiendan ampliamente este
procedimiento para todos los métodos histoquímicos enzimáticos. Sin embargo, la mayoría de los histoquímicos
prefieren fijar el tejido en lo posible.

(b) Se debiera usar un fijador químico que no inhiba la actividad enzimática. Este procedimiento es conveniente
para aquellas enzimas que resisten la fijación. Por ejemplo, la mayoría de las hidrolasas éster carboxílicas se
pueden demostrar en tejidos congelados o tejido fijado por formaldehido y, algunas fosfatasas sobreviven a la
fijación por acetona seguida por inclusión en parafina. Los cortes de criostato de tejido sin fijar debieran ser
fijados por algunos minutos (por lo general en formaldehido frio o acetona) antes de la incubación, en donde
muchas enzimas sobrevivirán a este proceso. La fijación limita la difusión de las enzimas.
(c) El tejido debe ser liofilizado y luego incluido en glicol metacrilato. Esta resina se debe mantener fría durante la
polimerización exotérmica. Muchas enzimas se pueden demostrar en cortes de estos tejidos incluidos. Para
mayor detalle ver Litwin (1985), Murray, Burke y Ewen (1989) y Van Noorden y Frederiks (1992).

Condiciones de la reacción

Muchas incubaciones se realizan a 37ºC, aunque la temperatura ambiente y a 4ºC se prefiere en algunos
métodos. Las enzimas de animales endotermos funcionan generalmente a los 37ºC; los ectotermos y plantas a
25ºC. A temperaturas más bajas existe menos difusión enzimática y de los productos de reacción. Los cortes
montados en portaobjetos o cubreobjetos es conveniente incubarlos en jarras coplin. Cuando existe poco
volumen disponible (como cuando se utiliza un componente de alto costo), se debe colocar una gota sobre una
sección individual. Luego, los cortes se colocan en una cámara húmeda, como una placa petri que contenga gasa
humedecida, para prevenir la evaporación. Los cortes congelados de flotado libre se incuban en placas petri
pequeñas, vidrio perforado, pocillos de bandejas de la hemaglutinación o un plato de cultivo celular.

Limpiar el material de vidrio es esencial, incluso cuando se trabaja con enzimas se debe ser más cuidadoso que
en otras áreas de la histoquímica, porque las sustancias contaminantes pueden inhibir las enzimas o reaccionar
con los componentes del medio de incubación.

Nota de seguridad: Algunos inhibidores enzimáticos (cianuro de potasio, dietil-p-nitrofenil fosfato y muchos
otros) son tóxicos y deben ser manejados con cuidado. Esto también se aplica para algunos reactivos (bencidina y
compuestos relacionados) que son carcinogénicos y el uso de muchas otras sustancias riesgosas relacionadas es
desconocido.