PROCESAMIENTO CITOLÓGICO Y TISULAR

Aplicación de técnicas
enzimohistoquímicas

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 / 1. Introducción y contextualización práctica 3

/ 2. Enzimas 4
2.1. Tipos de enzimas 4

/ 3. Caso práctico 1: “Mecanismo de acción de las enzimas” 5

/ 4. Técnicas enzimohistoquímicas o de histoquímica enzimática.

Fundamentos 6
4.1. Procesamiento de la muestra para la conservación de la actividad enzimática 7

/ 5. Enzimas usadas en histoquímica enzimática 7

5.1. Hidrolasas. Fosfatasas y esterasas 8
5.2. Oxidorreductasas. Peroxidasas y deshidrogenasas 9

/ 6. Lectinas. Generalidades, funciones y clasificación 9

6.1. Histoquímica de las lectinas. Métodos de detección 10

/ 7. Caso práctico 2: “Biotina” 10

/ 8. Caso práctico 3: “Principales inconvenientes de las técnicas

enzimohistoquímicas” 11

/ 9. Resumen y resolución del caso práctico de la unidad 12

/ 10. Bibliografía 12

© MEDAC ISBN: 978-84-18983-71-9

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 Reconocer las principales características de las técnicas enzimohistoquímicas.

Identificar los tipos de enzimas que se usan en histoquímica.

Conocer las características y las funciones de las lectinas.

/ 1. Introducción y contextualización práctica

Dentro de las técnicas de tinción basadas en histoquímica, además de las referentes a reacciones químicas vistas
en la unidad anterior, debemos incluir las técnicas enzimohistoquímicas (histoquímica enzimática), las cuales
consisten en añadir un sustrato que reacciona con una enzima de la muestra histológica a estudio, desencadenando
una reacción enzimática que convierte sustancias solubles e incoloras en complejos insolubles y coloreados.

A día de hoy, las técnicas de enzimohistoquímica también se han

incorporado al trabajo rutinario de un laboratorio patológico, pues son de
gran utilidad gracias a la especificidad que presentan.

A continuación, escucha el siguiente audio donde planteamos la

contextualización práctica de esta unidad. Encontrarás su resolución en
el apartado ‘Resumen y resolución del caso práctico’.
Fig.1. Detección de lectinas mediante métodos
indirectos en un epitelio.

Audio intro. “Especificidad enzimática”

https://bit.ly/3HgObj0
 TEMA 10. APLICACIÓN DE TÉCNICAS ENZIMOHISTOQUÍMICAS
Procesamiento citológico y tisular /4

/ 2. Enzimas
Las enzimas son moléculas de naturaleza proteica que catalizan reacciones químicas en los organismos vivos. Por
lo tanto, las enzimas son considerados biocatalizadores. Los biocatalizadores son sustancias que intervienen en
las reacciones metabólicas, incrementando la velocidad de estas, sin ser consumidos durante dicha reacción. Sin
las enzimas, en las condiciones fisiológicas en las que ocurren la mayoría de las reacciones metabólicas de nuestro
cuerpo (pH, temperatura, etc.), estas no serían posibles.

Las enzimas tienen la propiedad de la especificidad, es decir, una enzima solo cataliza una reacción específica del
metabolismo, por lo que cada reacción metabólica de nuestro organismo va a tener asociada su enzima específica.
Por ejemplo, el paso de glucosa a glucosa-6-fosfato que inicia el proceso de la glucólisis está catalizado por una
enzima que se denomina hexoquinasa.

Esta especificidad en la reacción catalizada por una enzima se puede explicar mediante el modelo llave cerradura,
en el que el sustrato encaja perfectamente con la enzima, como una cerradura y su llave. Cuando esto se produce,
se libera el producto de la reacción.

Este modelo no es válido para todas las reacciones catalizadas por enzimas, por lo que para explicar ciertas reacciones,
hay que acudir a otros modelos, como el modelo de ajuste inducido, donde el centro activo adopta la conformación
idónea solo en presencia del sustrato (la unión de este al centro activo origina un cambio conformacional que da
lugar a la formación del producto).

Fig.2. Modelo llave cerradura y modelo de ajuste inducido.

2.1. Tipos de enzimas

Las enzimas se pueden clasificar según las reacciones que catalizan.

A continuación, vamos a enumerar los tipos más importantes:

• Hidrolasas: son enzimas que catalizan reacciones de hidrólisis. En este tipo de reacciones interviene el agua
para formar nuevos compuestos. Son reacciones del tipo: A-B + H2O AH + B-OH. Un ejemplo es la enzima
lactasa, que cataliza la reacción lactosa + H2O para obtener glucosa + galactosa.

• Liasas: estas enzimas intervienen en reacciones de ruptura o unión de enlaces químicos entre sustratos. Son
reacciones del tipo: A-B A + B.
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• Transferasas: este tipo de enzimas catalizan reacciones químicas de transferencia de un grupo químico de un
sustrato a otro. Este tipo de reacciones responden a la ecuación química A-B + C A + C-B. Un ejemplo es la
enzima que cataliza la reacción de glucosa + ATP para obtener ADP + glucosa-6-fosfato.

• Ligasas: son enzimas que participan en reacciones de unión de dos

sustratos donde intervienen, por ejemplo, el ATP. Son reacciones
del tipo A + B + ATP A-B + ADP + Pi.

• Otras: como las oxidorreductasas (cataliza la transferencia de

electrones entre moléculas) o las isomerasas (transforma un
isómero de un compuesto químico en otro).

Las enzimas están presentes en todo tipo de reacciones metabólicas y, sin

ellas, estas no serían posibles. Fig.3. Visualización en 3D de las enzimas.

/ 3. Caso práctico 1: “Mecanismo de acción de las enzimas”

Planteamiento: Como hemos indicado anteriormente, una enzima es una molécula orgánica de naturaleza proteica
que se encuentra en los tejidos y ayuda a que las reacciones químicas se den a mayor velocidad, es decir, actúa como
catalizadora de reacciones químicas.

Nudo: ¿Cuál es el objetivo de la enzima? ¿Cómo lleva a cabo su acción?

Desenlace: El objetivo principal de una enzima es aumentar la velocidad con la que ocurre una reacción. Hay muchas
enzimas que son codificadas automáticamente para producir proteínas y acelerar las reacciones químicas, además
de realizar varias funciones dentro de una célula.

Respecto a su mecanismo de acción, lo podemos resumir en los siguientes pasos:

1. En primer lugar, se une el sustrato con la enzima en el centro activo de esta última, formando el complejo
enzima-sustrato mediante enlaces químicos.

2. Posteriormente, ocurre una modificación en el sustrato por catálisis, formándose el producto y dando lugar
al complejo enzima-producto.

3. Por último, se disocia el complejo enzima-producto, se libera el producto y la enzima queda libre de nuevo con
la posibilidad de volverse a unir a otro sustrato.

Fig.4. Mecanismo de la acción de una enzima.

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Procesamiento citológico y tisular /6

/ 4. Técnicas enzimohistoquímicas o de histoquímica

enzimática. Fundamentos
Las técnicas enzimohistoquímicas o de histoquímica enzimática se basan en el uso de enzimas y en la metabolización
de un sustrato por parte de estas moléculas.

Los marcajes de las reacciones enzimáticas en los tejidos pueden observarse gracias a que la mayoría de las enzimas
tienen la capacidad de mantener su centro activo funcionando tras la fijación tisular. Al estar activa, la enzima en
contacto con el sustrato transforma este en una sustancia insoluble, opaca o coloreada, que recibe el nombre de
producto primario de la reacción; en el caso de ser opaco, este producto será coloreado a través de otra reacción
donde entrará en juego un cromóforo o sustancia que le aportará color, dando lugar al producto final de la reacción.

En casi todas las técnicas histoquímicas que se han venido usando para ver las enzimas y localizarlas en los tejidos, el
producto final de la reacción suele ser insoluble. El resultado de estas técnicas puede ser visible en función de tener
alguna de las siguientes propiedades:

• Opaco a la luz blanca, ultravioleta o haz de electrones en microscopía electrónica.

• Luminiscencia, tanto fluorescencia como fosforescencia.

• Incremento del índice refractivo.

• Reflectividad (fracción de radiación incidente reflejada por una superficie).

La aplicación de las técnicas enzimohistoquímicas en los laboratorios de anatomía patológica ayuda, entre otras
cosas, en la realización de estudios neurohistológicos, en el reconocimiento celular del sistema hematopoyético o
en biopsias de musculatura esquelética.

Cabe destacar que el desarrollo de las técnicas inmunoenzimáticas (técnicas que estudiaremos en la próxima
unidad) ha reducido el uso de la histoquímica enzimática en el laboratorio.

Fig.5. Esquema de una reacción enzimática.

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4.1. Procesamiento de la muestra para la conservación de la actividad

enzimática
Si vamos a aplicar sobre nuestra muestra histológica a estudio técnicas enzimohistoquímicas, es importante que el
tejido no esté incluido en parafina, ya que la mayoría de enzimas se inactivan por fijación con formol.

Al no incluirse en parafina, la obtención de cortes para estas técnicas suele llevarse a cabo a través de dos
procedimientos diferentes:

• Congelar la muestra y, posteriormente, usar un criostato (microtomo de congelación): se recomienda

congelar las muestras en hielo seco (CO2) a -80 °C o en isopentano en un congelador (-25 °C), en un tubo
Eppendorf (biopsias) o bolsas de plástico (resecciones quirúrgicas).

• Usar un vibratomo.

Se utilice uno u otro procedimiento, es necesario que se obtengan cortes

de espesor mínimo (objetivo algo más difícil con el uso del vibratomo) para
poder tener muestras de referencia con una actividad enzimática estándar.

Además de todo lo citado, debemos tener presente que es fundamental

aplicar temperaturas y pH óptimos para la actividad enzimática para poder
obtener resultados fiables y evitar los falsos negativos con estas técnicas,
ya que cualquier variación en estos parámetros hará que la actividad no se
desarrolle correctamente. Fig.6. Corte en criostato.

/ 5. Enzimas usadas en histoquímica enzimática

Dentro de las enzimas comúnmente usadas, en histoquímica enzimática destacan, entre otras:

• En el grupo de las hidrolasas, las fosfatasas y las esterasas. Una reacción química enzimática muy empleada
en laboratorios estaría en la vía de la fosfatasa, cuya enzima también se detecta al microscopio.

• En el grupo de las oxidorreductasas, las peroxidasas (como las mieloperoxidasas) y las deshidrogenasas
(como las diaforasas). Otro tipo de reacción química enzimática muy empleada tiene su base en la vía
deshidrogenasa, gracias a la cual se oxida el lactato en piruvato por la acción de una enzima llamada lactato
deshidrogenasa (reacción fundamental del ciclo de Krebs); esta reacción provoca un cambio de color que
puede ser detectado bajo el microscopio

A continuación, en los siguientes apartados, vamos a ampliar información sobre todas ellas.

Fig.7. Actividad de la enzima lactato deshidrogenasa, ejemplo de enzima oxidorreductasa.

 TEMA 10. APLICACIÓN DE TÉCNICAS ENZIMOHISTOQUÍMICAS
Procesamiento citológico y tisular /8

La importancia de los controles en el siguiente Recuerda:

Recuerda...
Cuando se realizan técnicas histoquímicas o inmunohistoquímicas se
requiere el uso de controles o testigos que nos verifiquen que la técnica
está correctamente realizada. Todas las técnicas enzimohistoquímicas
deben tener controles positivos y negativos.

5.1. Hidrolasas. Fosfatasas y esterasas

En relación con las hidrolasas, destacan dos tipos:

• Fosfatasas: se suelen emplear tanto fosfatasas alcalinas como ácidas. Las sales de diazonio son utilizadas
como indicadores colorimétricos en estos casos, que unidas a los productos de estas reacciones (alcoholes
aromáticos) proporcionan color rojo.

La fosfatasa alcalina, por ejemplo, puede actuar como marcador en lesiones isquémicas (cuando se produce
un aumento de su actividad) o como indicador en el deterioro de órganos como el riñón (cuando existe una
disminución de su actividad).

• Esterasas: las esterasas son un grupo de enzimas presentes en los lisosomas de células sanguíneas. Dada la
abundancia de lisosomas en leucocitos, las esterasas resultan útiles para el estudio de preparados sanguíneos.

Una de las ventajas de las tinciones con esterasas es que son las únicas enzimas hidrolíticas con actividad
incluso tras la inclusión de las muestras en parafina, por lo que pueden emplearse tanto preparaciones
congeladas como fijadas e incluidas en parafina.

Existen diversos tipos de esterasas, específicos del sustrato que hidrolizan:

» Esterasa de cloroacetato de naftol AS-D (procedimiento de Leder): para identificación de neutrófilos,

inclusiones de lisosomas en forma de granulocito que se colorean de rojo escarlata, los núcleos, sin
embargo, se verán en tono azul.

» Esterasa de acetato de alfanaftilo: se observará el citoplasma de los linfocitos T, neutrófilos, monocitos e

histiocitos de color rojo o marrón.

» Esterasa del butirato de alfanaftilo: se verá el citoplasma de monocitos e histiocitos, así como el aparato
de Golgi de linfocitos T teñidos de color rojo o marrón, mientras que el citoplasma de neutrófilos y
eosinófilos permanecen incoloros.

Vídeo 1. “Procedimiento de tinción de las

esterasas”
https://bit.ly/3ciuucl

Casos de éxito...
La histoquímica de las esterasas es el ‘gold standard’ para el diagnóstico
de patológicas uterinas y del tracto urinario, por poder detectarse
leucocitos en frotis y en orina, indicadores de una posible reacción contra
una infección.
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5.2. Oxidorreductasas. Peroxidasas y deshidrogenasas

En cuanto a las oxidorreductasas, destacamos principalmente dos tipos:

• Peroxidasas: la mieloperoxidasa o peróxido de hidrógeno oxidorreductasa es una de las proteínas más

abundantes de neutrófilos, monocitos y macrófagos. Es la única peroxidasa que cataliza la conversión del
peróxido de hidrógeno y cloruro a ácido hipocloroso, lo que la convierte en un buen método de tinción en las
células donde sea más abundante.

El método de la mieloperoxidasa nos permite observar neutrófilos y

sus precursores en color negro o marrón.

• Deshidrogenasas: enzimas con acción oxidorreductasa, cuya función

es eliminar el hidrógeno y transferirlo a otra sustancia. Nos permiten
ver neuronas y prolongaciones nerviosas en tonalidades azules, así
como los vasos sanguíneos y el tejido muscular. Fig.8. Método de la mieloperoxidasa.

/ 6. Lectinas. Generalidades, funciones y clasificación

Dentro de las técnicas de tinción basadas en histoquímica, en concreto de las técnicas enzimohistoquímicas,
debemos prestar atención a un grupo de moléculas llamadas lectinas.

Las lectinas son proteínas que están distribuidas en gran cantidad por todos los seres vivos (incluyendo, además,
a los virus). El término fue propuesto en 1954 por William C. Boyd y Elizabeth Shapleigh a partir de la palabra
latina legere que significa ‘seleccionar’, refiriéndose a la capacidad de unión selectiva de estas proteínas a azúcares
particulares.

Debido a la capacidad de reconocimiento específico de residuos glucídicos y dado que los carbohidratos pueden
estar a su vez asociados a proteínas, lípidos o ácidos nucleicos, las funciones de las lectinas son muy variadas:

• Mecanismo de defensa frente a patógenos.

• Quimiotaxis. Permite a las bacterias concentrarse en llegar a la zona

donde más moléculas alimentarias haya, como la glucosa, o alejarse
de sustancias tóxicas, como el fenol.

• Inflamación.

• Señalización.

• Migración o adhesión celular.

• Coagulación.

• Metabolismo lipídico.

• Etc. Fig.9. Elizabeth Rollins Shapleigh.

Audio 1. “Clasificación de las lectinas”

https://bit.ly/2YD40Pt
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Procesamiento citológico y tisular / 10

6.1. Histoquímica de las lectinas. Métodos de detección

Las lectinas son moléculas que se unen a oligosacáridos o carbohidratos de forma específica y pueden usarse como
anticuerpos en inmunohistoquímica para obtener reacciones colorimétricas. No obstante, la mayoria de lectinas
son multivalentes, es decir, son capaces de unirse a varios carbohidratos.

Existen dos métodos de detección para marcaje de estas:

• Método de detección directo: emplean lectinas directamente unidas con un marcador visual (ya sea
enzimático o fluorescente).

• Método de detección indirecto: se emplea una lectina concreta conjugada con un residuo de biotina, de tal
forma que la lectina biotinilada reconocerá el dominio del glúcido concreto en la muestra sobre la que se aplique.

Posteriormente, el tratamiento con un complejo de avidina

(proteína) y un trazador enzimático (peroxidasa) logrará formar
complejos ABS (complejo avidina-biotina), unidos al carbohidrato
reconocido por la lectina en la muestra.

Al añadir peroxidasa, dará lugar a la producción de un residuo de

color marrón que se depositará en el lugar donde se encuentre el
carbohidrato reconocido.

Entre sus aplicaciones para las técnicas histoquímicas, las propiedades de

reconocimiento de las lectinas permiten, principalmente:

• La identificación y el marcaje de glucoproteínas o glucolípidos

mediante los métodos citados anteriormente.

• El estudio de quistes odontogénicos (lesiones de los maxilares).

• La identificación y el marcaje de microorganismos. Existe un tipo

de lectinas que se ubican en la superficie de estos y reciben el
nombre de adhesinas.

• Ayudar en estudios serológicos. Fig.10. Métodos de detección.

Investigamos...
A continuación se recomienda realizar una búsqueda sobre la función de
señalización de las lectinas en Google Scholar. Tras esto comprenderás
mejor la importancia de este proceso.

/ 7. Caso práctico 2: “Biotina”

Planteamiento: En el método de detección indirecta se usa un residuo de biotina para conjugarlo con la lectina y así
proceder a la reacción química.

Nudo.: ¿De dónde sale este tipo de residuo y qué más podemos decir de él?
 TEMA 10. APLICACIÓN DE TÉCNICAS ENZIMOHISTOQUÍMICAS
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Desenlace: La biotina pertenece al grupo de vitaminas hidrosolubles del complejo B en humanos, y está involucrada
con procesos metabólicos y reacciones químicas.

Las personas que tienen deficiencia de biotina son pacientes sometidos a una alimentación parenteral total, personas
que ingieren grandes cantidades de clara de huevo crudo, niños con desnutrición severa y personas con errores
innatos en el metabolismo.

La biotina tiene un papel importante asegurando al cuerpo el aprovechamiento de todos los nutrientes posibles
para la producción de energía, participando en la transformación de grasas y carbohidratos en glucosa, y en la
descomposición de las proteínas en aminoácidos.

Fig.11. Molécula de la biotina.

/ 8. Caso práctico 3: “Principales inconvenientes de las

técnicas enzimohistoquímicas”
Planteamiento: Además de lo comentado anteriormente en el apartado del procesamiento de la muestra respecto a las
consideraciones a tener en cuenta para poder conseguir resultados adecuados (evitar la fijación con formol, obtener
cortes de espesor mínimo, etc.), es relativamente fácil obtener falsos positivos con las técnicas enzimohistoquímicas
si descuidamos otros aspectos a la hora de trabajar en el laboratorio.

Nudo: Además de lo indicado en apartados anteriores, ¿qué otras consideraciones debemos tener en cuenta para
evitar falsos positivos?

Desenlace: Los resultados obtenidos de las técnicas enzimohistoquímicas

también pueden ser erróneos debido a:

• Contaminación por microorganismos.

• Presencia de elementos naturales que interfieran en la conexión

enzima-sustrato, impidiendo que se genere coloración.

• Difusión de enzimas de unas regiones a otras.

• Presencia de metales pesados en el tejido por absorción inespecífica Fig.12. Una muestra contaminada echa a
de este. perder cualquier posible estudio.
 TEMA 10. APLICACIÓN DE TÉCNICAS ENZIMOHISTOQUÍMICAS
Procesamiento citológico y tisular / 12

/ 9. Resumen y resolución del caso práctico de la unidad

La histoquímica enzimática o técnicas enzimohistoquímicas (un tipo de técnicas de tinción basadas en histoquímica)
están basadas en el uso de enzimas y en la metabolización de un sustrato por parte de estas moléculas. En laboratorios
de anatomía patológica, estas técnicas se llevan a cabo para el estudio de preparaciones frescas, ya que la fijación en
formol puede originar la inactivación de la gran mayoría de enzimas.

Dentro de las enzimas comúnmente usadas en histoquímica enzimática destacan, entre otras, las hidrolasas
(fosfatasas y las esterasas) y las oxidorreductasas (peroxidasas como las mieloperoxidasas y deshidrogenasas
como las diaforasas).

Dentro de estas técnicas, debemos prestar atención a un grupo de proteínas llamadas lectinas, moléculas que se
unen a oligosacáridos o carbohidratos de forma específica y pueden usarse como anticuerpos en inmunohistoquímica
para obtener reacciones colorimétricas.

Fundamentos y aplicaciones de estas técnicas

APLICACIÓN DE TÉCNICAS
ENZIMOHISTOQUÍMICAS

Procesamiento para conservar la actividad enzimática

Enzimas comúnmente usadas en histoquímica enzimática:

hidrolasas y oxidorreductasas

Histoquímica de las lectinas, función y métodos de detección

Generalidades sobre las enzimas. Tipos

Fig.13. Esquema resumen del tema.

Resolución del caso práctico inicial

La especificidad es la propiedad más sobresaliente de las enzimas. Se refiere exactamente a que cada enzima cataliza
un solo tipo de reacción, actuando sobre un sustrato único o sobre un grupo reducido de ellos.

Las enzimas hidrolíticas tienen una alta especificidad gracias a sus enlaces O-glucosídicos, que originan energía.
Sin embargo, el resto de enzimas tienen menos especificidad, debido a que rompen enlaces amida de proteínas de
diversos tipos, como las proteasas o enzimas proteolíticas (por ello, estas últimas no son muy usadas en los procesos
histoquímicos).

/ 10. Bibliografía
De Pablo, E; Espinosa, P., y Sanz, J. (2016). Procesamiento citológico y tisular. Grupo Arán.

Muñoz Muñoz, F.; Corrales, P., y Martínez, M.A. (2021). Procesamiento citológico y tisular. Editorial Síntesis (1ª edición).

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