Dinámica de regulaciones

En resumen, las dinámicas de regulación de la actividad de las proteínas son complejas y pueden ocurrir
a diferentes tiempos en la comunicación y señalización celular. Las proteínas pueden responder de
manera diferente a diferentes condiciones, como su abundancia, identidad, localización y dinámica de la
señal, lo que influye en la frecuencia, amplitud, duración y retardo de la respuesta en un gráfico de
actividad versus tiempo. Además, la respuesta de una misma proteína puede variar frente a diferentes
estímulos, lo que conduce a efectos funcionales distintos.
Las proteínas pueden estar reguladas por diferentes mecanismos, como niveles de síntesis y
degradación, propiedades específicas de las proteínas, ubicación en diferentes tejidos o compartimentos
subcelulares, control directo mediante moléculas pequeñas (como metabolitos) o interacciones entre
proteínas. Las modificaciones postraduccionales también pueden permitir el control de la actividad de las
proteínas al cambiar sus niveles, propiedades y localización. Comprender las vías de señalización y los
mecanismos de regulación permite proponer el mecanismo de funcionamiento del sistema de control,
como el feedback positivo o negativo o forward. Además, es posible dirigir una respuesta determinada
simulando otra que sea más sostenida o más acotada, lo que puede tener efectos funcionales distintos
en la célula.

Modificaciones postraduccionales: Las modificaciones postraduccionales son cambios químicos en

las proteínas después de su traducción. Pueden ser reversibles o irreversibles y afectan la actividad de
la proteína, como su estabilidad, localización, interacciones y función. Ejemplos de modificaciones
postraduccionales incluyen fosforilación, metilación, acetilación y ubiquitinación.
Comunicación intercelular: La comunicación intercelular es esencial para regular la actividad de las
proteínas. Las células se comunican mediante señales químicas, contacto célula-célula y señales
eléctricas, que afectan la actividad de las proteínas y desencadenan respuestas celulares específicas.
Por ejemplo, la activación de receptores de membrana puede desencadenar cascadas de señalización
que afectan proteínas intracelulares.
Feedback positivo y negativo: La retroalimentación positiva y negativa regula la actividad de proteínas.
El feedback positivo amplifica una señal, generando una respuesta más intensa, mientras que el
feedback negativo reduce o atenúa una señal, ayudando a mantener la homeostasis celular. Estos
mecanismos pueden operar a nivel de la transcripción, traducción, actividad enzimática y degradación
de proteínas, entre otros procesos.
Cambios en la abundancia y localización de proteínas: La actividad de las proteínas puede ser
regulada mediante cambios en su cantidad y ubicación. Por ejemplo, la síntesis o degradación de una
proteína puede estar regulada en respuesta a señales celulares específicas, lo que afecta su actividad a
lo largo del tiempo. Además, la ubicación subcelular de una proteína puede influir en su actividad, ya que
diferentes compartimentos celulares pueden proporcionar contextos bioquímicos y funcionales distintos.
Respuesta específica a estímulos: Una misma proteína puede mostrar respuestas distintas ante
diferentes estímulos, lo que puede resultar en efectos funcionales variados. Por ejemplo, la misma
proteína puede responder de manera diferente en términos de frecuencia, amplitud, duración y retardo
en presencia de diferentes estímulos celulares. Esto puede ser debido a la especificidad de las señales y
vías de señalización involucradas, lo que permite una regulación precisa y dinámica de la actividad de
las proteínas en respuesta a las condiciones celulares cambiantes.
En resumen, la regulación de la actividad de las proteínas es un proceso dinámico y altamente regulado
que involucra una compleja red de mecanismos, incluyendo modificaciones postraduccionales
Muerte celular
El ensayo de viabilidad mide la actividad de LDH y GOT en un medio de cultivo celular para detectar la
pérdida de integridad de la membrana plasmática, indicada por la liberación de estas enzimas al medio.
Se utilizan células vivas y se cuantifican las proteínas en el medio para determinar la viabilidad celular.
El ensayo de integridad de membrana evalúa si la membrana celular está dañada utilizando una sonda
fluorescente llamada PI. Si la sonda tiñe las células, indica que hay pérdida de integridad de la
membrana.

Estos ensayos no identifican tipo de muerte celular

Diferenciación de tipo de muerte celular

La tinción con Hoechst utiliza una molécula fluorescente llamada Hoechst, que es permeable a la
membrana celular, para visualizar la integridad de la membrana. Durante la apoptosis, se observa un
patrón de tinción con aglomeraciones y fragmentación en el núcleo. Esta técnica es una manera sencilla
de identificar la apoptosis en células, mediante la adición de Hoechst al medio de cultivo y la
observación del patrón de tinción.
El ensayo de TUNEL utiliza una marcación fluorescente llamada deoxi-UTP para identificar cortes en el
DNA durante la apoptosis. Se inserta deoxi-UTP en las áreas donde ocurren los cortes, y luego se utiliza
un anticuerpo que reconoce esta molécula. Esto permite identificar las células apoptóticas con
fragmentación del DNA, sin afectar a las células normales del tejido. Es una técnica que permite marcar
específicamente las células apoptóticas en un tejido intacto.
El ensayo con ANEXINA V utiliza una molécula fluorescente que se une a la fosfatidil serina expuesta en
la membrana externa durante la apoptosis. Esto permite detectar y visualizar las células apoptóticas, ya
que la fosfatidil serina se expone hacia afuera durante la apoptosis. Con un fluoroforo se marca a
ANEXINA V para poder visualizar e identificar las células en proceso de apoptosis.

La mejor manera de establecer una muerte por apoptosis es utilizar más de una estrategia
experimental. Incluso combinadas.
Ejercicio para pensar
Se realizó un experimento en el cual se cultivaron células y se indujo la muerte celular con etanol. Se
llevó a cabo una tinción con PI, que es de color rojo, y se observó que con el tiempo la integridad de la
membrana celular se mantuvo intacta. Sin embargo, a los 120 minutos se pudo observar una marca roja
en las células, lo que confirmó la pérdida de integridad de la membrana.
Además, se realizó un marcaje con ANEXINA V, una molécula fluorescente, y se observó que estas
células también estaban marcadas, a pesar de que la integridad de la membrana no se había perdido.
También se llevó a cabo una marcación con Hoechst, que reveló una disgregación del núcleo celular.

El experimento mostró que las células cultivadas experimentaron apoptosisdado a la pérdida

de integridad de la membrana detectada con la tinción de PI (propidio yoduro), la presencia de
ANEXINA V marcada que se une a la fosfatidil serina expuesta en la membrana externa durante
la apoptosis, y la disgregación del núcleo observada con la marcación de Hoechst.

la muerte celular es parte de la homeostasis de los tejidos en diferentes contextos, incluyendo la

apoptosis durante el desarrollo embrionario, la muerte por necrosis en el tejido del miocardio después de
un infarto, la desaparición de tejido mesenquimático en el desarrollo de las extremidades embrionarias,
la eliminación de células durante la formación de neuronas motoras y las gonodas, y la selección
positiva y negativa en el sistema inmunológico.
Se destaca que la muerte celular no siempre está asociada con patologías, sino que puede ser un
proceso regulado y necesario para el desarrollo y mantenimiento de los tejidos. Además, se mencionan
ejemplos de cómo la muerte celular controlada es parte de la morfogénesis y la formación de estructuras
en diferentes organismos.

En resumen, se enfatiza que la muerte celular es un proceso normal y regulado en distintos

contextos biológicos, y que cumple un papel importante en la homeostasis y desarrollo de los
tejidos.
Muerte celular por ATP
Niveles de ATP: Los niveles de ATP en la célula son determinantes en el tipo de muerte celular que se
produce. Cuando hay una depleción moderada de ATP, es decir, una disminución de aproximadamente
el 50% de los niveles normales de ATP, las células pueden morir por apoptosis. Sin embargo, cuando
los niveles de ATP caen por debajo del 20%, se habla de una depleción severa de ATP, lo que conduce
a necrosis. Apoptosis requiere ATP, necrosis no requiere ATP.

Durante necrosis se produce un desbalance de electrolitos dentro y fuera de la célula debido a la

falta de funcionamiento de las bombas que requieren ATP. Esto puede resultar en la acumulación de
sodio dentro de la célula, lo que lleva a la entrada de agua y la hinchazón de la célula, finalmente
provocando su ruptura o explosión.
Procesos metabólicos: El ATP es crucial para los procesos metabólicos de las células, como la
generación de energía y la síntesis de moléculas importantes. La disminución de los niveles de ATP
puede afectar la capacidad celular para llevar a cabo estos procesos y puede resultar en la muerte
celular.
Por otro lado, la autofagia es un proceso de muerte celular asociado con la degradación y reciclaje de
componentes celulares, pero que puede tener un estado intermedio de recuperación. Hay muchas
vacuolas y perdida de organelos y formación de autofagosomas.
Regulación del proceso de muerte: Los niveles de ATP afectan la regulación de la muerte celular, con
una disminución severa de ATP que lleva a la necrosis y una disminución moderada que puede resultar
en apoptosis. El ATP juega un papel importante en determinar el tipo de muerte celular que ocurre.

En resumen: El ATP es crucial en la muerte celular, regulando el tipo de muerte que ocurre
según los niveles de ATP en la célula. Además, los niveles de ATP también influyen en los
procesos metabólicos celulares, y una disminución de ATP puede afectar la viabilidad y
supervivencia de la célula.

Mecanismos de Apoptosis
El estudio de la descomposición de las vías de señalización de muerte celular en el
organismo simple C. elegans ha revelado la función de proteínas clave como CED-3, una
caspasa cuya actividad depende de CED-4, un regulador positivo de la apoptosis.
Además, se ha descubierto que CED-9 actúa como un inhibidor de CED-4, bloqueando su
actividad pro-apoptótica. Sin embargo, la presencia de EGL-1 puede inhibir a su vez a
CED-9, lo que resulta en la inducción de la apoptosis. Estos hallazgos han contribuido
a la comprensión de la regulación de la muerte celular en organismos más complejos,
como mamíferos, y destacan la importancia de estudiar organismos simples para entender
los mecanismos fundamentales de procesos biológicos.

hay distintos tipos de caspasas, algunas de las cuales son sintetizadas como
zimógenos inactivos, al igual que muchas proteasas, lo que significa que necesitan ser activadas para
ser funcionales. las caspasas muestran una dependencia de actividad unas sobre otras, donde algunas
caspasas activan a otras caspasas en una cascada de activación. Por ejemplo, mediante la proteólisis, o
corte proteico, en condiciones especiales, como niveles de calcio específicos o la presencia de otras
caspasas activadas.
Por otro lado, algunas caspasas, como la caspasa 9/ 8, tienen dominios o regiones específicas en su
estructura, como el dominio de reclutamiento de la caspasa y el dominio efector de muerte,
respectivamente, que son característicos de estas proteínas. Otras caspasas pueden auto hidrolizarse,
lo que implica que existe un mecanismo que permite a estas caspasas actuar sobre sí mismas.
Las caspasas muestran una dependencia de actividad unas sobre otras, donde algunas caspasas
activan a otras caspasas.
Por ejemplo, la caspasa 8/10 y la caspasa 9 activan a la caspasa 3, que a su vez activa a la caspasa 7,
que a su vez activa a la PARP y también corta sustratos celulares en general.

Estas caspasas activadas, conocidas como caspasas efectoras, son las responsables de llevar a cabo la
degradación proteolítica de diferentes sustratos celulares y son fundamentales en el proceso de
apoptosis.

La activación de caspasas y la posterior degradación de proteínas celulares son eventos clave

en la regulación de la apoptosis y en la eliminación de células dañadas o innecesarias en el
organismo.

Las caspasas efectoras, que son enzimas involucradas en el proceso de apoptosis o muerte celular programada,
tienen varios efectos sobre distintos sustratos en la célula. Estos efectos incluyen:

Modificacion de la membrana celular: las caspasas cortan la enzima fosfatasa flip, encargada del movimiento
flipflop de las fosfatidil serina en la membrana celular. Esto altera la composición de la membrana celular y causa
exposición de fosfatidil serina al lado externo de la membrana, provocando cambios en la adhesión celular y la
perdida de la forma normal de la célula.

Modificación del citoesqueleto: Las caspasas efectoras pueden cortar proteínas como ROCK1, una quinasa que
regula el citoesqueleto de la célula. El corte de ROCK1 libera su subunidad catalítica, lo que lleva a una actividad
kinasa constitutiva y cambios en la estructura de la actina cortical, lo que provoca la formación de protuberancias
en la membrana celular llamadas "blebs".

Fragmentación del Golgi: Las caspasas efectoras pueden cortar proteínas como GRASP65, que es necesaria para
mantener la estructura del Golgi. El corte de GRASP65 provoca la fragmentación del Golgi.

Modificacion de la cromatina: También actúan sobre la Kinasa MST1, liberando sus región catalítica activando la
enzima. Así esta kinasa MST1 fosforila sustratos como histonas H2B, lo que conlleva a la condensación en la
cromatina.
Hidrolisis del ADN por AIF y Endonucleasa G

Fragmentación del núcleo: pueden actuar sobre las laminas nucleares llevando la fragmentación del núcleo.

Activación de ADNasa: pueden cortar el inhibidor de a ADNasa CAD citoplasmática (ICAD), liberando a CAD y
permite que entre al núcleo y corte el ADN entre los nucleosomas, fragmentandolo

Otros sustratos son: PARP, inactivándolas y, factores de elongación, deteniendo la transducción de señales en la
célula apoptótica.

En resumen, las caspasas tienen múltiples efectos en la célula durante la apoptosis, incluyendo
la pérdida de adhesión celular, reordenamiento del citoesqueleto, fragmentación del Golgi y del
núcleo, condensación de la cromatina y
modulación de la actividad de diversas
enzimas y proteínas celulares.

Vía extrínseca de la apoptosis

La vía extrínseca de apoptosis es un proceso programado
de muerte celular que se activa mediante la unión de ligandos a receptores específicos, la activación
de proteínas adaptadoras, la dimerización de las caspasas iniciadoras y la activación de las caspasas
efectoras.
En esta vía, se activan las caspasas 8 y 10, que son caspasas iniciadoras. Para que estas se activen,
deben dimerizar en presencia de proteínas adaptadoras que las unan. De esta manera, una caspasa
iniciadora actúa sobre la otra y se activan.
Estas proteínas adaptadoras se unen a los receptores FAS, DRA, DR3 y TNFR que están presentes en la
membrana celular y son activados por ligandos como FASL/APO-1L, TRAIL/APO-2L, APO-3L o TNF.
Entonces, los ligandos activan a los receptores (se trimerizan), estos reclutan proteínas adaptadoras
de caspasas iniciadoras, para que las caspasas se activen.

Algunos de los factores que activan la expresión de bak son: p53, factores de crecimiento, señales de extres celular

Ejemplo en Células T citotóxicas

En linfocitos T se induce la muerte a través del ligando FASL presente en otra célula que actúa sobre
el receptor FAS del linfocito T. Luego, se activa la vía de receptores de muerte, primero se trimeriza
el receptor FAS, luego se une FADD permitiendo reclutar pro-caspasas 8. Pro-caspasa 8 se dimeriza y se
activa. Esta actúa sobre caspasa 3, y esta ultima actúa sobre sustratos celulares como ICAD, ROCK1,
GRASP65, etc (anteriormente nombrados).

Vía intrínseca de la Apoptosis

La vía intrínseca de la apoptosis es un mecanismo que se activa en respuesta a estímulos internos de la
célula, como daño al ADN o estrés celular. Parte con la liberación de Citocromo C (Cyt C) desde la
mitocondria al citoplasma. Luego Cyt C junto con la hidrolis de dATP a dADP se induce la agregación del
Apoptosoma (7 dominios). Este complejo activa la caspasa 9 mediante autoproteolisis. La Caspasa 9
activa a otras caspasas como Cas-3, y esta corta proteínas celulares llevando a apoptosis.

Los principales dominios de Caspasas son:

Dominio de activación (CARD o DED), importante para la
interacción con proteínas adaptadoras como FADD o Apaf-1.
-CARD (dominio de reclutamiento y activación de caspasas);
DED (dominio inductor de muerte)
Los principales dominios de Apaf-1 son:
Dominio de unión a dATP. Dominio de unión a Citocromo C. Dominio CARD. Dominio de unión a pro-cas 9.
Rol de Blc-2
Blc-2 es un factor antiapoptotico, evitando el corte de PARP y la salida de Citocromo C.

Inhibidor del inhibidor de apoptosis BH3

BCL-2 y bax son miembros de la misma familia y tienen funciones opuestas en la apoptosis. BCL-2 es anti-
apoptotico, BAX es pro-apoptotico. Estos interactúan entre si para regular el proceso de apoptosis.
Ambas proteínas tienen dominios BH (BLC-2 homology) que permiten su interacción.
BLC-2 forma un dimero con BAX, inhibiendo su actividad pro-apoptotica. Pero, en respuesta a señales de
apoptosis, los niveles de BAX libres aumentan. Esto conduce a que Bax forme homodimeros en la mb mitocondrial
y genere poros.
La formación de poros en la mb mitocondrial es facilitada por la interacción de BAX con otras proteínas de su mb,
como VDAC. Estos poros permiten la liberación de Citocromo C y otros factores apoptoicos, llevando a apoptosis.

Moléculas pro-apoptotico:
Familia Bh multi-domain: bax. Bak, bok. Posee dominio
BH3, BH1, BH2 y TM.
Familia BH3-only: bid, bim, mad, Puma, bmf, bik, Noxa.
Proteínas pequeñas como bib, bim, bad, puma y bmf, tBid
(bid truncado), con dominio BH3-only se unen a bcl-2
impidiendo que bcl-2 bloquee a bax, y así permitiendo
que Bax genere canales MAC (canal mitocondria inducido
por apoptosis) en la mb mitocondrial.

A su vez, Bad puede unir se bcl-2 desplazando a bim. Bim

también puede formar un heterodimero con bax, permitiendo generar el oligómero.

Moléculas Anti-apoptoticas: Bcl-2, se ubica en la membrana externa de la mitocondria.

Inducción de proteínas BH3-only
Factores que contibuyen a la activación de proteínas del ciclo celular involucradas en el desarrollo de cancer.

Los oncogenes mutados/alterados pueden contribuir a desarrollo

de cáncer. El daño al ADN causado por radiación, productos
químicos, infecciones virales, y otros factores también llevan a
activación de P53, un regulador de ciclo celular. El acortamiento
de telómeros también activa a p53.

P53 puede inducir la activación de proteína de BH3-only como

Noxa y Puma.

La deprivación de estimulación por citoquinas, o bien, estímulos

de proliferación o factores de crecimiento presentes (baja señalización exterior), puede activar la expresión de
proteínas BH3-only como Bim, Hrk, Bad y Puma.

Por otro lado, diversos factores puedan activar estas proteínas. El aumento de flujo de calcio intracelular puede
activar Bim. La radicion UV activar a Bim y Bmf. Los glucocorticoides (hormonas esteroidales como Ester de forbol
y estaurosporina) activar a Puma.

También la presencia de drogas como Taxol inducen a Bim. Bortezomid induce Bim y Bok.

Y la anoikis (apoptosis por perdida de contacto matriz extracelular-celula)

Entonces, existen diversos factores que pueden activar diferentes proteínas reguladoras del
ciclo celular y pueden estar involucradas con el desarrollo de cáncer.

Junto a la salida de Citocromo C desde la mitocodria, también se

encuentra la Endonucleasa G, que participa en la fragmentación del
ADN del núcleo. También se libera AIF, un factor inductor de
apoptosis relacionado con la fragmentación del ADN.

La liberación de SMAC desde la mitocondria resulta en su unión con

Diablo, luego esto inhibe a XIAP, un inhibidor de la acción del
apoptosoma. Es una proteína inhibidora de apoptosis.
Es decir, se tiene la via extrínseca con la activación de los receptores de muerte que activan CAS-8  CAS-3. Y la
via intriseca, con la liberación de proteínas pro-apoptoticas que generan el apoptosoma  CAS-9  CAS-3.

Liberacion de Citocromo C por Calcio

La proteína bid, conecta las vías intrínseca y extrínseca. Esta es cortada por Cas-8, por la via extrínseca, formando
bid truncada (tbid), y luego promueve la liberación de citocromo C. otras proteínas como Granzima B (de
macrófagos que fagocitan) también corta bid, y conduce a apoptosis.
Por otro lado, aumento de la concentración de calcio sobre la
mitocondria también aumenta la liberación de Citocromo C. este
efecto es independiente de las proteínas de la familia Bcl-2.
Calcio, Cambia la permeabilidad de la mitocondria causándole
hinchazón.
Calcio interactúa con proteínas reguladoras de calcio en
mitocondria, como el translocador de nucleótidos de adenina
(ANT) en membrana interna y la proteína reguladora de la
permeabilidad (PBR o receptor de benzodiazepinas periferico), en
la membrana externa que une ligandos como benzodiasepina,
esteroides y porfirinas; y VDAC.
Estas 3 proteinas regulan la entrada y salida de calcio

Señales apoptóticas
Las proteínas pro-apoptoticas de la familia bcl-2 salen por dos formas de la mitocondria: a través del canal MAC
generado por proteínas Bax y tbid -ver imagen-; y por el poro de permeabilidad transitoria (PTP).
El PTP se forma por un translocador de nucleótidos de adenina (ANT) y/o un canal aniónico dependiente de voltaje
(VDAC) y permite la salida de proteínas desde la matriz mitocondrial como Citocromo C, factor inductor de
apoptosis (AIF), SMAC (se une a inhibidores de apoptosis como IAP) y Diablo (se une a inhibidores de apoptosis
igual que SMAC), comenzando la activación de caspasas.
NOTA: IAP, posee región RING (ubiquitin ligasa) y manda a degradar a Caspasas. Funciona similar a la XIAP. Ambas
son proteínas inhibidoras de apoptosis
La estimulación del poro PTP puede ser por ROS, calcio (en la cercanía de VDAC), Bax, bak y otros.
La apoptosis se da por la activación de receptores de muerte que activan Caspasa 8, o bien, por Caspasa 9 que se
activa por liberación de Citocromo C.
Por un lado, la expresión de p53, induce bax, bad, Noxa, Puma e inhibe la expresión e Bcl-2, resultando en
apoptosis. Las modificaciones postraduccionales como fosforilación de bad por PKB, puede inhibir su asociación
con Bcl-2, impidiendo la apoptosis.
Por otro lado, la hinchazón de la matriz mitocondrial provocada por la entrada de agua resulta en la caída del
potencial de membrana de la mitocondria, esto provoca la caída de los niveles de ATP en función del daño. En
condiciones moderadas, causa apoptosis; en condiciones severas, causa necrosis.

En conclusión, el poro PTP y las proteínas pro-apoptoticas de la familia bcl-2 son cruciales en el
proceso de apoptosis, mientras que la disminución de los niveles de ATP puede causar tanto
apoptosis como necrosis dependiendo de la gravedad del daño en la célula.
 En esta imagen se puede ver que
PKB tiene un rol anti-apoptotico.
PKB fosforila Bad impidiendo que se
una a Bcl. Bcl libre se une a bak
impidiendo que forme el oligomero
y por lo tanto el canal MAC.
t-bid puede unirse tanto a bak como
a bak fomando un heterodímero
que genere el oligomero (canal
MAC).

En resumen, la línea de eventos en muerte celular, por via intrínseca (activación de p53) es:
1. Activación de la apoptosis por p53
2. Activación de proteínas pro-apoptoticas, como Bim, Bid, bax, Puma, p21, GADD45 y mdm2.
3. Formación del canal MAC (oligómero) en la membrana mitocondrial externa.
4. Liberación de proteínas activadoras de caspasas, como Citocromo C, AIF, SAC, Diablo.
5. Activación de caspasas
6. Degradación selectiva de proteínas celulares especificas.
Regulación metabólica – Interacción citosol- mitocondria
Los mecanismos a través de los cuales se acopla la demanda de ATP con el suministro son esenciales para el
funcionamiento de la célula. La glucosa, un metabolito energético puede almacenarse o degradarse para obtener
ATP.
En condiciones de ejercicio, se puede observar que mientras varios factores cambian, los niveles de ATP no varían
significativamente, lo que significa que existe un acoplamiento entre su gasto y el suministro de este, como parte
de mantener la homeostasis dentro de la célula.

Moléculas que permiten este acoplamiento:

CALCIO
Grafico de transientes de Calcio, en citoplasma y mitocondria.
Existe una relación entre los niveles de calcio en la célula y la
actividad metabólica de la mitocondria. Cuando aumenta los niveles
en el citoplasma, también en mitocondria, junto con el aumento de
su actividad reflejada por los niveles de NADPH y ATP. Esta actividad
es efimera en respuesta a un estimulo como Felinefrina o
contracción del musculo cardiaco.

Estimulación de la actividad mitocondrial por calcio

Calcio es un mensajero metabólico involucrado en la
relación entre los estímulos y el metabolismo que
conducen a la respuesta celular. Ca Tiene la capacidad de
estimular el metabolismo dentro de la mitocondria
regulando varias enzimas a nivel del TCA como a-
cetoglutaratoDeshidrogenasa (a-KGDH),
IsoCitratoDeshidrogenasa (ICDH) y
piruvatoDeshidrogenasa (PDH), claves en la formación de
Citrato y NADH, lo que a su vez aumenta el flujo de la
cadena transportadora de electrones, aumenta el
potencial de membrana y aumenta la síntesis de ATP si se
dispone de ADP.
Por otro lado, Calcio también estimula lanzadera que extraen ATP de la mitocondria hacia el citosol. Fuera de la
mitocondria, calcio regula la síntesis o degradación de glucógeno en adipocitos.

Calcio tiene influencia en la regulación del metabolismo celular, como en mitocondria y en la

síntesis/degradación de glucógeno en adipocitos.

Explicación de las transientes de calcio

Calcio aumenta en la célula de manera transitoria, ya sea por su entrada desde el exterior o por su liberación
desde el retículo sarcoplásmico. Este aumento explosivo desencadena una serie de reacciones que disminuyen los
niveles de calcio.
En primer lugar, las proteínas buffer de calcio reducen los niveles de calcio.
En segundo lugar, la mitocondria reduce los niveles de calcio citoplásmico al entrar calcio dentro de ella.
En tercer lugar, los intercambiadores Sodio/calcio extraen calcio hacia el exterior de la mitocondria, como del
citoplasma.
Por último, las bombas de calcio SERCA/PMCA, que requieren ATP en la membrana.
 En un principio, la entrada de calcio estimula la liberación de calcio desde el
RE. Los sistemas de bomba sodio/calcio de entrada a la mitocondria, aunque
tengan baja afinidad por calcio, son muy eficientes debido a su capacidad
para procesar grandes cantidades sin saturarse.
Por otro lado, las bombas PMCA o SERCA detectan bajos niveles de calcio y
trabajan bien debido a su alta afinidad por el calcio, pero se saturan a niveles
altos de calcio.

Si los niveles de calcio se mantienen elevados pueden generar problemas

energéticos debido al aumento excesivo de la actividad mitocondrial,
llevando a apoptosis, por el aumento de ROS, aumento de la permeabilidad y
liberación de factores pro-apoptoticos.

Además, la entrada de calcio también puede causar hinchazón en la mitocondria, lo que puede activar las BH3-
only por calcio y conducir a la formación de poros transitorios y la liberación de citocromo C, lo que también
resulta en apoptosis.

Acoplamiento Entre RE y mitocondria en el manejo de calcio

Cuando los receptores de rianodina y el receptor de InositorTriFosfato (RyR/InsP3R) son estimulados, se libera
calcio desde el RE. Este es captado por la mitocondria por sus canales VDAC y un uniporter. Rápidamente es
removido por bombas Sodio/calcio para que se recapte por el RE. La estimulación inicial de los receptores puede
ser calcio u otro.

En la contracción muscular, calcio tiene participación, además, también aumenta el

metabolismo permitiendo que la demanda y el suministro de energía se acoplen y faciliten la
respuesta celular
Estimulación del metabolismo a las vías de señalización a través calcio como mensajero metabólico

En cardiomiocito, la adición de cafeína y piruvato aumenta la

respuesta (liberación) de calcio, especialmente al añadir cafeína,
lo que sugiere que existe comunicación entre el metabolismo y
las vías de señalización.

La ADP ribosil ciclasa, es una enzima que sintetiza cADPR y

NAADP a partir de NAD o NADP.

cADPR estimula las bombas SERCA del RE en la captación de

calcio aumentando sus niveles en RE. Este aumento en RE
estimula la liberación de calcio a través de los receptores de
rianodina, resultando en una mayor liberación de calcio en
respuesta a futuros estímulos. Es decir, el metabolismo influye en la señalización de calcio a través de la síntesis de
moléculas como cADPR que sensibiliza a RE.

ADP ribosil ciclasa tiene actividad sintética y de hidrolisis y esta última es inhibida por niveles adecuados de ATP o
NADH. Al tener niveles adecuados de cADPR, la célula se encuentra en un estado metabólico optimo para recibir
señales de calcio, lo que indica que tiene suficiente energía.

En resumen, la señalización de calcio y la síntesis de cADPR están influenciadas por el estado

metabólico de la célula y, a su vez, afectan al metabolismo celular, lo que demuestra la
estrecha relación entre la señalización celular y el metabolismo.

ATP/AMP y NADH/NAD
ATP en la liberación de la Insulina
Ejemplo, liberación de insulina desde células beta: la entrada de glucosa a la célula estimula la
producción de ATP. Los niveles elevados de ATP (localmente) inhiben los canales de potasio. Esto
provoca la despolarización de la membrana, la apertura de los canales de calcio, y la liberación de
insulina. Si la razón ATP/ADP es baja no se libera insulina.

La entrada de glucosa y síntesis de ATP son importantes para la liberación de insulina

AMP como mensajero metabólico

AMP es un derivado de la actividad metabólica y puede

influir en la activación de AMPK.

1) Su activación promueve exocitosis de vesículas

con transportadores GLUT-4 facilitando la
captación de glucosa.
2) Su activación también estimula la enzima
bifuncional PFK-2 (síntesis y degradación de
Fru-2,6-BiFosfato o F-2,6-BP).

Esta molécula F-2,6-BP estimula PFK-1 e inhibe la

actividad fosfatasa de PFK-2.
Es decir, se estimula la glicolisis.
 Los niveles altos de AMP activa la via AMPK, aumentando la entrada de Glu y el flujo glicolitico
produciendo energía rápidamente

Bicarbonato (HCO3-)
La degradación de glucosa produce piruvato. Este entra a la mitocondria y se degrada hasta CO2 que se
convierte en Bicarbonato (HCO3-) por la Anhidrasa carbonica.Bicarbonato, a su vez, estimula a la
adenilato ciclasa (AC) soluble mitocondrial produciendo AMPc. AMPc activa a Proteína kinasa A
mitocondrial (mtPKA) que actúa sobre la cadena transportadora de electrones, permitiendo mayor síntesis
de ATP y por lo tanto mayor consumo de oxigeno (no se sabe bien como).

Ejemplificando, cuando se degrada mucha glucosa, se informa a la célula que se requiere más ATP

HCO3- actúa como mensajero metabólico que estimula la vía de señalización de Adenilato
ciclasa AMPc/mtPKA para aumentar la síntesis de ATP en la celula

Finalmente, podemos concluir que, cuando se habla de Estimulo - Via de señalización - Respuesta celular, esto va
acoplado con lo que ocurre en el metabolismo. Estos conceptos están conectados a través de mensajeros
metabólico como Calcio, ATP/AMP, NADH/NAD y HCO3-, que indican a la célula el estado metabólico en que se
encuentra.
Especies reactivas de Oxigeno (ROS)
La teoría de los radicales libres sugiere que hay una relación lineal entre la exposición a ROS y el envejecimiento o
la muerte.
Otra perspectiva considera una respuesta Hormetica, es decir, a bajas concentraciones, el efecto es contrario y
solo cuando se alcanza una concentración limite se produce un efecto diferente. Así como sugieren experimentos
donde se demuestra que la exposición a bajos niveles de ROS tiene un efecto contrario esperado.
--Se propone la mitohormesis, donde la respuesta de la mitocondria a la generación e ROS es positiva solo cuando
los niveles son bajos, pero cuando son muy altos, se repite la propuesta de la teoría de los radicales libres.
Definición hormetica: tipo de respuesta biológica donde un agente estresante/toxico provoca una respuesta
adaptativa beneficiosa en el organismo niveles bajos/moderados de exposición.
Formación de ROS

La formación de ROS es la reducción parcial de O2, un buen oxidante. Durante este

proceso, se genera primero el radica Superoxido, un potente oxidante con un
electron desapareado. Luego, en la siguiente reducción se produce Peroxido de
hidrogeno, especie oxidante sin electrones desapareados. El peróxido de hidrogeno
tiene una vida muy corta en sistemas biológicos.
La siguiente reducción de O2 produce el radical hidroxilo, altamente reactivo con
diversas moléculas. Por otro lado, la reducción de Oxigeno forma agua.

El oxigeno se convierte en especies reactivas con capacidad de

dañar moléculas biológicas por su capacidad de aceptar
electrones y cambiar su estado de reducción

El anion superóxido (O2*) puede formarse enzimáticamente o no-

enzimatica. Se genera en reacción con metales de transición, tioles,
quinonas o flavinas, así como por enzimas oxidasas (NADPH ocidasa y
oxigenasas. (Citocromo P450). También en la cadena transportadora de
electrones

El peróxido de hidrogeno se forma como dismutación del anión superóxido

espontáneamente, o bien, por dismutación catalizada por superóxido
dismutasa (SOD).

El radical hidroxilo se forma por la reacción de haber-weiss, donde anion

superóxido reacciona con peróxido de hidrogeno;

y la reacción de Fenton, donde proteínas cambian su estado de oxidación

por metales como Hierro o cobre, y así reaccionar con peróxido de
hidrogeno generando Radical Hidroxilo.
 La formación de ROS puede ser de forma enzimática como no enzimática, en presencia de
metales u otras sustancias. Estas ROS tienen efectos nocivos relacionándose con patologías,
como envejecimiento u otros.

Reactividad (lo mismo que dice antes)

El Anion superóxido (O2*) no es muy reactivo por su corta vida media y genera peróxido de hidrogeno o agua.
El peróxido de hidrogeno (H2O2), es muy oxidante y tiene estabilidad, tiene corto tiempo de vida media, pero
puede difundir y generar modificaciones relacionadas con mecanismos de señalización.
El radical hidroxilo, es muy reactivo con cualquier grupo orgánico con un átomo de hidrogeno. Al reaccionar forma
un radical orgánico y agua.
Su formación del radical hidroxilo depende de los niveles de otras moléculas como anion superóxido y peróxido de
hidrogeno. Cuando estas moléculas tienen niveles altos ocurren reacciones de Haber-weiss o la de Fenton
generando radical Hidroxido.

Efectos
Permeabilidad de membrana: HO* puede generar reacción en cadena que produzca radicales en lípidos (ataque a
doble enlace de ácidos grasos), alterando la fluidez y permeabilidad de las membranas, alterando la función de
organelos como la mitocondria, RE, lisosoma, etc, permitiendo el paso de moléculas.
Daño al ADN: ROS, como H2O2 puede provocar cortes en las hebras mediante la reacción de Fenton por el cobre
unido al ADN, generando HO* que a su vez abstrae un proton de los nucleótidos. Esto tiene consecuencias graves
en la replicación y función celular, especialmente en mitocondria donde se produce ROS.
NOTA: participación de PARP en reparación
Mutación de ADN: es posible que el Radical hidroxilo puede modificar nucleótidos generando mutaciones que
alteran la secuencia de bases. Ejemplo, en deoxi-Guanosina produciendo 8-Hidroxi-deoxiGuanosina. Esto cambia
guanosina por adenina o timina.
Modificaciones en proteínas: ROS genera modificaciones permanentes en aa’s, alterando su actividad y función.
Ejemplos: HidroxiTriptofano, NitroTriptofano, Acido Sulfenico cisteína y NitroTirosina.

Mecanismo de control de ROS

Mecanismos enzimaticos
Puede ser controlado por enzimas como superóxido dismutasa (SOD), catalasa y peroxidasa, o mediante
antioxidantes como Ascorbato, Glutation, Coenzia Q y Vitamina E, reduciendo el raño causado por estrés oxidativo
Superoxido dismutasa (SOD) convierte el anion superóxido (O2*) en peróxido de hidrogeno (H2O2). Hay
diferentes formas de SOD: Cu-Zn-SOD y Mn-SOD en diferentes partes de la célula.
Catalasa y GSH peroxidasa (GPX) eliminan el Peroxido de hidrogeno (H2O2) posiblemente generado por SOD.
Catalasa esta en peroxisoma, mientras que GPX en citosol y matriz mitocondrial.
GSH peroxidasa disminuye los niveles de H2O2, a agua y O2 utilizando glutatión reducido (GSH) formando
glutatión oxidado (GSSG), el cual puede reducirse otra vez por una Glutation reductasa con NADPH por lo que sus
niveles son importantes en la capacidad antioxidante. La razón GSH:GSSG es indicador de la capacidad redox de la
célula.

La eficacia de estos mecanismos depende de la cantidad y ubicación de las enzimas. Así el

hígado tiene mayor capacidad para disminuir los niveles de ROS por SOD, Catalasa y GPX que el
cerebro y pulmón; indicio de dónde hay mayor generación de ROS.
Mecanismos no-enzimáticos
Vitamina E: familia de los tocoferoles (o
tocotrioles) es liposoluble y se encuentra en
membranas donde previne el daño a los ácidos
grasos por ROS. Vitamine E reacciona con los
radiales libres se convierte en un radical también,
esta es apagada por otros antioxidantes como
GSH-peroxidasa (GPX) o Vitamina C.

Vitamina C: es soluble en agua. Pasa de Acido Ascórbico a Acido DehidroAscorbio (AH-) para poder reaccionar con
radical hidroxilo OH* y convertirlo en agua y producir A*. Esta requiere otros antioxidantes como
Dehidroascorbato reductasa y glutatión (GSH) produciendo GSSG para recuperar su capacidad antioxidante.
Los seres humanos obtienen Vitamina C de la dieta.

Generación de ROS intracelular

Hay una importante producción de ROS en el metabolismo de nucleótidos, generación de peroxido de hidrogeno
por la enzima NADPH oxidasa ubicada en membrana plasmatica, principalmente en macrófagos. Por otra parte la
cadena transportadora de electrones en una fuente importante de ROS
A nivel de Membrana, NADPH – ROS
NADPH y ROS poseen un rol de señalización a nivel de membrana.
NADPH oxidasa es activada por citoquinas, factores de crecimiento
y hormonas a través de receptores acoplados a PI3K, esto genera la
producción de Fosfatidil inositol-3-fosfato (PIP3), mensajero que
activa NADPH oxidasa produciendo anion superóxido (O2*) que, a
su vez se convierte en H2O2 por SOD.
ROS, en especial H2O2 y O2* pueden actuar también como
mensajeros, modificando ciertas proteínas a través de la oxidación
de residuos de cisteina formando puentes disulfuro. Esto puede
llevar a cambios en la respuesta celular, como cambios en la
activación de Tirosina fosfatasa, modulación en la activación de
canales, transcripción de algunos genes y señal de apoptosis.
Por otro lado, H2O2 inhibe la actividad de PTEN, que transforma PIP3 en PIP2, sugiriendo que existe una
retroalimentación positiva.

La producción de ROS puede ser una señalización en la célula, principalmente H2O2.

Generación de ROS en mitocondria

El aumento de la tasa de producción de ROS es por el Leak (perdida de electrones)
desde la cadena transportadora de electrones. La primera reducción de O2 ocurre en
el complejo 1 y 3, donde se produce la mayor formación de ROS, en especial Anion
superóxido (O2*).

En la matriz, la enzima Mn-SOD convierte anion superóxido (O2*) en H2O2. En el

espacio intermembrana la enzima Cu-SOD también hace lo mismo.
El leak (goteo) de electrones esta dado por la actividad redox de las moléculas en los complejos proteicos,
incluyendo iones metálicos en los complejos 1 y 4, así como flavina, quinona y ubiquinona. Los complejos 1 y 2
reciben equivalentes reductores del TCA (NADH y FADH2). Los electrones pasan de un complejo a otro y es posible
que alguno reaccione con O2 produciendo O2* que se transforma a H2O2 por SOD y a H2O por GPX.

Un alto nivel de O2 disuelto cerca de varias reacciones redox aumenta la probabilidad de generar ROS, esto es en
el complejo 1, 2 y 4.

La producción elevada de ROS es perjudicial para la función mitocondrial y salud celular. Por
ello existen sistemas de defensa antioxidantes como enzima SOD y GPX para neutralizarlo.

Situaciones que aumentan la tasa de producción de ROS

Aumento de NADH:NAD
El aumento de la b-oxidacion de AG aumenta Acetil-CoA, en el TCA genera mayor NADH aumentando NADH:NAD.
A nivel de complejo 1 hay mayor transferencia de electrones. Esto puede aumentar el leak de electrones
aumentando ROS. Por esto el hígado genera mayor ROS y posee mayor defensa contra esto.
Aumento de los niveles de O2: aumenta la probabilidad de reaccionar con los electrones de la cadena, generando
ROS.
Disminución de los niveles de O2: sin un aceptor de electrones en el complejo 4 el potencial de membrana
aumenta y disminuye el flujo de electrones, esto reduce la cadena y genera mayor Leak, produciendo mayor ROS.
Aumento del potencial de membrana: el potencial de membrana mitocondrial esta entre 100mv a 220mv.
Habiendo potencial y ADP, se sintetiza ATP (que se satura a los 100mv). Cuando falta ADP el potencial de
membrana sigue aumentando por los protones bombeados y luego dejan de entrar por la misma razón. Es decir, la
falta de ADP y el aumento del potencial de membrana disminuye el flujo de electrones a través de la cadena por la
saturación del sistema, aumentando el Leak y produciendo ROS.
La disminución del potencial puede estar dada por un desacoplante, así como por los poros de permeabilidad.
Cuando los niveles de ubiquinona (quinona reducida) es mayor a los de quinona, es decir, la cadena esta reducida,
ocurre la transferencia de electrones reversa, generando la síntesis de NADH. En esta condición la producción de
ROS es mayor. El aumento del potencial de acción y la presencia de inhibidor de quinona genera la producción de
Ubiquinona.
Tanto NADH y FADH2 transfieren electrones a quinona. Succinato produce FADH2.

El estrés oxidativo ocurre cuando hay

desequilibrio entre la producción de ROS y
capacidad de neutralizarlo. Este estrés
produce cancer, enfermedades
neurodegenerativas, cardiovasculares, etc.
 El peor escenario es que no haya Leak de protones, baja síntesis de ATP y bajos niveles de O2.

Proteínas desacoplantes y disminución del Potencial de membrana

El leak de protones disminuye el potencial de membrana y también ROS.
En tejido adiposo hay proteínas desacoplantes en la membrana interna mitocondrial que disipa el potencial de
membrana, este genera calor en el proceso.
En células b-pancreaticas, las proteínas desacoplantes permiten la liberación de insulina. En altos niveles de
glucosa, UCP2 cuando está activa evita la síntesis de ATP, por lo que disminuye el potencial de membrana y
disminuye ROS.
Por otro lado la generación de ROS estimula el Leak de protones.

Tejido adiposo marron (hibernación):

En estos el proceso de desacoplamiento de protones en la mitocondria por
proteínas desacoplantes genera calor.
Los ácidos grasos en la membrana interna pueden ser mediadores en la
transferencia de protones, ya sea embebidos en la membrana o siendo
transportadores, o bien funcionando como un canal. Existe regulación
producida por nucleótidos como GDP.
El tejido adiposo no genera tanto ROS por estas proteínas, a diferencia del
tejido blanco.

Células b-pancreaticas

Las proteínas desacoplanes, son importantes en la liberación de insulina. La liberación de insulina esta regulada
por el aumento de los niveles de ATP que inhiben los canales de potasio y provoca la despolarización de la célula, a
su vez abre los canales de Calcio regulados por voltaje y libera insulina desde las vesículas.
Sin embargo, cuando hay aumento de glucosa, aumenta ATP y disminuye ADP causando estes oxidativo. La
proteína desacopante UCP2 evita esto disminuyendo el potencial y la síntesis de ATP.

Es decir, la regulación de la síntesis de ATP por la UCP2 previene el estrés oxidativo y regula la
liberación de insulina en un exceso de glucosa en células b-pancreaticas

ROS estimula el Leak de protones

 Esto podría deberse por alguna modificación en alguno de los lípidos de la
membrana interna de la mitocondria.

Grafico que muestra niveles de ROS, capacidad antioxidante y producción

de ros por la cadena respiratoria

Ej, ambiente reducor - derecha: En azul, la tasa de ROS aumenta, por

ejemplo, por la cadena respiratoria, esta llega a sobrepasar la capacidad
antioxidante (en verde) de los mecanismos enzimáticos y no-enzimaticos.

Ej Ambiente oxidante -izquierda-: hay una tasa de ros basal dado a la casi
nula actividad antioxidante.

Entonces, hay dos situaciones donde hay aumento de ROS, 1) porque aumenta su producción y la capacidad
antioxidante esta saturada. 2) Tasa basal de ROS y baja actividad antioxidante.

En conclusión:
Siempre va haber ROS, y este
puede aumentar por su
estimulación o bien por la
baja actividad de
mecanimos antioxidantes.