Técnicas

En un trabajo científico se utilizan modelos experimentales y se obtienen resultados particulares que pueden
generalizarse. El equipo de salud resuelve un caso clínico individual utilizando conocimientos generales obtenidos
mediante dichos trabajos científicos.
Los modelos experimentales son organismos, unicelulares o multicelulares, que se utilizan para estudiar funciones
de determinados procesos y/o moléculas, cuyos resultados sirven de base para ver si dichos procesos se producirán
en organismos más complejos (como el nuestro).
Los estudios científicos pueden realizarse en 3 entornos básicos:
✓ In vivo: animal completo sometido a experimento. Resultados más transferibles en relación con la fisiología
real, pero tienen mayores variables que influyen.
✓ In vitro: separando a las células del resto del organismo, por ejemplo, en cultivos celulares. Permiten aislar
las variables, pero se aleja de la condición fisiológica.
✓ Libres de Células: componentes celulares aislados, Pej. una organela. Permiten aislar aún más las variables,

OM
pero también se aleja aún más de lo que sucede en situaciones fisiológicas.
Estudios médicos: el equipo de salud puede solicitar estudios cuyos resultados informen sobre localización y/ o
cuantificación de proteínas y/o ácidos nucleicos. Estos estudios pueden tener fines diagnósticos o predictivos sobre
la evolución del paciente y también sirven para orientar el tratamiento a seguir.
TÉCNICAS QUE ESTUDIAN A LAS PROTEÍNAS
Tanto de los modelos experimentales como de los pacientes se obtienen muestras:
a. Conservando su estructura: son estudiadas mediante técnicas histológicas o
inmunohistoquímica/inmunofluorescencia. Por ejemplo, en biopsias, elementos formes de sangre o células en

.C
cultivo
b. Sin conservar la estructura: son estudiados mediante fraccionamiento subcelular, estudios bioquímicos o
por WesternBlot. Por ejemplo, el Plasma, tejido homogeneizado
DD
Tanto la técnica inmunohistoquímica como el Inmunoblot/WesternBlot se basan en la reacción antígeno-anticuerpo.
✓ Antígeno: es toda molécula o microorganismo que produce una respuesta inmune al ser introducido en un
cuerpo.
✓ Anticuerpos: poseen dos cadenas pesadas y dos livianas. Tiene una parte constante y una variable, la
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segunda se modifica dependiendo de cuál sea el antígeno que se une; la primera tiene que ver con la
especie que produce ese anticuerpo.
LA

¿Cómo se obtienen los anticuerpos para ser utilizados en inmunohistoquímica o WesternBlot?

Por ejemplo, se desea estudiar la ubicación de la
Laminina en un tejido:
1. Se inyecta laminina humana en un conejo
2. Esta es reconocida como extraña por los
linfocitos B, porque la laminina funciona como
FI

un antígeno.
3. Hay distintas partes de la laminina que van a
activar distintos clones de linfocitos B y estos
van a dar plasmocitos que van a secretar
anticuerpos.
4. Luego, puedo obtener plasma del conejo y


purificar los Anticuerpos Policlonales.

Los anticuerpos policlonales son anticuerpos derivados de diferentes líneas de linfocitos B, que en conjunto
reconocen distintos Epitopes de un antígeno. Los Epítopes son determinantes antigénicos que activan las distintas
poblaciones de linfocitos.
¿Cómo puedo producir Anticuerpos Monoclonales?
1. Se inyecta el antígeno en un ratón
2. Aíslo los clones de linfocitos y los cultivo en distintas
Placas de Petri = en cada placa tengo un clon que tiene
como receptor un anticuerpo específico para un
determinante antigénico.
3. Luego fusiono cada clon en cultivo con células tumorales
para obtener un hibridoma inmortal que produce muchos
anticuerpos monoclonales.
Los anticuerpos monoclonales se pueden producir a partir de una
sola línea de linfocitos B y sólo reconocen un Epítope del antígeno.
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 INMUNOHISTOQUÍMICA
¿Cómo utilizo estos anticuerpos en la inmunohistoquímica/inmunofluorescencia?
La inmunohistoquímica es la localización de un componente químico y proteínas específicos en el tejido o en las
células, basada en la reacción antígeno-anticuerpo. También puede servir para cuantificar a las células que
expresan dicho componente. Es una técnica histológica que tiene especificidad química.
1. Tomo una muestra de tejido y la fijo
2. Agrego el anticuerpo policlonal o monoclonal para que reconozca y se una al antígeno que quiero detectar
3. Agrego una sustancia que tenga color, un fluorocromo (en este caso se llama Inmunofluorescencia) o una
sustancia electróndensa para poder observar la muestra en un microscopio óptico, electrónico o de
fluorescencia.
En la inmunohistoquímica directa el anticuerpo se une al antígeno y yo al verlo se
dónde está dicho antígeno.
En la inmunohistoquímica indirecta (la más habitual) se introduce el anticuerpo, pero
sin marcarlo y a su vez se introducen otros anticuerpos marcados (producidos en
otros animales) que reaccionan y se unen al anticuerpo sin marcar= puedo ver la

OM
ubicación del antígeno a través del fluorocromo que tiene el anticuerpo secundario.
La ventaja que tiene usar la indirecta es que al unirse más de un anticuerpo al
primero, la señal es más amplia y que con un solo anticuerpo secundario puedo ver
muchos anticuerpos primarios.
FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR
Es el procedimiento por el cual se pueden separar los distintos componentes de las células de un tejido. Tienen como
objetivo obtener fracciones puras o enriquecidas de un determinado componente celular para poder así estudiarlos

.C
de manera aislada.
1. Ruptura mecánica= Homogenato
2. Someto al homogenato a una centrifugación diferencial y
obtengo un Pellet de algunos componentes (núcleos), en tanto
DD
el resto queda en el Sobrenadante
3. Tomo el sobrenadante y lo someto a otra centrifugación (a
mayor velocidad y más tiempo) = Pellet de componentes que
antes no habían precipitado ahora si lo hacen (mitocondrias,

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lisosomas, peroxisomas) y el resto en el sobrenadante.
4. Tomo el sobrenadante y hago una última centrifugación (aún más veloz y más tiempo): obtengo el Pellet
(microsomas) y en el sobrenadante queda el citosol y ribosomas.
LA

Puedo utilizar alguno de estos fraccionamientos o el homogenato para realizar la técnica de WesternBlot.
¿Cómo sé que tengo la fracción que pretendía?
Utilizando enzimas específicas de cada organela y generando una reacción bioquímica enzimática u observar la
morfología de la fracción, a través de microscopía electrónica.
FI

WESTERNBLOT= INMUNOBLOT
Permite determinar los niveles de expresión de una proteína específica en una fracción subcelular u homogenato.
Al igual que en la inmunohistoquímica, se busca detectar proteínas específicas a través de la reacción antígeno-
anticuerpo, y determinar los niveles cuantitativos de expresión de este. En esta técnica se trabaja sobre una
muestra que no conservó su estructura (plasma, fracción u homogenato).
No voy a tener información de la distribución dentro del tejido ya que lo destruí.


¿Cuál es el fundamento de WesternBlot?

1. Las proteínas que obtengo -de las fracciones u homogenato- las colocó con un detergente de carga
negativa, de modo que las proteínas adquieran dicha carga, en el extremo superior de una membrana/gel.
2. A este gel lo pongo en un medio acuoso y lo someto a una corriente eléctrica.
3. Las proteínas van a migrar a lo largo del gel a la parte inferior, que tiene carga positiva.
4. Las voy a divisar como bandas y, dado que no todas migran a la misma velocidad, algunas estarán más
arriba y otras más abajo.
El gel es como un filtro que tiene orificios; mientras más grande sea la proteína va a atravesarlo más lento
y viceversa= quedando las proteínas más grandes más arriba y las más pequeñas más abajo.
5. Blotting o transferencia: se pasan las proteínas del gel, por corriente eléctrica, a otro material que permita
que se realice la reacción antígeno-anticuerpo (pej. una membrana de nitrocelulosa).
6. Sobre la membrana de nitrocelulosa agrego los anticuerpos primarios, quienes se van a unir a la banda
donde está la proteína. Luego agrego los anticuerpos secundarios marcados para así visualizar:
✓ En qué banda se expresó, dependiendo de la banda marcada
✓ Qué cantidad de proteína (antígeno) se expresó, dependiendo del grosor de la banda
✓ Qué peso molecular tiene, por la ubicación de la banda con respecto a los marcadores de peso
molecular
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 Solo puedo saber en qué lugar de la célula se expresa una proteína (localización subcelular) utilizando esta técnica
sí antes utilice como material de partida un fraccionamiento subcelular.
La Inmunohistoquímica es más útil para tener información respecto a la distribución, en tanto que
TÉCNICAS DE AMPLIFICACIÓN
WesternBlot O CLONACIÓN
lo es para obtener informaciónDEsobre
ÁCIDOS NUCLEICOSy cantidad
la presencia IN VITRO de una proteína en una
determinada muestra.

TÉCNICAS DE AMPLIFICACIÓN O CLONACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS IN VITRO

PCR DE PUNTO FINAL
Permite la amplificación de un fragmento de ADN en una reacción in vitro. Con la aplicación de esta técnica pueden
generarse millones de copias del fragmento de ADN amplificado, a partir de un número muy bajo de copias iniciales.
Permite generar un diagnóstico temprano de algunas enfermedades. Es un aumento del sector/segmento específico
del ADN que quiero obtener. La PCR es específica.
¿Qué necesito?

OM
ADN primer específico (de la secuencia de nucleótidos que queremos reproducir), ADN-TAQ polimerasa (con
característica termoestable) el magnesio cataliza la estabilidad de la reacción y cofactor de la TAC termocicladores
(máquinas), ADN molde (ARN no porque se desnaturaliza por la temperatura), Buffer porque otorga condiciones
salinas para el funcionamiento de la enzima y Dinucleótidos
¿Cómo funciona?
Coloco la molécula de ADN en la Termocicladora (bloque que puede calentarse y enfriarse rápidamente) a
temperatura normal. Selecciono un primer de ADN específico para la secuencia de nucleótidos donde quiero que la

.C
ADN-TAQ polimerasa comience a sintetizar la cadena complementaria. Etapas:
1. Desnaturalización: elevo la temperatura a 95°, se desnaturaliza la molécula de ADN separando sus puentes
de hidrógeno por helicasas
2. Hibridación: bajó a 55 o 65, los cebadores se unen al molde, la ADN-TAQ extiende los cebadores.
3. Elongación o extensión: elevo la temperatura a 72°, trabaja la ADN-TAQ polimerasa y sintetiza la cadena
DD
complementaria; No habrá fragmentos de Okasaki ni cadena retrasada.
4. Unión: llevo la temperatura a 65° para que se unan los puentes de hidrógeno de las hebras
semiconservativas.
Repito el ciclo la cantidad de veces que considere necesario para obtener una muestra amplificada de la parte del
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genoma que codifica la proteína dañina.
Uno de los errores que se pueden dar es que, como la TAQ polimerasa no tiene capacidad de corrección (exonucleasa)
que realiza la Doble Lectura, puede haber un nucleótido mal; también puede haber contaminación in vitro que
LA

modifique los resultados.

Electroforesis de ADN: habitualmente los resultados de una reacción de PCR se visualizan (se hacen visibles) al usar
electroforesis en gel de agarosa.
La electroforesis en gel es una técnica utilizada para separar fragmentos de ADN según su tamaño
1. Las muestras de ADN se cargan en pozos (ranuras) en un extremo de un gel y se aplica una corriente
FI

eléctrica para arrastrarlas a través del gel.

2. Los fragmentos tienen carga negativa, por lo que se mueven hacia el electrodo positivo. Puesto que todos
los fragmentos de ADN tienen la misma cantidad de carga por masa, los fragmentos pequeños atraviesan
el gel más rápido que los grandes.
3. Cuando un gel se tiñe con un pigmento que se une al ADN, los fragmentos de ADN pueden verse como


bandas, las cuales representan un grupo de fragmentos de ADN del mismo tamaño. Para visualizar, se expone
a luz UV que me permite ver las bandas y se compara con los marcadores.
Típicamente se incluye un estándar o marcador de peso molecular, para que pueda determinarse el tamaño de los
fragmentos en la muestra de PCR.
Si hay replicación de ADN quiere decir que en la sangre teníamos la secuencia de nucleótidos que codificaba para
la bacteria y esta se expresará con sus pares de bases, generando un peso más elevado de la muestra de ADN
original. A su vez, la enfermedad puede expresarse en cromosomas homólogos; se puede ver entonces si la proteína
está en la secuencia de uno, de dos o de ningún cromosoma.
Pruebas anteriores:
• Control negativo: no se debería ver banda, siempre se usa una sustancia que es seguro que no va a dar
positivo. Pej. reacción de PCR en ausencia de ADN molde= no habrá amplificación del gen mutado.
• Control positivo: uso una muestra de la bacteria donde si o si habrá replicación del ADN molde.
Paciente a y c positivos: vemos banda a la misma altura del positivo
Paciente b negativo: no debemos ver banda porque no hay amplificación. Si no hay mucha cantidad no se ve.
PCR multiplex: en un mismo tubo se coloca un set de primers para detectar varios genes.
Detección de mutaciones: una persona que presenta una banda más abajo presenta la deleción.
Usos: detección de agente patógeno e identificación de especie del agente patógeno.

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 QPCR-RT (CUANTITATIVA CON RETROTRANSCRIPCIÓN)
Etapa I: Retrotranscripción
La técnica de PCR cuantitativa con retrotranscripción (RT-qPCR) permite cuantificar moléculas de ARN. Usualmente,
la técnica comienza con la extracción de ARN de una muestra y su retrotranscripción (transcripción inversa) a
moléculas de ADN complementario (cADN: contienen secuencias solo de exones ya que derivan de ARNm maduro).
La retrotranscripción se realiza utilizando una enzima (ADN pol) recombinante de origen viral. Permite generar la
síntesis de ADN bicatenario a partir de un molde de ARN monocatenario. Todas las enzimas transcriptasas reversas
tienen un dominio donde se produce la síntesis (capacidad de ADN polimerasa) y otro dominio donde una enzima,
asociada de carácter Nucleasa (ARNasa), degradan la hebra de ARNm que usamos de molde, una vez sintetizada.
Luego va a dejar la hebra complementaria de ADN original para sintetizar a partir de ella. Este tipo de enzimas no
poseen capacidad correctora de exonucleasa. Un ejemplo de enzima con esta función de retrotranscripción IN VIVO
es la telomerasa, dado que esta enzima tiene un molde de ARN que le permite extender los telómeros.
Etapa II: PCR cuantitativa
Lo primero que necesitamos es un primer específico que marque la secuencia de ARNm que se desea amplificar y
cuantificar. Estos primer pueden ser generales, es decir que se van a unir a todas las colas POLI-A de los ARNm que
tengamos en la muestra de tejido (Ej: primer poli-T); o podemos usar Primers específicos con secuencias de

OM
nucleótidos complementarias a los ARNm que queremos pasar a ADN.
Luego necesitamos lo típico de la PCR normal para realizar la técnica (incluyendo su enzima, la TAq-polimerasa).
Te permite ver los resultados de los ciclos en tiempo real, observo en cada momento cómo se van amplificando la
señal y si hay producto. Se puede comparar la cantidad de sustrato inicial; a diferencia de la de punto final que se
observan productos después de que termina. La PCR punto final solo dice si está infectado o no y si hay amplificación
o no.
Se marca con un colorante (fluorocromos o clorofonos) que se agrega al tubo desde el inicio de la reacción y se
introduce en él ARN. El colorante (SYBR), reportero de que la amplificación ocurre, adquiere fluorescencia cuando

.C
se asocia al ADN de doble cadena = es un INTERCALANTE, por eso cuando aumenta la cantidad de ADN veo
fluorescencia. Diferentes colorantes específicos para diferentes genes determinarán cual se manifiesta primero y
tras varios ciclos determinará la proporción con los demás genes.
• Si no hay fluorescencia: el ARN está ausente en la muestra ya que los primers no se unen al ADNc. Al principio
DD
no hay fluorescencia porque la máquina no detecta los niveles tan bajos de fluorescencia, en cambio cuando
se acumula producto se comienza a observar.
• Si aumenta la fluorescencia: es porque aumenta la producción. Cuanto menor cantidad de ARN inicial, más
tarda en llegar al crecimiento exponencial: así comparo productos iniciales.

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• La finalización es casi igual, es decir con la misma cantidad de productos ya que, aunque deje PCRcorriendo
los sustratos son limitantes, hay saturación de sustratos del PCR. Se saturan enzimas, primers o nucleótidos.
• Análisis de resultado: n° de copias de ADNc amplificado= n° de ADNc original= cantidad de ARNm muestra
LA

original
• Se utiliza para estudiar carga viral de retrovirus HIV. Carga viral: n° de copias de ARNm/ ml de plasma
Para determinar carga viral: busco ARN virus que se transcribe a partir de ADN integrado (es ARNm a partir de
ADNc que se forma en la C* huésped del ARN viral original)
¿Qué beneficio tiene usar esta técnica? esta técnica nos permite estudiar en tiempo real, debido a que agregamos
FI

una proteína fluorescente que marca los ADN; a diferencia de la PCR de punto final donde necesitamos de la
electroforesis para sacar conclusiones en base a su gel.
Estos marcadores pueden ser:
a. No específicos: se intercalan en la doble hebra de ADN y, si solo si se adhiere a él, bajo una luz se puede emitir
una fluorescencia propia. El problema es que no solo se puede unir a la doble cadena de ADN, sino que también
se pueden unir a dímeros de primers, y no será bueno para nuestras conclusiones.


b. Específicos: tienen la característica que presentan una secuencia de ADN específica e hibridan de manera
exacta a una secuencia de nucleótidos que deseamos que la TAQ-polimerasa replique. Cuando pasa la enzima
TAQ-polimerasa duplicadora por sobre el primer específico, lo degrada y al degradarse libera el clorófono
(emana color) dándonos la pauta de que la secuencia de nucleótidos que buscábamos (posiblemente
generadora de una proteína “maliciosa” se encuentra o no en nuestra secuencia de ADN.
A diferencia de PCR de punto final no se necesita de la electroforesis y su respectivo gel para obtener los primeros
resultados a evaluar.
A la hora de evaluar: la relación entre “mayor fluorescencia, mayor cantidad de producto (fluorescencia) en menor
cantidad de tiempo”. Al hacerlo hay que tener en cuenta:
• A partir del 10mo ciclo la maquinaria captadora de Fluorescencia va a dar datos porque con un o dos
replicaciones de ADN lo que emanen los clorófono / fluorófonos no será suficiente para captarse.
• A los 30 ciclos (aproximadamente) disminuye la capacidad de la TAQ-POLIMERASA y deja de actuar. Además,
hay una disminución de substratos como primers, magnesio, bases nitrogenadas, clorófono, etc. A diferencia
de PCR no necesita electroforesis.
A diferencia de la PCR, la PCR cuantitativa permite discriminar finamente las cantidades distintas de un transcrito
que uno tiene en las muestras.
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 TÉCNICAS DE RECOMBINACIÓN DEL ADN
Las Enzimas de Restricción son endonucleasas, de origen bacteriano, que cortan el ADN en doble cadena
reconociendo secuencias específicas de 6 a 10 nucleótidos. Pueden cortarlo creando extremos romos o creando
extremos con una cadena simple, segmentos de ADN monocatenarios, que pueden volver a unirse por
complementariedad de bases= bordes pegajosos.
Si se cortan secuencias específicas de dos moléculas de ADN de distinto origen con una
misma endonucleasa (creando bordes pegajosos) y las coloco en un tubo de ensayo=
espontáneamente, por complementariedad de bases, los extremos (las bases de cada
hebra) de estas moléculas se unirán entre sí. Luego se unirán por una ligasa, de manera
covalente, las bases no complementarias de la misma hebra.
Entonces, el empleo de las enzimas de restricción más la ligasa permiten obtener una
molécula de ADN conformada por dos moléculas distintas= Molécula Recombinante o
Molécula Híbrida.
Si yo quiero amplificar una porción de ADN sin utilizar PCR, debo introducirlo/insertarlo
(inserto) en un elemento de ADN con capacidad autorreplicante (vector) que lo

OM
amplifique de forma autónoma, formando una molécula de ADN recombinante o híbrida. Pej:
1. Inserto el gen de la insulina (inserto) en un plásmido (vector), quién tiene secuencias promotoras que
permiten la expresión de un gen dentro de él, = se forma una molécula híbrida.
2. Introduzco, por un proceso llamado transformación, el plásmido en una bacteria
3. Cultivo la bacteria
4. La bacteria prolifera y el plásmido aumenta en número junto al número de la insulina insertada.
5. Purifico el ADN y me quedan muchas copias del vector con su inserto.

.C
DD
Los Vectores de expresión: permiten que se exprese el inserto de interés (Pej. insulina, factor VIII de la
coagulación, Vacunas) y sirven como herramienta terapéutica.
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Hay distintos tipos de vectores: plásmidos, virus, cromosomas artificiales de bacterias y de levaduras. Los
cromosomas artificiales de levadura sirven de vectores para grandes segmentos/insertos de ADN.
LA

Utilidad de los vectores:

• Si queremos saber la localización de una proteína en un tejido o célula, y no tenemos anticuerpos buenos
que lo detecten, una posibilidad para reemplazar la inmunohistoquímica es utilizar las técnicas de
recombinación del ADN
Los insertos son híbridos en los cuales se fusiona el gen codificante de la proteína de interés con el gen
codificante de una proteína que se pueda identificar (tag).
FI

• Si queremos saber la función de la proteína: puedo introducir un inserto que tenga una mutación y
compararlo con uno normal. Al mutar el inserto y comparar puedo observar la función que falla (= se
anula) y por ende saber cuál es la función que cumple la proteína el normal.
Las técnicas de recombinación también permiten
modificar el genoma de una célula de forma directa.


Entonces, si yo tengo un gen normal lo puedo:

A) Reemplazarlo por otro gen (replacement)
B) Cambiarlo por una porción inactiva (knockout)
C) Incluir un gen adicional.
A través de la modificación del genoma con la técnica
de recombinación, al obtener Células madre tempranas
pluripotenciales o totipotentes de un blastocisto, puedo crear animales transgénicos que tengan esa modificación
y la transmitan a la descendencia. Los animales transgénicos no necesariamente presentan cambios patológicos.
METODOLOGÍAS PARA ESTUDIAR LA FUNCIÓN DE LOS GENES
Hay dos tipos de manipulaciones génicas que permiten inducir la función del gen
a. Estrategia de aumento de la expresión: ver qué pasa con la sobreexpresión de un gen. SI hay alguna
alteración en la C* o el animal. Es una manipulación de ganancia de función.
b. Estrategia de disminución o eliminación de la expresión: elimino o disminuyo la expresión y veo que
alteración produce. Es una manipulación de pérdida de función.

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 Puedo regular el nivel de expresión modificando los promotores:
a. Introduzco un vector con un productor ubicuo que se exprese mucho, entonces la Célula donde introduje
este vector va a expresar gran cantidad de inserto.
b. Introduzco un gen que codifique para un ARN de interferencia e inhibir la expresión.
Los ARN de interferencia utilizan la maquinaria proteica y un mecanismo análogo a los microARNs para
silenciar ARNm endógenos.
→ Cuando modifico el genoma y produzco una pérdida de función= knockout
→ Cuando modifico y produzco una disminución de función= knockdown
Dentro de las moléculas híbridas se pueden introducir genes exógenos que permitan identificar a la C*: el gen que
codifica para una proteína (cuya localización celular quiere estudiarse) se fusiona con el gen que codifica para
una proteína fluorescente; y posteriormente, la localización de la proteína fluorescente muestra la ubicación de la
proteína. Por ejemplo, introduzco a una Célula un vector con una proteína fluorescente verde (GFP), la cual es de
medusa, y así puedo reconocer su ubicación en dicha Célula y tejidos.
A su vez también me permite ver si mutaciones en determinados componentes del genoma alteran la distribución
o ver la localización en el entorno de la modificación del gen para ver si produce una mutación funcional y
localizar las Células que están expresando el gen modificado.

OM
CRISPR/CAS
Es una metodología de alteración del genoma que se utiliza experimentalmente y que simplifica la producción de
animales con modificaciones genéticas ¿En qué consiste?
Hay un conjunto de enzimas, entre ellas Cas 9, que tienen la capacidad de cortar el ADN en doble cadena en
aquellas zonas que son guiadas por ARN. Esos ARN pertenecen al sistema CRISPR
El sistema crispar es un conjunto de genes que se transcriben dando origen a ARN pequeños en bacterias, que se
unen a su vez a otras porciones de ADN y permiten la unión de las proteínas Cas 9 para que corten esas porciones

.C
de ADN.
En general, el sistema CRISPR/Cas es un sistema de protección de las bacterias contra los virus, es decir, en
general esos ARN que se expresan en el sistema suelen ser complementarios a genomas exógenos como los de los
virus y permiten que la enzima cas9 destruya a los agentes exógenos.
Los científicos han empezado a emplear este sistema para modificar el genoma de animales de experimentación o
DD
de células en cultivo ¿Cómo?
1. Se introduce en la célula ARN de la familia CRISPR para que se unan a las porciones del ADN que nos
interesan. Por ejemplo, si queremos saber la función de un gen, podemos sintetizar ARN que se dirijan a la
zona de ese gen. También se introduce la proteína Cas 9 para que corte el sitio.
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2. Al cortar en doble cadena, se va a iniciar un proceso de reparación del ADN
a. Si no hacemos nada más, predominantemente la reparación va a ser por unión de los extremos no homólogos,
LA

con lo cual se va a producir una pérdida de función de este gen

b. Si además introduzco en la célula una porción de ADN homóloga a la porción que corte (pero con una
mutación), el mecanismo de reparación por recombinación homóloga va a poder utilizar este molde para
reparar el ADN.
Si la porción de ADN homóloga tiene una mutación, puedo ver qué consecuencias tiene en el animal
haber introducido esta mutación y puedo estudiar la función de este gen.
En ambos casos puedo estudiar la función del gen a través de
FI

a. Un knockout: porque estoy eliminando la función

b. Un knockin: cuando produzco una mutación y veo cuál es la consecuencia
Entonces, la técnica de CRISPR7Cas ha facilitado en forma muy significativa la producción de animales
transgénicos, debido a que yo puedo producir un Knockout o Knockin en un blastocisto y obtener una
descendencia que exprese este cambio del genoma. Si el cambio del genoma está en las células germinales, lo


puede transferir a la descendencia, es decir, obtengo un animal transgénico.

Esta técnica es la más sencilla y la que se utiliza más para modificar el genoma.

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