Métodos para iones inorgánicos

Consideraciones generales

Los iones inorgánicos están presentes en todas las partes que conforman los tejidos, pero debido a su solubilidad
no son muy fáciles de detectar mediante técnicas histoquímicas. Ha sido posible demostrar algunos iones como
potasio y cloro, haciendo uso de técnicas fijadoras por criodesecación y reactivos fijadores que forman una sal
insoluble con el ion en cuestión. Aún así, es difícil de determinar la cantidad de aquellos iones solubles que
difundieron desde su localización in vivo durante el curso del procesamiento, al sitio donde la técnica
histoquímica muestra el resultado.

Cuando las sustancias inorgánicas están presentes en los tejidos como compuestos insolubles, en forma de sales
como carbonato de calcio, o formando complejos con proteínas como la hemosiderina, permanecen in situ
durante el procesamiento y pueden ser detectados con precisión mediante técnicas histoquímicas. Algunos
metales como calcio, hierro y zinc se encuentran en cantidad suficiente en los tejidos como para permitir su
identificación en material no patológico (normal). Otros iones también se encuentran presentes bajo condiciones
normales pero la cantidad es tan baja que sólo serán demostrables mediante técnicas histoquímicas bajo
condiciones patológicas o manipulación experimental. También existen otros iones que no se ven envueltos en el
metabolismo mamífero, pero que pueden encontrarse debido a procesos de intoxicación o exposición ambiental.
Respecto a los aniones inorgánicos, los fosfatos y carbonatos de los tejidos mineralizados son los únicos que se
encuentran presentes normalmente en forma insoluble.

Las técnicas histoquímicas para iones inorgánicos caen en dos categorías: aquellas en las cuales los productos
visibles son en negro o sustancias inorgánicas coloreadas y aquellas en las cuales los compuestos coloreados son
formados por quelación de metales con un ligando orgánico. Cabe destacar que los métodos que serán descritos
sólo son para detectar metales presentes como iones en el tejido, ya que los metales que están unidos mediante
enlaces coordinados fuertes a ligandos orgánicos no pueden reaccionar con los reactivos utilizados para la
demostración de estos iones. Por ejemplo, el hierro en los eritrocitos está tan fuertemente unido al grupo Hem de
la hemoglobina que no dará positivo ante un método histoquímico de demostración de hierro.

Cabe recordar que la histoquímica es solo una aproximación al examen de metales y otros elementos en el tejido.
Existen otros métodos físicos valorables, como la prueba del microanálisis del electrón, cátodoluminiscencia,
espectrometría de masas y microprueba espectroscópica de emisión láser.

Como ejemplos de técnicas histoquímicas para sustancias inorgánicas consideraremos algunos de los métodos
para calcio, fosfato (y carbonato), hierro, zinc, cobre y plomo.

Calcio
Este metal es demostrado debido a su habilidad para formar quelatos con colorantes y otros compuestos
orgánicos. Los colorantes de elección son aquellos que no forman complejos con otros metales de origen natural
como magnesio o hierro. No debieran ser usados fijadores de características ácidas, ya que pueden disolver las
sales de fosfato y carbonato de calcio. Las sales solubles de calcio están disueltas en baja cantidad tanto en los
fluidos intracelulares como en los extracelulares. Las sales de calcio pueden ser inmovilizadas mediante
congelación rápida, criodesecación o incluyendo en el fijador un ion que forme una sal insoluble con el calcio y
precipite (fosfato, fluoridro, dicromato, oxalato y piroantimonato)
MÉTODO DE ALIZARIN RED S
Alizarin red S es una antraquinona, que corresponde a un colorante sintético. Tal como otras
hidroxiantraquinonas forma quelatos, en donde un oxigeno quinona y un oxígeno fenólico actúan como
donadores de electrón al átomo metálico, de esta forma se crea un anillo estable de 6 átomos. El calcio, cuya
configuración permite 4 electrones, se combina con 2 moléculas de antraquinona.

La estructura de arriba es ampliamente aceptada, pero Lievremont la desafió al encontrar que in vitro la
proporción metal:colorante estaba próxima a 1.0 y sugirieron que la quelación se producía por grupos fenólicos
ionizados y ácidos sulfónicos.

Alizarin Red S también actúa como colorante aniónico y otorga una coloración rosada no específica al fondo.

Los iones de calcio se liberan desde los depósitos insolubles, lo cual ocurre inevitablemente antes de que se
pueda formar el quelato insoluble. En consecuencia, siempre habrá un pequeño grado de difusión desde el sitio
de depósito de calcio. La coloración histológica se ve altamente favorecida por el por el pH de la solución. Una
solución ácida extraerá mucho calcio y producirá una coloración intensa, pero se localizará de manera difusa, en
cambio una solución a pH más alcalino liberará unos pocos iones, pero aunque la localización del depósito será
mejor, la sensibilidad del método será menor. Diferentes autores han recomendado un pH de 4-9 para el método
Alizarin Red S.

Se puede usar un fijador alcohólico o neutro. La preservación máxima de calcio se puede obtener con una fijación
en etanol al 80%, aunque este es un fijador pobre para propósitos histológicos. Formol neutro o buffer es
satisfactorio.

Soluciones requeridas
A. Alizarin Red
Alizarin Red S (C.I. 58005) 1 g.
Agua 90 ml

Agregar NH4OH (28% de amonio diluido 100 veces en agua) en pequeñas alícuotas hasta alcanzar un pH 6.1
aprox. Guardar por 4 semanas.

B. Líquido diferenciador
Etanol 95% 500 ml
Ácido hidroclorhídrico concentrado 0.05 ml

Mezclar al momento de usar y usarlo sólo una vez.

Procedimiento
(1) Desparafinar e Hidratar
(2) Teñir en solución A por 20 min.
(3) Lavar en agua por 5-10 segundos.
(4) Diferenciar en solución B por 15 segundos.
(5) Completar la deshidratación en dos cambios de Etanol absoluto, aclarar en xilol y montar en medio resinoso.

Resultados
Calcio de Naranjo a rojo. Contraste rosado pálido.

MÉTODO DE GBHA
Un método más sensible para el calcio que involucra un agente quelante, que no es un colorante. Corresponde al
glyoxal-bis-(2-hidroxianil), También conocido como GBHA:

En presencia de una base fuerte como hidróxido de sodio se ionizan los hidroxilos del fenol. El anión del GBHA
forma quelatos insolubles con muchos metales, incluido el calcio:

El quelato metálico también se forma con estroncio, bario, cadmio, cobalto y níquel. Si se cree que alguno de
estos metales está presente en el tejido, se puede descomponer la reacción utilizando una solución alcalina que
contenga iones cianuro.

El método GBHA es muy sensible y se puede utilizar para detectar aquellos iones de calcio que no son sales
insolubles del metal, siempre y cuando el tejido se haya procesado por criodesecación o criosustitución. Luego de
fijar en un medio acuoso el calcio difunde y una pequeña porción de este se puede detectar en el núcleo celular
mediante este método. Se presume que este artefacto se debe a la atracción electrostática de los iones de calcio
por los grupos fosfato de los ácidos nucleicos. Tal como ocurre con Alizarin Red S, la solución de GBHA utilizada
para teñir depósitos de sales insolubles de calcio debe contener agua y no debe ser demasiado alcalina. Además
las sales de calcio solubles se tiñen mejor en una solución que contenga etanol absoluto con un poco de hidróxido
de sodio. Para esta técnica es esencial preparar los tejidos tal como se describe para evitar la contaminación con
algunos reactivos (incluida el agua) que pudieran tener trazas de calcio.

Solución requerida
A. Solución stock de GBHA
Glyoxal-bis-(2-hidroxianil) 200 mg
Etanol absoluto 50 ml
Guardar por algunas semanas a 4ºC.

B. Solución de hidróxido de sodio

Hidróxido de sodio (NaOH) 10 gr
Agua Aforar a 100 ml
Guardar por algunas semanas.

C. Solución GBHA de trabajo I

Stock de solución A de GBHA 2 ml
 NaOH 10% (solución B) 0.15 ml
Agua 0.15 ml
Mezclar antes de usar.

D. Solución GBHA de trabajo II

Stock de solución A de GBHA 2 ml
NaOH 10% (solución B) 0.6 ml
Mezclar antes de usar.

E. Solución alcalina de cianuro

Etanol Absoluto 45 ml
Agua 5 ml
Carbonato de sodio (Na2CO3) Saturación (1 gr aprox.)
Cianuro de potasio (KCN) Saturación (1 gr aprox.)
Estable por algunas semanas a temperatura ambiente.

Precaución. El cianuro de potasio es venenoso. No permitir que tome contacto con ácidos. Antes de descartar la
solución añadir solución de hipoclorito de sodio en exceso y espere 10 minutos. Luego tire por lavabo con
abundante agua.

F. Contraste con Fast Green FCF

Fast Green FCF (C.I. 42053) 0.24 gr
Etanol 95% 300 ml
Dura al menos 5 años y puede ser utilizado repetidamente.

Preparación de especímenes
Congelar bloques pequeños en isopentano, de no más de 2 mm 2, enfriando en nitrógeno líquido. También en
criodesecación, inclusión en parafina y criosustitución en acetona a -80ºC, aclarar en xilol y embeber en parafina.
Woltersl establece que se obtienen resultados superiores mediante criosustitución a -80ºC en acetona con 1% de
ácido oxálico (probablemente H2C2O4·2H2O), por 10 días. Cortar secciones de 7 µm y montarlas en portaobjetos
sin usar agua o algún otro adhesivo. Secar a 40ºC o menos, de esta forma las cintas no se suavizarán o derretirán.
Los cortes no se desparafinan antes de teñir (ver la nota 2 más abajo).

Procedimiento de tinción
(1) Colocar los portaobjetos en un canastillo horizontal. No remover la parafina.
(2) Sumerja en la solución GBHA de trabajo I (C) por 3 minutos o aplique 1 ó 2 gotas por portaobjetos de la
solución de trabajo GBHA II (D) y permita que se evapore hasta estar seco.
(3) Lavar en etanol 70% y luego en etanol 95%.
(4) Opcional (ver la nota 1 más abajo). Sumergir en la solución alcalina de cianuro (E) por 15 minutos.
(5) Lavar en 3 cambios de etanol 95%.
(6) Aplicar contraste si se desea: lavar en etanol absoluto; desparafinar en xilol; lavar en etanol absoluto seguido
de un lavado en etanol 95%. Teñir en Fast Green FCF alcohólico (F) por 3 minutos. Lavar en 3 cambios de etanol
95% y continuar con el paso 7.
(7) Deshidratar en 4 cambios de etanol absoluto, aclarar en xilol y montar en medio resinoso.

Resultados
Cuando se usa la solución de trabajo I de GBHA se observa un color rojo en aquellos sitios en que se encuentra el
calcio soluble, pero el material calcificado insoluble difícilmente se tiñe. Con la solución de trabajo II de GBHA el
color rojo se ve predominantemente en los sitios en que hay sales de calcio insoluble. Si se utiliza contraste con
fast green el fondo se observa verde pálido. El color rojo se desvanece luego de 2 ó 3 días, por lo tanto es
recomendable fotografiar los cortes para obtener un registro permanente.
Notas
(1) El reactivo alcalino de cianuro decolora los quelatos de metales que no sean calcio (Sr 2+, Ba2+, Cd2+, Cu2+, Ni2+).
Se debiera omitir el paso 4 si la presencia de otros metales es insignificante.

(2) Es necesario utilizar tejidos por criosustitución o criodesecación para minimizar la difusión de iones de calcio
disuelto en el citoplasma y fluido extracelular. Si el método se aplica a cortes de tejido fijados convencionalmente,
el tejido calcificado se tiñe pero también existe tinción nuclear en rojo, el RNA citoplasmático y algunos sitios de
proteoglicanos. Este artefacto se divide a la atracción electrostática de iones de calcio difundidos a aniones
macromoleculares.

(3) Un filtro verde puesto en el sistema de iluminación del microscopio fortalece el contraste de los depósitos de
calcio teñidos en rojo y se recomienda para las fotomicrografías en blanco y negro.

Fosfato y carbonato
A menudo se designa la técnica de Von Kossa como método histoquímico para Calcio, pero en realidad es un
método para fosfato y carbonato, los aniones con los cuales el metal está asociado en los tejidos calcificados
normales y patológicos.

Los cortes se tratan con nitrato de plata. Los cationes de calcio se reemplazan por plata:

(Los fosfatos son compuestos mucho más complicados que aquellos indicados en esta ecuación simple).

La reacción se lleva a cabo con luz brillante, la cual promueve la reducción de los iones de plata metálica en los
cristales de fosfato y carbonato de plata insoluble. Alternativamente, el nitrato de plata se puede aplicar en la
oscuridad o con luz tenue, y la reducción acompañada por hidroquinona, metol u otro agente fotográfico de
revelado. Finamente la plata reducida se ve negra. Cualquier plata ionizada sin reducir es removida por tiosulfato
de sodio, el cual disuelve las sales insolubles formando aniones complejos como [Ag(S 2O3)3]5-.

La técnica de Von Kossa entrega la forma y localización específica del material calcificado en los tejidos, pero es
menos sensible que los métodos para Calcio Alizarin Red S y GBHA. Para este método es mejor evitar los fijadores
ácidos. Formalina neutra es satisfactoria.

MÉTODO DE VON KOSSA

Soluciones requeridas
La solución A se debe preparar en el agua más pura que esté disponible. Todas estas soluciones se pueden utilizar
repetidamente hasta que se forme un precipitado en ellas.

A. Nitrato de Plata (AgNO3) acuoso al 1%

B. Tiosulfato de sodio (Na2S2O3·5H2O) acuoso al 5%
C. Contraste: Safranina 0.5% o rojo neutro son útiles.

Procedimiento
(1) Desparafinar e hidratar los cortes en parafina. Lavar en agua.
(2) Sumergir en nitrato de plata (solución A) a la luz del sol o directamente bajo una ampolleta de 100W por 15
minutos.
(3) Lavar en dos cambios de agua
(4) Sumergir en Tiosulfato de sodio (solución B) por 2 min.
(5) Lavar en tres cambios de agua
(6) Contraste nuclear (solución C) por 1 min.
(7) Lavar levemente en agua
(8) Deshidratar (y diferenciar el contraste) en etanol 95% y dos cambios de etanol absoluto
(9) Aclarar en xilol y montar en medio resinoso

Resultados
Los sitios en que hay fosfatos y carbonatos insolubles en negro, café o amarillo. Núcleos rosados o rojos.

Nota
En vez de nitrato de plata, Rungby utilizó lactato de plata al 0.05% sin luz brillante en el paso 2 del método. Luego
se sumergieron los cortes en Hidroquinona acuosa al 0.5% recién preparada, seguido de un lavado en agua entre
los pasos 3 y 4. El uso de lactato de plata aumentó la sensibilidad del método y dio como resultado intensos
depósitos negros.

Hierro
Los mayores depósitos de Hierro en mamíferos se encuentran en las células rojas de la sangre en forma de
hemoglobina y en las células fagocíticas (macrófagos, microglia, etc) como ferritina y hemosiderina. En aquellos
compuestos el metal está presente en la forma férrica (estado de oxidación 3+), pero cuando forma complejos
con proteínas no se encuentra disponible como ion para participar en las reacciones químicas simples.

El hierro de la ferritina y la hemosiderina se encuentra listo para ser liberado como iones Fe 3+ mediante el
tratamiento de dilución mineral ácida. En presencia de iones ferrocianuro el azul de Prusia precipita
inmediatamente:

El azul de Prusia es un compuesto más complicado que el ferrocianuro férrico implicado en la fórmula de arriba.
Este es el test histoquímico más simple para Hierro; esto se conoce como la reacción del azul de Prusia de Perls.

Una estrategia alternativa consiste en reducir todos los iones férricos a ferrosos tratando el tejido con una
solución acuosa diluida de sulfato de amonio:

El sulfuro se disuelve en el exceso de sulfato de amonio acuoso. El sulfato ferroso es soluble en minerales ácidos
diluidos, por lo tanto ocurre lo siguiente en un corte tratado con una solución de ferricianuro de potasio
acidificado:

EL precipitado del ‘azul de Turnbull’ en realidad no es ferricianuro ferroso, pero es idéntico al azul de Prusia. De
todas maneras, este método también podría detectar iones ferrosos que estaban inicialmente presentes en el
tejido.

El método de Perls simple es adecuado para la detección de Hierro en los vertebrados, pero, según Gabe, la
técnica del azul de Turnbull es más sensible y se prefiere para la demostración de Hierro en los tejidos de
vertebrados de sangre fría e invertebrados. La reacción de Perls también es útil para la demostración de ferritina
exógena introducida en animales con fines experimentales como marcador de proteínas.

Cabe destacar que el Hierro de la hemoglobina no se puede liberar como ion bajo ningún método que no
destruya el tejido.

El hierro teñible se puede remover de los cortes mediante un tratamiento ácido en ausencia de aniones
precipitantes. También son útiles para este propósito el ácido oxálico acuoso y la tionita de sodio y actúan más
rápido que los minerales ácidos diluidos.

AZUL DE PRUSIA, MÉTODO DE PERLS

El fijador elegido no debe ser ácido ni contener dicromato. Hadler comparó diferentes fijadores y demostró que
los depósitos de hierro histoquímicamente detectable, se preservan cuando se sumergen los tejidos por 24 en
formaldehído acuoso al 6% y que contenga cloruro de calcio 0.27 M con el pH ajustado a 4, agregando hidróxido
de sodio (NaOH) 0.1 M, o ácido clorhídrico (HCl) 0.1 M. Los fijadores alcohólicos o el formol buffer acuoso
resultaron ser menos satisfactorios. La descalcificación de los tejidos que contenían hueso, extrajeron el hierro
teñible de las células en la médula ósea.

Soluciones requeridas
A. Ferrocianuro ácido.
Ferrocianuro de potasio 2 gr
Agua 100 ml
Disolver y agregar
Ácido hidroclorhídrico concentrado 2 ml

Usar reactivo HCl graduado que no contiene hierro. Preparar antes de usar.

B. Contraste nuclear.
Safranina acuosa al 0.5% o rojo neutro. El fast red nuclear es el más común.

Procedimiento
(1) Desparafinar e hidratar hasta agua destilada
(2) Sumergir en el ferrocianuro ácido (solución A) por 30 minutos.
(3) Lavar en 4 cambios de agua
(4) Contraste nuclear (solución B) cerca de 1 minuto.
(5) Lavado leve en agua
(6) Deshidratar y diferenciar el contraste en alcohol de 95% y dos cambios de etanol absoluto
(7) Aclarar en xilol y montar

Resultado
Se libera un precipitado azul con Fe3+ de la ferritina y hemosiderina. Núcleo en rosado o rojo. La hemoglobina no
se tiñe. Ver nota 1 para procedimiento de control.

Notas
(1) El hierro se puede remover tratando previamente los cortes pre hidratados con ácido oxálico acuoso
(H2C2O4·2H2O) al 5% por 6 horas, o con ditionita de sodio (hidrosulfito de sodio Na 2S2O4) recién preparada al 1%
en buffer acetato a pH 4.5 por 5 minutos. El método de Perls también es aplicable para cortes de tejido incluido
en plástico. Pero los tiempos requeridos para la extracción del hierro aumentan. 12 horas para el ácido oxálico o
15 minutos para la ditionita de sodio. Un resultado negativo tras esta extracción muestra que los cortes no se
colorearon por artefacto, como resultado de la presencia de trazas de hierro indeseables en el ferrocianuro ácido.
(2) Los cortes almacenados pierden la coloración tras 1 ó 2 años almacenados. Una forma de evadir esta pérdida
se basa en la habilidad del azul de Prusia para catalizar la oxidación del 3,3’-diaminobenzidina (DAB) por el
peróxido de hidrógeno. El producto de la reacción catalizada es un polímero café insoluble que no se destiñe.
Para realizar la tinción de esta manera poner especial atención en la reacción del DAB con la peroxidasa entre los
pasos 3 y 4 del método de Perls. El procedimiento del DAB aumenta la sensibilidad de la reacción de Perls,
permitiendo la identificación de depósitos de Hierro intracelular en el cerebro, que de otra forma no es visible. La
sensibilidad con el método adherido del DAB puede ser incluso mayormente incrementada tratando las secciones
secuencialmente con plata metenamina, cloruro de oro y nitrato de uranilo.

Zinc
El zinc se asocia con la insulina en las células β de los islotes pancreáticos, con varias enzimas (especialmente con
la anhidrasa carbónica de glándulas exocrinas), en los gránulos citoplasmáticos de los leucocitos y de las células
de paneth del intestino delgado. También en sinapsis de algunas regiones del cerebro. Las proteínas que conjugan
zinc se denaturan fácilmente, con la pérdida de iones metálicos, por lo que para la demostración histoquímica es
recomendable utilizar material criodesecado, cortes por criostato de tejido sin fijar o extendidos secados al aire.
Si se utiliza un líquido fijador, el etanol absoluto enfriado es probablemente el menos objetable.
Alternativamente, los iones de zinc pueden ser precipitados por iones sulfuro u luego ser demostrados por la
técnica sensible pero no específica de plata sulfuro. Ciertamente las técnicas histoquímicas no detectan todo el
zinc que se puede demostrar por análisis químico en los tejidos animales.

Un reactivo útil para la detección de zinc es la ditizona (difeniltiocarbazona; 3-mercapto-1,5-difenilformazan)

Este compuesto forma un quelato rojo con el zinc. Otros iones forman quelatos de diferente color con la ditizona.
Este reactivo también se ha usado para la detección histoquímica de Mercurio, con el cual forma un complejo
rojo-púrpura con la siguiente estructura:

El quelato de zinc probablemente tiene una estructura similar. La ditizona y los complejos metal-ditizona son
mucho más solubles en solventes no polares que en agua, por lo tanto es necesario utilizar un medio de montaje
acuoso para los cortes ya teñidos. Además es necesario utilizar un solvente no polar para eliminar el remanente
de ditizona (el cual posee coloración propia). El procedimiento inusual en los últimos 3 pasos del método descrito
más abajo es un intento de evitar la remoción del reactivo con retención del producto deseado.

MÉTODO DE LA DITIZONA
Este método debe ser realizado con cortes de parafina fijados por criodesecación o con cortes por criostato de
tejidos sin fijar. Los cortes de criostato se deben fijar en etanol absoluto a 4ºC por 10 minutos, para aumentar la
preservación morfológica. Si es imposible evadir la fijación, se puede fijar pequeñas piezas de tejido por 1 hora a
4ºC en metanol o etanol absoluto, aclarar en xilol y preparar la inclusión en parafina. Se puede reducir la
extracción de zinc si es que los cortes no se dejan en flotación al cortar los bloques. Dinsdale fijó en etanol
absoluto, aclaró en óxido de propileno, incluyó en resina epoxi y utilizó ditizona exitosamente en cortes de 1 µm
que fueron recolectados directamente en la solución de teñido.

Soluciones requeridas
A. Solución stock de Ditizona
Ditizona 100 mg
Acetona anhidro 100 ml
Se mantiene en oscuridad por 1 ó 2 meses a 4ºC

B. Solución de complejo
Tiosulfato de sodio (Na2S2O3·5H2O) 55 gr
Acetato de sodio (anhidro) 5.4 gr
Cianuro de potasio (KCN). Precaución, venenoso. 1 gr
Agua 100 ml

Disolver las sales en el agua. Disolver un poco de Ditizona en 200 ml de tetracloruro de carbono. Agitar la solución
de complejo acuosa en un embudo de decantación con alícuotas sucesivas de 50 ml de solución de Ditizona en
CCl4 hasta que la capa de CCl4 se vuelva de un color verde claro. Este procedimiento extrae las trazas de zinc de los
reactivos. Descartar el remanente de tetracloruro de carbono (con precaución, ya que su vapor es tóxico.
Idealmente se debe recolectar en un tambor de metal o en un bote designado para el depósito de solventes
clorados. No desechar en tambores designados para solventes ordinarios como alcohol o acetona). La solución
acuosa de complejo purificada es estable por un par de meses.

C. Ácido acético 1 M
Ácido acético glacial 60 ml
Agua Aforar a 1000 ml
Se mantiene indefinidamente

D. Solución de tartrato de sodio potasio

NaKC4H4O6·4H2O 2 gr
Agua Aforar a 100 ml
Se mantiene indefinidamente

E. Solución de trabajo de Ditizona (ver la nota 1 más abajo). Se prepara al momento de usar y se usa
inmediatamente.
Solución A 24 ml
Agua 18 ml
Agregar alícuotas de 0.1 ml de ácido acético 1 M (solución C) hasta que el pH sea 3.7 (se requiere cerca de 2 ml)
Solución B 5.8 ml
Solución D 0.2 ml

F. Cloroformo (requerido para enjuagar)

Procedimiento
(1) Cortes de criostato: permitir que se sequen en los portaobjetos. Cortes de parafina: Desparafinar en 3 cambios
de xilol y dejar secar por evaporación.
(2) Sumergir los cortes en la solución de trabajo E (Ditizona) recién preparada por 10 minutos.
(3) Lavar los cortes en dos cambios de cloroformo (F), con agitación por 30 segundos.
(4) Sacar del cloroformo, dejar secar, pero no dejar que el solvente se evapore completamente (para evitar el
quiebre de los cortes).
(5) Lavar en agua, secar la mayor parte del agua con papel filtro, y montar en un medio acuoso. Aplicar
cubreobjetos de acuerdo a este tipo de preparación.

Resultados.
Color rojo-púrpura se forma donde el zinc está presente en el tejido.

Notas.
(1) La solución de complejo se mezcla con la ditizona para prevenir la formación de quelatos coloreados con
metales diferentes al zinc. 24 ml de la solución A puede diluirse con 16 ml de agua en vez de solución B, C y D,
como se describe arriba. Esta solución simple de ditizona formará complejos coloreados con Ag, Au, Bi, Cd, Cu,
Co, Fe, Hg, In, Mn, Ni, Pb, Pd, Pt, Sn y Ti, así como con zinc.

(2) El zinc es removido tratando el corte control con ácido acético acuoso 1% por 5 minutos antes de la tinción.

(3) El método sulfato de plata detectará concentraciones de zinc más bajas a las que son visibles con la ditizona.

Cobre.
Los tejidos normales de mamíferos adultos no contienen suficiente cobre para permitir la detección histoquímica
del metal, pero en la enfermedad de Wilson (degeneración hepato-lenticular), grandes cantidades del metal se
acumulan en células fagociticas del cerebro, hígado y cornea. El hígado fetal contiene en los hepatocitos cobre
que puede ser teñido. También es posible demostrar el cobre que ha sido introducido artificialmente en un
animal. Los iones de cobre pueden disociarse de las proteínas por exposición de los cortes a ácido hidroclórico
concentrado evaporado.

El método histoquímicos más satisfactorio para la detección de cobre (como ion cúprico, estado de oxidación +2),
usa un agente quelante, Ditioxamida (también llamado ácido rubeánico):

Este agente forma un quelato insoluble de color verde oscuro con el cobre en presencia del etanol y acetato en
una solución alcalina. Otros metales, como el níquel, cobalto, y plata, también pueden colorearse en complejos
con ditioxamida, pero bajo estas condiciones no reaccionan o dan complejos solubles. Se cree que le quelato de
cobre es un polímero con la estructura:

La ditioxamida se combina solo con los iones cúpricos. El agente que forma el complejo coloreado con los iones
cúpricos es p-dimetilaminobencildenerodanina:
El cobre probablemente reemplaza al hidrogeno unido al átomo de nitrógeno en el anillo generando un producto
rojo. Los compuestos café, rojo y púrpura son formados con varios otros metales. Irons encontró que mientras
que Ditioxamida y p-dimetilaminobencildenerodanina son agentes igualmente sensibles para la detección
histoquímica de cobre, solo dan una intensidad de tinción proporcional a la concentración del metal en el tejido.

Los depósitos de cobre en los tejidos de pacientes con enfermedad de Wilson pueden ser teñidos con
ditioxamida, por lo que deben ser parte de un compuesto capaz de liberar iones cúpricos. Estudios posteriores de
la interconversion de Cu(I) y Cu(II) los cuales son traídos por el tratamiento con agentes oxidantes y reductores,
puede ampliar las aplicaciones de las técnicas histoquímicas para la detección de cobre.

MÉTODO DITIOXAMIDA O ÁCIDO RUBEÁNICO.

Esta técnica es aplicable a cortes congelados o en parafina de especímenes fijados en formalina tamponada, a
secciones de criostato de tejido no fijados y cortes de tejidos desparafinados de material criodesecado. Otros
fijadores diferentes al formaldehído son probablemente aceptados pero no han sido investigados. Es ideal que el
fijador contenga aniones como fosfato, hidróxido o carbonato que forman sales de cobre insolubles.

Soluciones requeridas.
Ditioxamida (ácido rubeánico) 0,2 gr
Etanol 70% 200ml
Acetato de sodio (CH3COONa) 0,4 gr
Mantener por varios meses

Procedimiento
(1) Desparafinar hasta agua.
(2) Introducir en ditioxamida por 30 minutos.
(3) Lavar en 2 cambios de OH 70
(4) Deshidratar, aclara y montar.

Resultados.
Depósitos de cobre verde oscuro a negro.

Notas
(1) De acuerdo a Pearse los enlaces de cobre a las proteínas pueden romperse situando los cortes hacia abajo
sobre un vaso precipitado de Ácido clorhídrico concentrado por 15 min seguido por inmersión de 15 min en OH
absoluto.

(2) El contraste puede ser aplicado luego del paso 3.

MÉTODO P-DIMETILAMINOBENCILDENERODANINA .
El siguiente método es para secciones en parafina de material que ha sido fijado en Formalina tamponada neutra.

Soluciones requeridas
A. p-dimetilaminobencildenerodanina 0,4%
p-dimetilaminobencildenerodanina 24gr
Alcohol 100 6 ml
Preparar al momento de usar

B. Acetato de sodio 65 mM
Acetato de sodio hidratado (CH 3COONa.3H2O) 2g
o sin hidratar (CH3COONa) 1,6gr
 Agua 100 ml
Esto es estable de manera indefinida. No debe ser usado si presenta signos de moho o bacterias.

C. Solución de trabajo p-dimetilaminobencildenerodanina.

Inmediatamente antes de usar filtrar solución A en 45ml de solución B.

D. Contraste.
Un hemalumbre en adecuado (ver capítulo 6).

Procedimiento.
(1) Desparafinar e hidratar hasta agua destilada.
(2) Poner los cortes en la solución de trabajo p-dimetilaminobencildenerodanina (C) en una jarra coplin cerrada,
durante la noche a 37°C (Ver nota 1 más abajo).
(3) Lavar en 6 cambios de agua.
(4) Contrastar el núcleo (ligeramente) con hemalumbre.
(5) Lavar en 4 cambios de agua.
(6) Montar usando un medio acuoso como Apathy’s (ver nota 3 más abajo).

Resultados.
Sitios de cobre café-rojizo, como depósitos granulares dentro de las células. Núcleo (si se ha contrastado) se
tiñen azules.

Notas.
(1) Churukian reduce el tiempo de tinción a 11 minutos incrementando la T° a 80°C, en un horno microonda. El
resultado, a veces, es menos satisfactorio que el método de toda la noche.

(2) También ver nota 1 seguido del método anterior.

(3) Instrucciones para hacer medios acuosos están explicados en el capítulo 4.

Plomo
El plomo no posee función fisiológica conocida. Se puede demostrar histoquímicamente en los tejidos de
animales o gente que ha sido envenenada por sus sales. Este elemento se acumula en inclusiones intranucleares,
especialmente en el hígado (Goyer and Cherian, 1977)

El método histoquímico más simple para plomo se basa en la formación de cromato insoluble, PbCrO 4, que da
coloración amarilla. En forma de asegurar la precipitación de los iones de plomo es conveniente incluir iones
sulfato en la fijación. El sulfato de plomo es insoluble en agua (solubilidad del producto= 1.6 x10 -8), pero el
cromato es incluso menor (solubilidad del producto = 2.8 x 10 -13), obteniendo la reacción:

La reacción sucede, aunque lentamente, en la dirección indicada.

Este es un test bastante específico para plomo (los otros metales que forman cromatos insolubles son Ba, Sm, Sr,
Tl y Zn). Sin embargo, el producto no es muy sobresaliente en cortes delgados. Se obtiene una coloración más
intensa aplicando un agente quelante, rodizonato de sodio o potasio:
MÉTODO RODIZANATO.
Bajo condiciones ácidas débiles se forma un quelato de rojo a rosado con el plomo. Soluciones neutras del
reactivo dan un color café (Molnar 1952). Bario, estroncio y mercurio también pueden formar compuestos rojos
con el rodizonato y con el hierro forma un compuesto azul negruzco (Pearse 1985).

Este método se aplica a cortes congelados o fijados con formaldehído e incluidos en parafina. Un anión como
fosfato o sulfato debe estar presente en el fijador para asegurar la precipitación de las sales de plomo. Si la
técnica se aplica en hueso el sulfato de sodio se debería agregar al líquido descalcificador.

Solución requerida
Rodizonato de sodio o potasio 0.2 gr
Agua 99 ml
Ácido acético glacial 1 ml
Se debe preparar al momento de usar y protegido de la luz.

Procedimiento
(1) Poner los cortes en agua
(2) Sumergir en la solución de rodizonato por 30 minutos en oscuridad
(3) Lavar en agua
(4) Montar en un medio soluble en agua

Resultados
Sitios de las sales de plomo rojo a rosado, o café.

Notas
(1) Muchos otros metales se colorean con los complejos de rodizonato, especialmente Ag, Ba, Bi, Ca, Cd, Hg 22+, Sn,
Sr, Tl y UO22+. Es poco probable confundirlos con el plomo para animales experimentales. Ver Feigl y Anger y Lillie
y Fulmer para métodos sugeridos para aumentar la especificidad por el plomo si sospecha de la presencia de
algunos de estos metales.

(2) Estructuras normalmente queratinizadas pueden ser teñidas por el rodozinato (Shelley 1970). Cortes de tejido
que se sepa que no tienen plomo deben ser usados como control negativo.

Métodos de alta sensibilidad pero de baja especificidad.

Algunas técnicas histoquímicas para iones metálicos tienen alta sensibilidad que aquellos descritos en las
secciones precedentes de este capítulo. Tales métodos, sin embargo, no identifican los elementos detectados con
cualquier certeza. La especificidad algunas veces puede ser mejorada por el uso de procesos controles, o el
investigador puede ya saber que metal es, y estar interesado solo en su localización en el tejido. Dos de estos
métodos serán ahora discutidos.

DETECCIÓN DE METALES CON HEMATOXILINA.

La habilidad de la hemateína para formar complejos coloreados oscuros con muchos metales hace que el
colorante sea útil en la histoquímica de iones inorgánicos. Para gran sensibilidad, la solución debería estar
frescamente hecha desde la hematoxilina. De acuerdo a Lillie y Fulmmer la hematoxilina, por si misma es el
reactivo en este test histoquímicos. Parece ser, sin embargo, que la hemateína (formada por oxidación
atmosférica) es la sustancia que forma complejos metálicos coloreados.

Procedimiento.
Este método puede ser aplicado a secciones congeladas o en parafina. El fijador debería contener un precipitado
iónico apropiado (buffer fosfato, pH 7-8, es generalmente adecuado) y el agua purificada disponible y otros
químicos deben ser usados en el fijador y otras.

Soluciones requeridas.
(1) Tomar las secciones al agua (los cuales no deben estar contaminados con trasas de sales metálicas).
(2) Disolver 50 miligramos de hematoxilina en 1 ml de etanol absoluto. Adherir a la solución a 99 ml del agua más
purificadamente disponible. La solución es casi incolora al principio y se vuelve rosada al detenerse.
(3) Teñir las secciones en la solución de hematoxilina preparada en forma fresca. Examinar después de 2 horas. Si
no se visualiza nada, dejar toda la noche.
(4) No lavar en agua. Transferir desde la solución de tinción a OH de 95°, luego 2 cambios de etanol absoluto.
(5) Aclarar en xilol y montar en un medio resinoso sintético.

Resultados.

Al= negro azulado Pb= azul

Be= azul Pt= azul

Bi= rosa Rh= azul

Cr= negro azulado Sn= rojo violeta

Cu= verde azulado Ta= rojo cafesoso

Dy= azul Tb= azul

Fe=negro azulado Ti= café

Ga= negro azulado Tl= rojo violeta

Hf= negro azulado U= azul

Ho= azul Yb= azul

In= verde azulado Zn= azul

Ir= azul Zr= negro azulado

Mn= AZUL

Mo = azul

Nb= café

Nd= azul

Ni=AZUL

Os= Azul o café verdoso

Notas.
(1) Todos los metales anteriores reaccionan con hematoxilina no tamponada (pH 5-6). Los niveles de pH óptimo
para tinción de algunos metales son dados por Lille y Fulmmer, que también recomendaron un medio de montaje
con un índice de refracción bajo, por lo que la arquitectura de las partes no teñidas de las secciones pueden ser
vistas.

(2) La sensibilidad del método puede ser aumentada por tiempo de tinción prolongado, que puede ser tan largo
como 48 horas.

(3) Otro agente quelante cromogénico de baja especificidad es bromopiridilazodietillaminofenol (bromo- PADAP).

Este ha sido usado como un agente histoquímicos extremadamente sensible para varios metales. Tratando las
secciones con mezclas adecuadas de agentes complejos incoloros, es posible “enmascarar” las reacciones de color
de algunos metales con bromo-PADAP preservando aquellos en vez de otros. El enmascaramiento es derivado
desde una práctica comparable ampliamente usada en química analítica, pero los agentes quelantes para uso
histoquímicos no pueden ser seleccionados solo en la base de sus propiedades químicas. Las reactividades de
agentes quelantes con sales metálicas en tejidos a menudos difieren significativamente de las reacciones con las
mismas sales en un tubo de ensayo.

MÉTODO SULFURO DE PLATA DE TIMM

En esta técnica el espécimen fresco es fijado en un líquido conteniendo iones sulfuro, tales como sulfuro de
hidrogeno (burbujeado a través del fluido antes de usar) o sulfuro de sodio (más conveniente y menos hediondo,
pero usable solo con fijadores acuosos). Los metales son precipitados:

En la ecuación anterior, M2+ es un catión de cualquier metal que tiene un sulfuro insoluble. El método ha sido
usado histoquimícamente para detectar plata, oro, calcio, cobalto, cobre, fierro, mercurio, níquel, plomo, platino y
zinc. De estos, el cobre, plomo, mercurio y zinc han sido la mayoría a menudo estudiados.

El siguiente paso del método de Timm es la preparación de secciones del espécimen fijado y tratado en sulfuro.
Las secciones son tratadas con un desarrollador físico, el cual es una solución conteniendo iones de plata, un
agente reductor “desarrollador”, y un agente estabilizador que retarda la reducción de los iones de plata al metal.
La deposición de la plata ocurre primero en sitios donde hay depósitos de metal sulfurados, porque estos tienen
una acción catalítica. La plata depositada también actúa como un catalizador, por lo que los depósitos negros de
plata continúan acumulándose, así aumentando el tamaño y la densidad óptica de los precipitados de sulfuro
originales. Los portaobjetos deben ser removidos del desarrollador físico y lavados en agua antes de que exista
una reducción Ag+ a Ag en sitios no catalíticos. El método ahora descrito está basado en la modificación de Timm.

Soluciones requeridas.
A- Fijador acuoso (por perfusión).
Sulfuro de sodio (Na2S) 11.7 gr
Fosfato de sodio, monobásico 11.9 gr
Agua 1 Lt.
Mezclar en la campana de gases, inmediatamente antes de usar. El sulfuro de sodio no puede ser pesado con
exactitud si no es nuevo y está seco.
Un buffer fosfato 3% en solución con glutaraldehído también será necesitado (ver capítulo 2).

B- Fijador alcohólico (por inmersión).

 Burbujas de sulfuro de hidrógeno (de un equipo Kipp’s o un generador similar) en 200 ml de OH 70° o fluido
de Carnoy, por 5 minutos en la campana de gases.
Precaución: El sulfuro de hidrógeno es mal oliente y venenoso.

C- Desarrollador físico.
Este se hace a partir de cuatro soluciones stock estables.
Los primeros tres ingredientes del desarrollador deben mezclarse con varias horas de anticipación, pero el último
(AgNO3) se agrega inmediatamente antes de usar.
Resina arábica acuosa al 50% (p/v) 60 ml
Buffer citrato 10 ml
Hidroquinona (acuosa al 5,67% (p/v) 30 ml
Nitrato de plata (acuoso al 17% (p/v) 0.5 ml

Procedimiento.
(1) Situar una rata anestesiada para ser fijada por perfusión vascular. Inyectar 5 ml de solución de sulfuro de sodio
en la vía, luego perfundir el buffer glutaraldehído por 3 minutos. Luego, perfundir el sulfuro de sodio (solución A)
por 10 minutos. Usar 250 ml de la solución. Remover los órganos de interés y continuar la fijación por inmersión
de piezas pequeñas (no mayor a 2 mm de espesor) en el buffer glutaraldehído por 1 hora.
Alternativamente, se pueden fijar las piezas de tejido por inmersión en un fijador alcohólico saturado con sulfuro
de hidrógeno (solución B), durante toda la noche a T° ambiente.
(2) Deshidratar en alcoholes graduados.
(3) Incluir en plástico (luego de la fijación acuosa), o bien, deshidratar, aclarar (48 horas el tolueno es
recomendado) e incluir en parafina. Cortar y montar en portaobjetos.
(4) Llevar los cortes al agua (La parafina debe ser removida, pero el plástico no).
(5) Agregar el último ingrediente al desarrollador físico (solución C) y sumergir los cortes en él por 30-90 minutos.
Controlar cada cierto tiempo (lavando en agua). El exceso de tiempo en el desarrollador provoca una reducción no
catalítica de la plata, con coloraciones café generalizadas no específicas en los cortes.
(6) Lavar en agua, luego lavar por 5 minutos en agua corriente.
(7) Contraste opcional. Cualquier método que no de coloraciones oscuras es adecuado.
(8) Lavar, deshidratar, aclarar y montar.

Resultados.
Sitios donde se encuentren metales pesados de color negro. Fondo de acuerdo al contraste.

Notas
(1) La resina arábica se disuelve lentamente. La solución viscosa debe ser filtrada en una tela, y almacenada en el
congelador.

(2) Preparación del stock de buffer citrato:

Ácido cítrico (H3C6H5O7.H2O) 25.5 g
Citrato de sodio (Na3C6H5O7.2H2O) 23.5 g
Disolver en agua hasta los: 100 ml
El pH en de 3.7. Se mantiene por varios meses.

(3) El método sulfuro de plata de Timm también puede ser usado en microscopía electrónica. El zinc puede ser
detectado en vesículas sinápticas de ciertas neuronas en el cerebro.
(4) Sodio selenizado puede ser usado, con ventaja, en vez del sulfuro, para precipitar zinc endógeno en el sistema
nervioso central.