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Extraccion y Purificacion de Proteinas a Nivel Industrial

Extraccion y Purificacion de Proteinas a Nivel Industrial

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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIAPAS FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS CAMPUS IV, TAPACHULA

DIAGNOSTICO MOLECULAR

TRABAJO DE INVESTIGACION

“EXTRACCION Y PURIFICACION DE PROTEINAS”

CATEDRATICO: DR. LUIS MIGUEL CANSECO AVILA

ALUMNO: RODAS HERRERA MIGUEL ANGEL

SEMESTRE: 6°

GRUPO: “A”

TAPACHULA CHIAPAS A 30 DE ABRIL DEL 2010 INTRODUCCIÓN

La mayor parte de las investigaciones bioquímicas requieren la purificación, al menos parcial, de las sustancias objeto de estudio. Esto requiere generalmente un gran esfuerzo ya que una célula contiene miles de sustancias diferentes, la molécula que buscamos puede ser extremamente inestable o encontrarse a concentraciones muy bajas. En este tema se presenta una visión general de las técnicas más usuales empleadas para la purificación de proteínas, aunque muchas de ellas son aplicables a la separación de la mayoría de las moléculas biológicas. Los recientes avances en genética molecular han aumentado la importancia que tienen los procesos de recuperación y purificación de proteínas. A lo largo de los años, el aumento del uso de microorganismos como fuente de proteínas, particularmente enzimas, ha conducido a la mejora en la eficiencia de producción y a productos más reproducibles. La gran mayoría de las enzimas de uso industrial son proteínas extracelulares procedentes de organismos como: Aspergillus sp. Bacillus sp. e incluye a las enzimas α-amilasa, proteasas y glucoamilasa Muchas de estas son producidas a partir de cepas silvestres de microorganismos. Sin embargo, en la producción de proteínas para uso en el campo del diagnóstico clínico y para aplicaciones terapéuticas, la ingeniería genética y proteica está comenzada a jugar un papel muy importante día a día. La ingeniería genética además de permitir enormes incrementos del rendimiento, ha permitido la transferencia del material genético de animales a bacterias. De esta forma, esos productos sólo disponibles en pequeñas cantidades en los tejidos animales pueden ser producidos ahora en cantidades virtualmente ilimitadas a partir de bacterias crecidas de forma muy sencilla. Las enzimas o las proteínas producidas por los microorganismos pueden ser intracelulares, periplásmicas o secretadas al medio de cultivo. Para enzimas extracelulares, el grado de purificación requerido es mínimo y los procesos a gran escala pueden rendir toneladas de producto proteico. Muchas otras enzimas sin embargo, son producidos en mezclas intracelulares mas complejas y representan un mayor desafío implicado en la purificación proteica. Los productos para un uso terapéutico deben presentar unas características de purezas muy exigentes y exactas. De nuevo, la ingeniería genética ha sido capaz de ayudar en esta tarea. En el caso de las proteínas terapéuticas, hay grandes ventajas si la proteína de interés puede ser secretada, bien al periplasma, bien al medio. Esto provoca una enorme reducción del nivel de proteínas contaminantes y otras macromoléculas de forma que se puede obtener el producto puro tras solo dos o tres pasos de purificación. Ahora es posible añadir grupos a la proteína los cuales ayudan a su purificación Ya que confiere propiedades específicas, pudiendo posteriormente eliminar estos grupos cuando ya no es necesario.

DESARROLLO

PROTEÍNA Las proteínas son macromoléculas formadas por cadenas lineales de aminoácidos. El nombre proteína proviene de la palabra griega πρώτα ("prota"), que significa "lo primero" o del dios Proteo, por la cantidad de formas que pueden tomar. Las proteínas desempeñan un papel fundamental en los seres vivos y son las biomoléculas más versátiles y más diversas. Realizan una enorme cantidad de funciones diferentes, entre las que destacan: • • • • • • Estructural (colágeno y queratina) Reguladora (insulina y hormona del crecimiento), Transportadora (hemoglobina), Defensiva (anticuerpos), enzimática (sacarasa y pepsina), Contráctil (actina y miosina).

Las proteínas de todo ser vivo están determinadas mayoritariamente por su genética (con excepción de algunos péptidos antimicrobianos de síntesis no ribosomal), es decir, la información genética determina en gran medida qué proteínas tiene una célula, un tejido y un organismo. Las proteínas se sintetizan dependiendo de cómo se encuentren regulados los genes que las codifican. Por lo tanto, son susceptibles a señales o factores externos. El conjunto de las proteínas expresadas en una circunstancia determinada es denominado proteosoma. CARACTERÍSTICAS Los prótidos o proteínas son biopolímeros, es decir, están constituidas por gran número de unidades estructurales simples repetitivas (monómeros). Debido a su gran tamaño, cuando estas moléculas se dispersan en un disolvente adecuado, forman siempre dispersiones coloidales, con características que las diferencian de las disoluciones de moléculas más pequeñas. Por hidrólisis, las moléculas de proteína se escinden en numerosos compuestos relativamente simples, de masa molecular pequeña, que son las unidades fundamentales constituyentes de la macromolécula. Estas unidades son los aminoácidos, de los cuales existen veinte especies diferentes y que se unen entre sí mediante enlaces peptídicos. Cientos y miles de estos aminoácidos pueden participar en la formación de la gran molécula polimérica de una proteína. Todas las proteínas tienen carbono, hidrógeno, oxígeno y nitrógeno y casi todas poseen también azufre. Si bien hay ligeras variaciones en diferentes proteínas, el contenido de nitrógeno representa, por término medio, 16% de la masa total de la molécula; es decir, cada 6,25 g de proteína contienen 1 g de N. El factor 6,25 se utiliza para estimar la cantidad de proteína existente en una muestra a partir de la medición de N de la misma. La síntesis proteica es un proceso complejo cumplido por las células según las directrices de la información suministrada por los genes.

Las proteínas son largas cadenas de aminoácidos unidas por enlaces peptídicos entre el grupo carboxilo (-COOH) y el grupo amino (-NH2) de residuos de aminoácido adyacentes. La secuencia de aminoácidos en una proteína está codificada en su gen (una porción de ADN) mediante el código genético. Aunque este código genético especifica los 20 aminoácidos "estándar" más la selenocisteína y —en ciertos Archaea — la pirrolisina, los residuos en una proteína sufren a veces modificaciones químicas en la modificación postraduccional: antes de que la proteína sea funcional en la célula, o como parte de mecanismos de control. Las proteínas también pueden trabajar juntas para cumplir una función particular, a menudo asociándose para formar complejos proteicos estables. FUNCIONES Las proteínas ocupan un lugar de máxima importancia entre las moléculas constituyentes de los seres vivos (biomoléculas). Prácticamente todos los procesos biológicos dependen de la presencia o la actividad de este tipo de moléculas. Bastan algunos ejemplos para dar idea de la variedad y trascendencia de las funciones que desempeñan. Son proteínas: • • • • • • • Casi todas las enzimas, catalizadores de reacciones químicas en organismos vivientes; Muchas hormonas, reguladores de actividades celulares; La hemoglobina y otras moléculas con funciones de transporte en la sangre; Los anticuerpos, encargados de acciones de defensa natural contra infecciones o agentes extraños; Los receptores de las células, a los cuales se fijan moléculas capaces de desencadenar una respuesta determinada; La actina y la miosina, responsables finales del acortamiento del músculo durante la contracción; El colágeno, integrante de fibras altamente resistentes en tejidos de sostén.

ESTRUCTURA

Es la manera como se organiza una proteína para adquirir cierta forma. Presentan una disposición característica en condiciones fisiológicas, pero si se cambian estas condiciones como temperatura, pH, etc. pierde la conformación y su función, proceso denominado desnaturalización. La función depende de la conformación y ésta viene determinada por la secuencia de aminoácidos. Para el estudio de la estructura es frecuente considerar una división en cuatro niveles de organización, aunque el cuarto no siempre está presente. Conformaciones o niveles estructurales de la disposición tridimensional: • Estructura primaria. • Estructura secundaria. • Nivel de dominio. • Estructura terciaria. • Estructura cuaternaria. A partir del nivel de dominio sólo las hay globulares.

ETAPAS POSTERIORES DE PROCESAMIENTO: EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS LISIS CELULAR

Para obtener proteínas intracelulares de los microorganismos existen tres métodos generales; enzimáticos, químicos o físicos. No todas las metodologías pueden ser utilizadas en procesos a gran escala. Quizás el ejemplo mas destacado es la sonicación, que es el método más empleado en la obtención de proteínas en el laboratorio. Métodos enzimáticos de ruptura celular La lisozima cataliza de forma específica, la hidrólisis de enlaces β- 1,4-glucisidícos presentes en los mucopéptidos de las paredes celulares de las bacterias. Las bacterias Gram-positivas son las que presentar mayor sensibilidad a la lisozima. Sin embargo, la ruptura final de la envoltura celular, depende a menudo de la presión osmótica del medio de suspensión una vez que se ha digerido la pared. En las bacterias gran-negativas la ruptura de la pared celular se consigue con lisozima y la adición de EDTA, que actúa como agente quelante de iones metálicos, origina generalmente la lisis celular. Esta técnica no se puede utilizar para extracciones a gran escala de enzimas bacterianas debido al costo relativamente alto de la lisozima. En situaciones concretas se ha empleado glucanasas microbianas para hidrolizar las paredes de las levaduras, que contienen β-1,3 glucano, 3 y la lisoestafina empleada para liberar proteínas de estafilococos por ejemplo, la proteína A de S. aureus. Métodos químicos de lisis celular • Álcali. Este método ha sido utilizado con considerable éxito para la extracción de proteínas bacterianas a pequeña y gran escala. Por ejemplo la enzima terapéutica Lasparaginasa puede liberarse por tratamiento de Erwinia chrysanthemi a un pH alcalino entre 11.0 y 12.5, durante 20 minutos.4 el éxito del tratamiento depende de la estabilidad en álcali del producto a obtener. El elevado pH puede inactivar las proteasas y este método también es valioso en la inactivación lisis de microorganismos manipulados por ingeniería genética.

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(R. Kobayashi, T. Miwa, S. Yamamoto, and S: Nagasaki, Eur. J. Appl. Miccrobiol. Technol., 1982, 15, 14.) (T. Atkinson, B. J. Capel, and R. F. Sherwood, in `safety in industrial microbiology`, ed c. h. Collins and A. J. Beale, butterworth, Oxford, 1992, p. 161.)

• Detergentes. Los detergentes, tanto iónicos, como es el caso del lauril sulfato sódico, colato sódico (aniónico) y el bromuro de cetiltrimetilamonio (catiónico), o no-iónicos, por ejemplo el tritón X-100, X-450 o incluso el Tween, se han utilizado para favorecer la lisis celular. Los detergentes iónicos son más reactivos que los detergentes no-iónicos y pueden ocasionar la desnaturalización de muchas proteínas.

La presencia de detergentes puede afectar también a las etapas posteriores de purificación, en particular a la precipitación proteica por tratamiento con sales. Esto puede superarse en muchos casos con el uso de cromatografía de intercambio iónico o por ultrafiltración el tritón X-100 ha sido empleado para la liberación a gran escala del colesterol oxidasa a partir de Nocardia sp.5y el colato sódico se ha utilizado para solubilizar pululanasa una enzima ligada a membrana, a partir de células intactas de Krebsiella pneumoniae.6 Métodos físicos de lisis celular • Choque osmótico.

El choque osmótico ha sido utilizado en la extracción de enzimas hidroliticas y proteínas ligadas del espacio periplásmico de cierto número de bacterias Gramnegativas, incluyendo a Salmonella typhimurium y E. coli.7 El método implica el lavado del cultivo de bacterias en una solución tampón para tratar de eliminar los restos del medio de cultivo y posteriormente, por ejemplo, resuspenderlo en tapóm con sacarosa al 20%. Tras equilibrarse, las células se recogen y resuspenden rápidamente en agua a una temperatura aproximada de 4°C. Solamente un 4-8% de la proteína total bacteriana se libera por choque osmótico pero si la enzima requerida se localiza en la región peri plasmática, el choque osmótico puede producir un incremento de 14 a 20 veces en la purificación con otras técnicas de extracción. 8 El empleo del choque osmótico se está viendo favorecido con el incremento en el número de proteínas recombinantes que se secretan al periplasma. Homogeneización con abrasivos. Inicialmente esta técnica se utilizaba para la homogeneización de pastas celulares en un mortero con polvo abrasivo tal como cristal, alúmina o kieselguhr. El sistema ha sido desarrollado y mecanizado utilizando dispositivos desarrollados originalmente para la homogeneización húmeda y la dispersión de pigmentos en las industrias de impresión y pintura. Un producto típico, el Dynomill (w. a. Bachofen, Suiza) se emplea para liberar proteínas de una amplia variedad de microorganismos. Consiste en una cámara que contiene bolsa de vidrio y varios discos fijos y rotatorios. La suspensión celular se bombea en la cámara, y la rápida agitación es suficiente para romper incluso las bacterias más resistentes. La cámara de desintegración está refrigerada para eliminar el calor que se genera.

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(B. C.Buckland, W. Richamond, p. Cunnill, and M. D. Lilly, in `industrial Apsects of Biochemestry`, ed. B. Spencer, North Holland Publishing company, Amsterdam, 1974. P.65.) 6 (6 K. H. Kroner, H. Hustedt, S. Granda, and M-R. Kula, Biotechnol. Bioeng., 1978, 20, 2967.) 7 Neu and L. A. Heppel, J. Biol. Chem., 1965, 240, 3685. 8 S. E. Charm and C. C. Matteo, Methods Enzymol., 1971, 22, 476.

Un elevado número de factores influyen en la proporción de células lisadas, entre ellos el tamaño y concentración de bolas de vidrio, el tipo, la concentración y la edad de las células, la velocidad de agitación, el flujo a través de la cámara, la temperatura de ruptura y la disposición de los discos del agitador, habiéndose investigado todos ellos para levaduras10 y para bacterias.11 Tamización sólida

El método implica la extrusión del material celular congelado a través de un orificio de pequeño diámetro y a una presión elevada, manteniendo la temperatura próxima a -20°C. Se ha descrito un proceso semicontinuo, basado en una prensa X a escala de laboratorio, el cual presenta un peso de 10 Kg de pasta celular bacteriana por hora a una presión de 150 MPa y con una deficiencia del 90 % en la ruptura.12 Tamización líquida Este es ahora el método de ruptura celular de elección utilizado en la lisis a gran escala de microorganismos, estando muy extendida su aplicación tanto en procesos industriales como de investigación. Es particularmente útil en la ruptura de células bacterianas aunque también puede ser efectivo en la rotura de hongos o levaduras.13 Las células en una suspensión líquida son forzadas a pasar a través de un orificio de pequeño diámetro bajo una presión muy elevada. Para trabajos a pequeña escala se puede emplear una versión continua de la Prensa Frech Para trabajos a gran escala se emplea generalmente un homogeneizador que se pensó para la producción de emulsiones en la industria lechera. Para trabajos a gran escala el homogeneizador Manton-Gaulin es el más empleado. Las proporciones de rotura celular y de liberación proteica dependen de diversos factores, entre los que se incluyen el tipo de células, la concentración de las mismas y el pre tratamiento. El grado de liberación proteica de células de levadura se describe por la ecuación empírica de primer orden.14 log (Rm / Rm – R) = K n p2.9 Donde Rm = cantidad teórica máxima de proteína soluble que puede ser liberada, R = cantidad de proteína soluble liberada, K = constante dependiente de la temperatura, n = número de veces que la suspensión pasa a través de la máquina, y p = presión de trabajo. Ejemplos sobre el empleo de los homogeneizadores Manton-Gaulin para la rotura a gran escala de células microbianas. La β-galactosidasa se ha obtenido de E. coli 15.16 y la carboxipep-tidasa a partir de Pseudomonas spp.17 Un elevado número de enzimas se han obtenido de la bacteria termofílica Bacillus stearothermophilus,18 incluyendo la gliceroquinasa19.21 y una hexoquinasa glucosa específica.22
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F. Marfy and M. R. Kula, Biotechnol. Bioeng., 1974, 16, 623. J.R. Woodrow and a. v. quirk, enz, microbial. Technol., 1982, 24, 385 12 K.E. Magnusson and L. Edebo, Biotechnol. Bioeng., 1976, 18, 975. 13 S. T. L. Harrison, J. S. Dennis, and H. A. Chase, Cioseparation, 1991, 2, 95. 14 M. Follows, P. J. Hetherington, and M. D. Lilly, Biotechnol, Bioeng., 1971, 13, 549.

PURIFICACIÓN INICIAL Eliminación de restos celulares Una vez provocada la ruptura celular, la primera etapa en la purificación de una enzima intracelular es la separación de los restos celulares. La separación de sólidos de líquidos es una operación clave en el aislamiento de una enzima y normalmente se lleva a cabo por centrifugación o filtración. Centrífugas

Existen diferentes centrífugas con rangos de capacidad desde las de menos de 1 ml hasta aquellas que superan varios litros, capaces de aplicar una fuerza centrífuga superior a 100.000 g. Sin embargo, para la eliminación de células bacterianas, de restos celulares o de los precipitados proteicos es suficiente disponer de 20.000 g. Centrífugas de flujo continuo Debido a los grandes volúmenes de líquido que es necesario manejar al comienzo de un proceso de purificación enzimática a gran escala, es preferible utilizar una centrífuga de flujo continuo para eliminar el material particulado. Existen tres tipos básicos de centrífugas: la centrífuga tipo disco o multicámara, la centrífuga de cámara hueca y la centrífuga de cestillo. Las centrífugas de cámara hueca tienen un rotor tubular que provoca un flujo de extracto elevado, el cual se bombea en el fondo y fluye hacia la superficie de la cámara. El material particulado se deposita en las paredes del rotor y los extractos clarificados salen por la parte superior y son recogidos en un recipiente receptor. La facilidad para cambiar el rotor o la utilización de un mecanismo de transporte para recuperar el sedimento han contribuido a la popularidad de este tipo de centrífugas. Las centrífugas de disco permiten excelentes rendimientos en la clarificación de extractos crudos y en muchos casos el sedimento se puede eliminar sin interrumpir el proceso de centrifugación. La cámara contiene una serie de disvos alrededor de un cono central. Al entrar los extractos, el material particulado es arrojado al exterior, chocando con los discos y sedimentando el material sobre la pared de la cámara. Una desventaja de este tipo de centrifugación es la perdida de actividad cuando se descargan los sólidos.

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P. P. Gray, P. Dunnill, and M. D. Lilly, in proceedings of the IVth International Fermentation Symposium, ed. G. Terui, Socety for Fermentation Technology, Osaka, Japan, 1972, 347. 16 J. J. Higgins, D. J. Lewis, W. H. Daly, F. G. Mousqueira, P. Dunnill, and M. D. Lilly, Biothenol. Bioeng., 1987, 20, 159. 17 R. F. Sherwood, R. G. Melton, S. M. Alwan, and P. Hughes, Eur. J. Biochem., 1985, 148, 447. 18 T. Atkinson, G. T. Banks, C. J. Bruton, M. J. Comer, R. Jakes, T. Kamalagharan, A. R. Whitaker, and G.P. Winter, J Appl. Biochem., 1979, 1, 247. 19 M. J. Comer, C. J. Bruton, and T. Atkinson, J Appl. Biochem., 1979, 1, 259. 21 P. M. Hammond, T. Atkinson, M. D. Scawen, J Chromatogr., 1986, 366, 79. 22 C. R. Goward, R. Hartwell, T. Atkinson, and M. D. Scawen, Biochem. J., 1986, 237, 415

Los rotores de estos instrumentos que carecen de la facilidad para descarga del sedimento durante el proceso son difíciles de limpiar y ello puede resultar en una perdida de producto cuando se necesitan estos sólidos. Una variación de la centrifuga tipo disco es la centrifugación con un rotor de cámaras múltiples en la que el rotor s divide por cilindros montados verticalmente en una serie de cavidades interconectadas. Este tipo de acoplamiento asegura un paso fijo corto y constante para el llenado del rotor y es más fácil de desmontar y de limpiar que la centrifuga de tipo disco. Centrifugas de ese tipo son comercializadas por De Laval Separator Co. (Nueva York; USA) wesfalia separator Ltd. (wolver ton, UK) y por Bird machine co. (south

Walpole, Massachusetts, USA). Existe una revisión del desarrollo y la construcción de separadores para centrifugas en gran escala.23 Un problema que se presenta en todos los tipos de centrifugación cuando se trabaja a nivel industrial en la recuperación de encimas es que la mayora de los homogenizados produce precipitados poco consistentes. En algunos casos, puede evitarse mediante la adición de un agente tal como el CDR basado en la celulosa24 Centrifugas de cestillo El principal objetivo de estas maquinas es la obtención de material particulado de gran tamaño. En el contexto de la purificación de enzimas esto se refiere generalmente a materiales intercambiadores iónicos, lo cuales han sido empleados apara la adsorción de la proteína deseada.

Filtración através de la membrana. Un método alternativo para la clarificación de extractos celulares es la filtración. Sin embargo, la preparaciones microbianas frecuentemente son gelatinosas y por ello difíciles de filtrar por los métodos tradicionales a menos que se empleen áreas de gran tamaño para la filtración. Para evitar estos problemas se utiliza la filtración tangencial o de flujo cruzado. Las arilacilamidasa y carboxipptidasa G procedentes de especies seleccionadas de Pseudomonas se han aislados con éxito a partir de estos celulares rotos por micro filtración tangencial usando el sistema pellicon de millipore (millipore (UK) Ltd., Londres, UK). Las membranas con una estructura de poro asimétrica son bastante menos propensas a ensuciarse. Este tipo de membranas se han utilizados para separar arilacilamidasa de restos celulares de Pseudomonas. Membranas de este mismo tipo también se han usado en mayor escala para obtener L-asparaginasa a partir de Erwinia chrysanthemi. Esta misma estructura se empleo también para clarificar un extracto producido mediante la lisis alcalina de estas bacterias.

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H. Hemford and W. Kohlstette, Chem. Ind., 1985, 108, 412. M. Hoare, P. Dunnill, and D. J. Bell, Ann. N. Y. Acad. Sci., 1983, 413, 254. SEPARACIÓN ACUOSA BIFÁSICA Los sistemas acuosos de dos fases, típicamente creados almizclar soluciones de polietilenglicol y dextrano o polietilenglicol y sales especificas como fosfato potásico o sulfato amonico se pueden utilizar tanto para la separación de proteínas durante la purificación proteica como para la separación de proteínas de los restos celulares.29-33 Este fenómenos refleja el balance entre los componentes implicados: polímeros, sales, proteínas y solventes (agua). Una separación de proteínas precisas depende de parámetros tales como su peso molecular y carga, la concentración y el peso molecular de los polímeros, la temperatura, el pH., la fuerza iónica de la mezcla y la presencia de sales polivalentes tales como sulfato o fosfato.29-30 Las condiciones óptimas requeridas para una proteína

pedicular se deben encontrar empíricamente. Aunque las condiciones requeridas para llevar acabo una separación satisfactoria pueden a menudo ser definidas de forma precisa, el mecanismo de separación es muy poco conocido y la influencia precisa de las sales inorgánicas, desconocida. Además, el polietilenglicol, que es usado comúnmente en estas separaciones de fases, puede unirse a proteinas y esto puede causar comportamientos anómalos en los siguientes pasos cromatograficos típicos.34 Las fases se pueden separar en un depósito, pero una separación mas rápida y eficiente se lleva acabo mediante centrifugación. Se están investigando sustitutivos del dextrano crudo36 o el hidroxipropilalmidon.37 Abbott et al. Ofrece una buena visión general de los sistemas acuosos bifásicos con polímetros. La separación bifásica se a empleado en la purificación y separación a gran escala de la pulgada -6-glucan hidrolasa y de la 1,4-ßglucan-fosforilasa a partir de 5 Kg, de homogenizado celular de klebsiella pneumoniae39, y RNA polimerasa y glutamina sintetasa de E.coli40. Para alterar el proceso de separación de proteínas se han unido polímetros (partición-.afinidad).29.32.33 ligados a los

La separación por afinidad se ha utilizado para purificar la fórmico deshidrogenasa a partir de la levadura cándida bodinii, usando el colorante tiazinico rojo porción HE-3B, inmovilizado sobre polietilenglicol29. La separación acuoso bifásica es un método que puede ser fácilmente aumentando de escala a un nivel de manufacturación, aunque el coste de los polímeros podría ser un factor limitante.
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M. R. Kula, in ‘Extraction and purification of Enzymes, Applied Biochemistry and Bioengineering, Vol. 2’, ed. L. B. Wingard jnr., E. Katchalski-Katzir, and L. Goldstein, Academic Press, New York, 1979, p. 71. 30 M. R. Kula, D. H. kroner, and H. Husterdt, Adu. Biochem. Eng., 1982, 24, 73 33 H. Walter andG. Johansson, Anal Biochem, 1986, 155, 215. 34 J. Woodrow and A. V. Quirk, Enz. Microb. Technol, 1986, 8, 183. 32 G. Johansson, j. Biotechnol. 1985, 3, 11. 34 J. Woodrow and A. V. Quirk, Enz. Microb. Technol, 1986, 8, 183. 36 K. H. Kroner, H. Hustedt, and M. R. Kula, Biotechnol. Bioeng., 1982, 24, 1015. 37 F. Tjerneld, S. Berner, A. Cajarville, and G. Johansson, Enz. Microb. Technol., 1986, 8, 417. 38 N. L. Abbott, D. Blankschtein, and T. A. Hatton, Biosepatarion, 1990, 1, 191. 39 H. Hustedt, K. Kroner, W. Stach, and M. R. Kula, Biochnol. Bioeng., 1978, 20, 1989. 40 H. Vilter, Bioseparation, 1990, 1, 283.

PRECIPITACION Sulfato amónico La precipitación de proteínas mediante el uso de sales ha sido utilizada durante muchos años, siendo útil tanto para su purificación como para su concentración. La sal más comúnmente empleada es el sulfato de amonio debido a su alta solubilidad, a la ausencia de toxicidad para la mayor parte de las enzimas y a su bajo costo. La precipitación de una proteína mediante el tratamiento con una sal depende de diversos factores: como el pH, temperatura, la concentración de proteínas y la sal empleada.46 Solventes orgánicos

La adición de solventes orgánicos a soluciones acuosas reduce la solubilidad de las proteínas al disminuir la constante dieléctrica del medio. Siendo los más utilizados el etanol, la acetona y el 2-propanol, que es el más empleado. Debido a que las proteínas se desnaturalizan en presencia de solventes orgánicos es aconsejable trabajar a temperaturas inferiores a 0⁰C. La naturaleza inflamable de los materiales junto al alto costo y la baja selectividad hacen que los solventes orgánicos no sean usados a menudo en purificaciones enzimáticas a gran escala. Polímeros de alto peso molecular Existen otros agentes precipitantes orgánicos que pueden ser empleados para el fraccionamiento de proteínas; entre ellos nos encontramos los polímeros acuosolubles, de los cuales es el polietilenglicol el más ampliamente utilizado. Este compuesto presenta las siguientes ventajas: no es toxico, no es inflamable y además no produce la desnaturalización de proteínas.48 Se usa fundamentalmente en el campo del procesamiento de sangre.49 CROMATOGRAFIA La purificación de enzimas por cromatografía ha sido una práctica de laboratorio durante muchos años. Estos mismos procedimientos cromatograficos pueden ser empleados de forma similar para el aislamiento de cantidades muy superiores de proteínas La cromatografía es la única metodología con la selectividad suficiente para purificar una proteína de una mezcla proteica compleja con un grado de purificación final superior al 99,8%.

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K. C. Ingham, methods Enzymol. 1984, 104, 351. Y. L. Hao, W. Hoenig, and M. Wickerhauser, in `Methods of Plasma Fractionation`, ed. J. Curling, Academic press, New York, 1980, p. 57.

Optimización del salto de escala y de la calidad del proceso En la cromatografía analítica, así como en muchas aplicaciones a escala de laboratorio, la cantidad de muestra que se aplica es pequeña y el fin principal es el de obtener el mayor numero de picos o el producir una pequeña cantidad de proteína altamente purificada. La velocidad de flujo empleada suele ser baja, siendo la resolución el factor decisivo. Por el contrario, el propósito principal en la cromatografía preparativa es la purificación de grandes cantidades de proteína en el menor tiempo posible. Los flujos suelen ser elevados ya que la velocidad de procesamiento es más importante que la resolución. El salto de escala en la separación cromatografica es, en principio, sencillo, ya que la teoría de esta metodología señala que el diámetro de la columna no presenta un efecto importante sobre la resolución, de forma que bastaría con incrementar el diámetro de la columna para provocar el salto de escala.

Antes de realizar un proceso a gran escala es importante que el proceso de purificación que se ha de efectuar este optimizado y totalmente estudiado a nivel de laboratorio. La búsqueda inicial de las condiciones ideales en una técnica de adsorción debe efectuarse empleando diferentes adsorbentes bajo diversas condiciones de pH y fuerza iónica. Se pueden poner a punto métodos cromatograficos adecuados utilizando tanto equipos convencionales de baja presión como de elevada presión, con grandes prestaciones. A continuación de este proceso de optimización, el siguiente paso es el aumento de la cantidad de muestra que se puede separar en la columna, que debe multiplicarse por un factor de entre diez y veinte. La altura de la columna debe Mantenerse constante, mientras que el área superficial deberá incrementarse en proporción a la cantidad de muestra. El gel debe ser el mismo, o al menos tener características similares. El flujo, la fuerza iónica y el pH deben mantenerse invariados. Si se emplea un gradiente de elución, la relación entre los volúmenes de gradiente y de la columna debe ser idéntica. En principio, estos procesos de salto de escala deben repetirse hasta alcanzar la escala de operatividad deseada. En la proporción en que aumenta el diámetro de la columna incrementa el costo, así como la dificultad para asegurar la carga de la muestra sobre toda la superficie. Si el producto proteico va a ser destinado para uso humano existen otros factores, junto a los mecanismos del salto de escala, hay que tener en cuenta. Existiría la necesidad de demostrar que cualquier material que pudiera haber entrado en contacto con el producto durante su elaboración no. esto tiene presencia residual en el producto final. Es necesario un control estricto de las materias primas, incluidas las matrices de cromatografía utilizadas, para asegurar criterios estrictos en términos de pureza y aceptación. Esto, a su vez podría influir en la elección del método. Para llevar a cabo un procesado de calidad, es necesario distinguir entre los contaminantes procedentes del sistema biológico de las materias primas del proceso de aquellos introducidos incidentalmente durante el procesado. Es especialmente necesario disponer de métodos analíticos adecuados para la cuantificación de estas impurezas, las cuales podrían estar presentes en el producto final. Los contaminantes introducidos durante el procesado pueden ser de muy diversa naturaleza. Antes de la introducción deliberada de cualquier elemento durante el protocolo de purificación, es necesario asegurarse de que su presencia puede ser seguida de forma adecuada- se debería demostrar, así mismo, que puede ser eliminada satisfactoriamente (usando un paso de eliminación) en una etapa posterior. Los niveles de pureza deben ser extremadamente elevados, y esto podría eliminar ciertos abordajes para el salto de escala. La demostración de pureza es una consideración importante para lograr un proceso de calidad y ha conducido a la necesidad de complejas estratégicas para el análisis de la pureza de las proteínas incluso donde estas proteínas de uso farmacéutico se han producido mediante tecnología de DNA recombinante.51
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V. R. Anicetti, B. A. Keyt, and W. S. Hancock, Trend Biotechnol., 1989, 7, 342.

Selección de la metodología

Para obtención y separación de proteínas a gran escala se puede emplear cualquier de las técnicas cromatrograficas disponibles: filtración a través de geles, intercambio iónico, interacción hidrofobica , afinidad, inmunoafinidad, y electroenfoque. Tabla 1 métodos cromatografico para la purificación de proteínas a gran escala Característica Tipo de Características Aplicación molecular cromatografía aprovechada Tamaño Gel filtración Resolución moderada para el El fraccionamiento es mejor fraccionamiento y buena para en las últimas etapas de la tampones intercambiadores. purificación. En cualquier Capacidad limitada por el momento puede ser utilizado volumen de la muestra. los tampones intercambiadores y podrá existir una limitación respecto al volumen de la muestra. Carga Intercambiador La resolución puede ser alta. Es más efectiva en las iónico Capacidad alta no limitada por primeras fases del el volumen de la muestra. La fraccionamiento cuando se velocidad puede ser muy van a manipular grandes elevada dependiendo de la volúmenes. matriz. Cromatoenfoque La resolución puede ser alta. Es mejor usarla en una La capacidad puede ser alta. purificación posterior, ya que La velocidad puede ser alta. las matrices son caras. Polaridad Interacción Resolución buena. Capacidad Puede ser utilizado en hidrofobica muy alta y no limitada por el cualquier fase, pero es mejor volumen de la muestra. aplicarla cuando la fuerza Velocidad alta. iónica es alta tras la precipitación con sales o después de un intercambio iónico. Afinidad afinidad La resolución puede ser Puede emplearse en biológico elevada. Capacidad puede ser cualquier etapa, aunque alta o baja, dependiendo de normalmente no es ligando y no limitada por el recomendable en las volumen de la muestra. primeras fases. Velocidad elevada. En este sentido, etapas en las que se produce una concentración del producto, como es la cromatografía de afinidad, hidrofobica o de intercambio iónico deben realizarse antes que aquellas que causan una dilución, como es el caso de la filtración a través de geles. La cromatografía de interacción hidrofobica puede realizarse posteriormente a una de intercambio iónico con un cambio mínimo en el tampón, puesto que la mayoría de las proteínas se unen mas fuertemente a un soporte hidrofobica a fuerzas iónicas altas. LA CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD ES CAPAZ, POR SI SOLA, PARA LLEVAR A CABO LA PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS A ESCALA DE LABORATORIO. Elección de la matriz

Quizás la decisión mas importante que se debe tomar cuando se diseña un proceso de purificación a gran escala sea la concerniente a la selección del tipo de matriz de cromatografía. Una matriz de cromatografía a gran escala deberá ser hidrofilica, macroporosa, rígida, con partículas esféricas, químicamente estable, ligandos delicados y de fácil modificación. Tabla 2 ejemplos de matrices para cromatografías a gran escalas. Este listado no es exhaustivo, pero se pretende dar ideas acerca de la cantidad de material disponible. Matriz ejemplo proveedor Dextrosa con enlaces entrecruzados Sephadex 1 Poliacrilamida con enlaces entrecruzados Biogel-P 2 Agarosa Sefarosa 1 Biogel-A 2 Ultrogel-A 3 Agarosa con enlaces entrecruzados Sefarosa CL 1 Sefarosa FF 1 Superosa 1 Compuesto de poliacrilamida y dextrosa Sephacry1 1 Compuesto de poliacrilamida y agarosa UltragelAcA 3 Compuesto de dextrosa y agarosa Superdex 1 Polímeros etilenglicol-metacrilato Trisacry1 3 celulosa Fractogel 4 Cellex 2 DE-52, CM-52 5 Sephacel 1 Cellufina 6 Polímeros orgánicos rígidos Monobeads 1 TSK-PW 4 POROS 7 Sílice porosa Zorbax 8 Aquapore 9
1

Pharmacia AB, Uppsala, Suecia. 2BioRad Laboratories, Richmond, California, USA. 3IBF Biotechnics, Villeneuve la Garenne, Francia. 4TosoHass, Montgomeryville, Pennsylvinia, USA. 5Whatman Ltd., Maidstone, Kent, UK. 6Amicon Ltd., Stonehouse, Goucestershire, UK. 7Perseptive Biosystems Inc., Cambridge, Massachusetts, USA . 8 Rockland Technologies, Wilmington, Delaware, USA. 9 Brownlee Laboratories Inc., California, USA.

Tabla 3. Propiedades de las matrices cromatográficas básicas.

Porosidad Tipo de Matriz

Dextrano con enlaces entrecruzados Poliacrilamida con enlaces entrecruzados Agarosa Agarosa con enlaces entrecruzados Compuesto Poliacrilamida/Dextrano Compuesto Poliacrilamida/Agarosa Polímero acrílico hidroxilado Copolímero etilenglicolmetacrilato Celulosa Sílice porosa Polímero orgánico rígido

Baja Baja Alta Alta Alta Media Media

Adsorció n noespecífic a Baja Baja Baja Baja Media Baja Media

Rigide z

Estabilida d

Facilidad de modificació n Buena Buena Buena Buena Buena Buena Buena Buena Buena Deficiente Buena

Coste relativo

Baja Baja Baja Media Media Media Media Media Baja Alta Alta

Buena Buena Deficiente Buena Buena Buena Buena Buena Buena Deficiente Buena

Bajo/medio Medio Medio Medio Medio Medio/alto Medio Medio Bajo Alto Alto

Baja/media Media Media/alta Alta Baja/media Alta Media/alta Baja

Algunos geles, como los basados en agarosa o celulosa, son productos naturales; otros, como aquellos basados en dextranos entrecruzados o agarosa, son productos Naturales modificados; un tercer grupo esta basado en componentes totalmente sintéticos tales como la poliacrilamida, el polihidroxietilmetacrilato o el poliestireno. Los geles pueden clasificarse además en macroporosos, como los geles de agarosa o de celulosa, o microporos como los geles de dextrano o de poliacrilamida con enlaces entrecruzados. Los geles macroporosos son de mayor utilidad en la cromatografía de afinidad o de intercambio ionico o para el fraccionamiento de moléculas de gran tamaño, virus, proteínas muy grandes, o micro proteínas. Los geles de microporosos son más aplicados para el fraccionamiento de restos de proteínas. Los primeros geles con consistían en matrices de dextrano con enlaces entrecruzados, celulosa, poliacrilamida, o agarosa, eran muy blandos no se adecuaban fácilmente a procesos cromatográficos a gran escala. La nueva generación de geles macroporosos a un que formados por un elevado numero de enlaces entrecruzados, son matrices de agarosa o de poliacrilamida-agarosa, son mucho mas rígidos y adecuados para purificación a gran escala. Poseen un tamaño de partícula más pequeño y mejor controlado, lo que permite una reproducibilidad mayor cuando se usan grandes velocidades de flujo.

Gel filtración

Éste tipo de separación se basa en el tamaño molecular. La fase estacionaria esta formada por bolas porosas rodeadas de una fase solvente móvil. Cuando se añade la muestra, las moléculas de la mezcla se reparten entre los poros del gel del solvente. Las moléculas de tamaño, incapaces de atravesar los poros, pasan a través de los espacios intersticiales y eluyen en primer lugar. Las moléculas más pequeñas que pueden pasar a través de los poros, se eluyen posteriormente, en orden decreciente de tamaño. El volumen total de una columna puede representarse por: Vt = V0 + Vi + Vm (2)

Donde Vt es el volumen total de la columna, V0 el volumen del solvente en el exterior de las partículas, Vi el volumen del solvente que ocupa el interior de las partículas, y Vm el volumen de la matriz. El volumen de elución de una proteína puede por tanto variar entre, V0 para una proteína que no penetra en los poros del gel, y Vi para aquellas que son capaces de entrar en la matriz. Así es posible calcular un coeficiente de partición efectivo, Kav, el cual varía entre 0 y 1. Kav = (Ve – V0) / (Vt – Vo) (3)

Donde Ve es el volumen de elución del soluta, Vo el volumen vacío de la columna y Vt el volumen total de la columna. Para las proteínas globulares se ha demostrado empíricamente que el valor de Kav es inversamente proporcional al logaritmo de la masa molecular relativa.

Es esencial que no exita interacción entre la matriz y el soluto; por consiguiente, la sustancia ideal que forma la columna debería ser totalmente inerte, y para tener capacidad máxima, debería ser también altamente porosa y rígida. Para el trabajo a gran escala, la rigidez es quizás el factor más importante ya que determina la velocidad de flujo que se puede utilizar. Por esta razón, la mayoría de las aplicaciones del gel filtración se limitan a proceso de eliminación de sales, empleando geles de baja porosidad, aunque sean rígidos como es el caso de Sephadex G-25 y G.50. Cromatografía de intercambio iónico

Tradicionalmente para el fraccionamiento de proteínas se han empleado los intercambiadores iónicos basados en compuestos de celulosa con diversos sustituyentes; Tabla 4. Sustituyentes en intercambiadores iónicos Intercambiador anionico Amina cuaternaria (Q) Amino etilo cuaternario (QAE) Dietilaminoetilo (DEAE) -CH2-N+-(CH3)3 -O-CH2-CH2-N+(C2H5)3 -O-CH2-CH2-N+(C2H5)2

Los intercambiadores celulósicos iónicos son ideales para diversas operaciones como primera etapa en varios procesos. No es posible usar habitualmente en procesos a gran escala estas columnas de celulosa, debido a que no pueden soportar grandes velocidades de flujo y a que sufren cambios de volumen si se producen cambios de pH o fuerza iónica siendo muy complicado regenerarlas sin volver a empaquetar la columna. CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD

La cromatografía de afinidad es quizá el método de purificación más elegante para obtener una proteína a partir de una mezcla compleja. Aunque se usa ampliamente en el laboratorio, solo en los últimos años parece aceptable en purificaciones a escala industrial. Esta metodología se basa en la interacción de una proteína con un ligando inmovilizado. El ligando puede ser bastante especifico para una proteína particular, por ejemplo un sustrato, un análogo del substrato, un inhibidor, o un anticuerpo. Existen alternativas en las que el ligando es capaz de interaccionar con una variedad de proteínas, en este caso del NAD, AMP, ADP, colorantes, o cadenas de hidrocarburos. La cromatografía de afinidad con nucleótidos inmovilizados es escasamente usada en procesos de purificación a gran escala quizá debido a su inestabilidad, corte, baja capacidad y las dificultades de su incorporación a una matriz solida. Para la purificación a gran escala de muchas enzimas, se ha empleado colorantes inmovilizados, puesto que poseen ventajas tales como facilidad de unión a un soporte matriz, estabilidad, alta capacidad y al económicos.55

55

Y. D. Clonis, C. R. Lowe, T. Atkinson, and C. J. Bruton,`Reactive Dyes in Protein and Ensyme Technology`, Macmillan, London, 1987.

Tabla 5. Ejemplos de enzimas purificadas a gran escala por con colorantes. Enzima Colorante Gliceroquinasa Proción azul-MX-3G Glucoquinasa Proción marrón H-3R Glicerol deshidrogenasa Proción rojo HE-3B Metionil- tRNA sintetasa Proción verde HE-4BD Triptofanil tRNA sintetasa Proción marrón MX-5BR 3-hidroxibutirato deshidrogenasa Proción rojo H-3B Malato deshidrogenasa Proción azul MX -4GD Proción rojo H-3B Proción azul MX-4GD

cromatografía de afinidad Eluyente 5 mM ATP 2 mM ATP 2 mM NAD Gradiente de fosfato 50 mM triptófano 1 M KC1 1 M KC1 + 2 mM NADH 1 M KC1 + 2 mM NADH Gradiente 0-0,7 mM KC1

Carboxipeptidasa G2 Proción rojo H-8BN

Adsorbido en presencia de 0,2 mM Zn2+ y tris C1H 0,1 M, eluido con 10 mM EDTA pH 5,8y después, con tris-C1H 0,1 M pH 7.3

Albumina de suero bovino Albumina de suero bovino

Cibracron azul F3-GA Cibracron azul F3-GA

20 mM octanoato sódico 3 M NaCl, pH 8,6

Los colorantes son, a menudo, estructuras del tipo de la antraquinona, que unen proteínas por la interacción con los dominios de unión a nucleótidos de las deshidrogenasas. Han sido aislados muchos otro tipos de proteínas con estos colorantes, 56 por lo que se piensa que la interacción específica para cada caso debe ser mas variable y, en las mayoría de los casos, desconocida. En los últimos años se han empleado de forma más amplia la cromatografía de inmunoafinidad debido a la mayor disponibilidad de anticuerpos monoclonales. Por ejemplo, el interferon leucocitario recombinante60 y las tres hormonas pituitarias humanas61, 62 han sido purificadas usando esta técnica. Puesto que la cromatografía de afinidad presenta una alta selectividad, es por lo que se pueden purificar proteínas varios miles de veces en un solo paso. A menudo, es posible separar formas activas e inactivas de una proteína, mediante el uso de un anticuerpo o pseudosubstrato, o eliminar una pequeña cantidad de impureza de un producto puro. Existen otros muchos ejemplos sobre la utilidad de esta metodología en procesos a gran escala, entre ellos están los descritos por Hill y Hirtenstein y Clonis.64

56

M. D. A. Scawen and T. Atkinson in `Reactive Dyes in Protein and Ensyme Technology`, ed. Y. D. Clonis, C. R. Lowe, T. Atkinson, aand C. J. Bruton, Macmillan, London, 1987, p.76. 61 G. W. Jack and R. Blazek, J. Chem. Tech. Biotechnol., 1987, 39, 1. 62 G. Q. Jack, R. Blazek, K. james, J. E. Boyd, and L. R. Micklem. J. Chem. Biothecnol., 1987, 39, 45.

Se pueden usar iones metálicos inmovilizados, como Zn2+ o Ni2+, para separar proteínas. Esta separación depende de la interacción entre el ion metálico y los residuos de histidina de la superficie proteica. El ion se inmoviliza quelandolo a un grupo iminodiacetato que, a su vez, está unido a una matriz adecuada, normalmente agarosa. Las proteínas unidas se pueden eluir usando un ligando competitivo, como por ejemplo el imidazol. 65 Los criterios para elegir una matriz de cromatografía de afinidad son similares a aquellos que se usan para cromatografía de intercambio iónico. Como resultado de ello, las más usadas matrices macroporosas, como Sefarosa o Trisacryl. La matriz ha de ser activada químicamente para unir covalentemente al ligando. Existen muchos métodos para hacerlo, 66 pero el más habitual es el de bromuro de cianógeno. También se pueden adquirir matrices activadas de los proveedores de productos de cromatografía si no se desea hacerlo por uno mismo. Los colorantes tienen la desventaja de que pueden ser acoplados directamente a la agarosa sin previa activación. 56, 67 Los métodos para eluir una proteína ligada pueden ser específicos, mediante el uso de un substrato o cofactor, o no específicos, por ejemplo modificando el pH o la concentración salina. La elución no-especifica se utiliza habitualmente cuando adsorbentes muy selectivos se unen a un solo componente; con adsorbentes menos selectivos se unen a un solo componente; con adsorbentes menos selectivos, la elución especifica proporciona mayor grado de purificación. Para la elución se puede emplear, un substrato o ligando libre, cambios en el pH o la fuerza iónica, la adición de agentes desnaturalizantes o caotropicos (por ej., KSCN, urea, hipoclorito de guanidino), o cambios en la polaridad de los solventes, por adición de un modificador orgánico, como es el etilenglicol. Se prefiere el método mas suave, que, por lo general, se encuentra de forma empírica, siendo importante en muchos casos las consideraciones económicas. Aunque los procesos de purificación por afinidad pueden realizarse directamente o en columnas, se lleva a cabo generalmente en estas ultimas. Cromatografía de interacción hidrofóbica Este tipo de cromatografía se desarrolla al comprobarse que las proteínas se retienen, de forma inesperada, sobre geles de afinidad con cadenas espaciadoras hidrocarbonadas. Empleando este concepto, se desarrollaron familias completas de absorbentes empleando una serie de cadenas homologas entre C2 y C1068, aunque en la practica la mayoría de las proteínas pueden purificarse con agarosa acoplada con grupos fenilo y optilo. Las interacciones hidrofobicas son más fuertes a fuerza iónica alta, con lo que, a menudo, la absorción puede ser llevada a cabo tras la precipitación salina o la cromatografía de intercambio iónico, sin necesidad de modificar la concentración salina de la muestra. Las proteínas ligadas se puede eluir alterando el pH del solvente, la fuerza iónica o mediante el empleo de un agente caotropico o un modificador orgánico tal como el etilenglicol.
65 66

E. Sulkowski, Trends Biotechnol., 1985, 3, 1. M. Wilchek, T. Miron,and J. Kohn, Methods Enzymol., 1984, 104, 3. 67 C. R. Lowe and J. C. Pearson, Methods Enzymol., 1984, 104, 97. 68 S. Shaltiel, Methods Enzymol., 1984, 104, 69.

64

E. A. Hill and M. d. Hirstenstein, in `Advances in Biotechnological Processes`ed. A. Mizrahi and A. van Wezwl, Ala R. Liss, New York, 1983, p.31.ç64 Y. D. Clonis, Biol Technology, 1987, 5, 1290.

Los iones utilizados se pueden agrupar en series dependiendo de si promueven interacciones hidrofobicas (efecto de eliminación de sales) o si se rompe la estructura del agua (efecto caotropico) para debilitar la fuerza de interacción hidrofobica.

Se ha utilizado la cromatografía sobre columnas de fenil – sefarosa para purificar una arilacilamidasa de pseudomonas fluorescens. La enzima se éluyo de una columna de intercambio iónico en tampón fosfato 0,3 M, pH 7,6 a partir de 2 Kg de bacteria, y se purifico mediante una columna de 500 ml de fenil – sefarosa en el mismo tampón y el empleo de un gradiente decreciente de 0,1M a o,01 M tris – HCL, pH 7,6 2. Cromatografía líquida de gran resolución Uno de los mayores avances en cromatografía ha sido el desarrollo de matrices de relativamente bajo tamaño de partícula con gran capacidad de resolución y que sean capaces de trabajar a altas presiones. Se desarrollaron originalmente para separa pequeñas moléculas orgánicas solubles en solventes no acuosos, pero la técnica se perfecciono para poder separa proteínas y enzimas en solventes acuosos, pudiendo utilizar así todos los métodos cromatografícos habituales. 69,70 la mayoría de las aplicaciones reseñadas se usan solo a escala de laboratorio. La eficacia de las matrices de HPLC se deriva del pequeño tamaño de sus partículas (3 a 50µm), necesitándose presiones elevadas para generar velocidades de flujo adecuadas. Por ello, se necesitan partículas muy rígidas y, en este sentido, se han realizado dos aproximaciones para resolver este problema. Las matrices de sílice son los suficientemente rígidos y pueden ser activadas de forma adecuada como monocloro-o monoalcoxi-silanos para producir una superficie hidrofilica que puede posteriormente modificarse.71 sin embargo, presentan la desventaja de ser inestables a pH superior a 8; este problema se ha solucionado mediante el recubrimiento de un polímero para reducir las disponibilidad de las partículas inorgánicas al solvente, o más específicamente por estabilización de la superficie con sirconio. Las segunda aproximación ha sido el desarrollo de soportes poliméricos rígidos con enlaces entre cruzados, como el monobeads (pharmacia) o el TSK-PW (tosoHaas). Tras estas verdaderas matrices de gran resolución se ha desarrollado derivados de gran disolución de materiales del empaquetado convencionales, que presenta un menor número de tamaño de partícula, para lo que se denomina (cromatografía liquido de resolución intermedia) [MPLC].

69.

C. Horvath, `High Performance Liquid Chromatography: Advances and perspectives, Vol. 3`, Academic Press, New York, 1983. 70 J. F. Kennedy, Z. S. Rivera, and C. A. White, J. Biotechnol., 1989, 9, 83.

71

R. E. Majors, in ` High Performance Liquid Chromatography: Advances and perspectives, Vol. 1`, ed. C. Horvath, Academic Press, New York, 1981, p. 2.

Otra aproximación del problema de las velocidades de flujo y la presión en separaciones de alta resolución ha sido la cromatografía de perfusión.72 Existen pocos ejemplos en la literatura sobre las aplicaciones de HPLC debido principalmente a que son propiedad de productos específicos aunque algunos ejemplos de uso de técnicas convencionales de HPLC y de técnicas de afinidad de alta resolución de han descrito. 73,74 por ejemplo, la lactato deshidrogenasa del musculo del conejo se ha purificado empleando Proción azul MX-R inmovilizado sobre sílice. ULTRAFILTRACION

La ultrafiltración ha sido una técnica de uso corriente en el laboratorio para la concentración de soluciones proteicas en condiciones muy suaves. También es una alternativa para la diálisis y filtración a través de geles para la eliminación de sales o los cambios de tampones. DISEÑO DE PROTEINAS PARA SU PURIFICACION Los factores presentes en pasos previos a la purificación de las enzimas, tienen un gran impacto en su desarrollo y los métodos de purificación, así, la tecnología de DNA recombinante ha tenido un gran impacto en la purificación. La fusión de un gen de interés a secuencias promotoras eficientes hace que una proteína heterologa se exprese en un organismo madre hasta un total de un 10 al 40% de la proteína soluble total de la célula en comparación con la expresión de muchas proteínas naturales de la células, que constituyen un 0,01 a un 4% de la proteína total celular.

72

N. B. Afeyan, S. P. Fulton, N. F. Gordon, I. Mazsaroff, L. Varady, and F. E. Regnier, Biol. Technology, 1990,8, 203. 73 S. J. Brewer and B. R. Larsen in `Separations for Biotechnology`, ed. M. S. Virrall and M. J. Hudson,, Ellis Horwood, Chichester, 1987, p. 113. 74 S. Ohlson, L. Hansson, M. Glad, K. Mosbach, and P-O. Larsson, Trends Biotechhnol., 1989, 7, 179.

De esta forma, la purificación final se simplifica. Estos altos niveles de expresión pueden provocar que la proteína se produzca como granulos denso e insolubles denominados cuerpos de inclusión. Se ha observado con muchas proteínas recombinantes, como por ejemplo, laurogastrona, la interleuquina 2, la proquimosina y los interferones. Tras la rotura celular, se pueden sedimentar los gránulos a pocas revoluciones produciendo un material insoluble que contiene hasta un 50% de la proteína buscada. La solubilización y re naturalización de este material, especialmente cuando tiene enlaces disulfuro, Es difícil y requiere condiciones muy controladas. La solubilizacion precisa del uso de pH alto, urea o cloruro de guanidino; la eliminación de estos reactivos hace que la proteína precipite en solución acuosa. La célula productora también es importante, ya que si bien la hormona recombinante de crecimiento humana se produce en algunas estirpes de E.Coli bajo la forma de cuerpos de inclusión, en la estirpe RV308, en cambio, es soluble e, incluso forma puentes disulfuro correctos. La estructura precisa de una proteína recombinante puede afectar también a la formación de los cuerpos de inclusión. Un estudio a gran escala utilizando el interferon gama humano recombinante demostró que unos pocos cambios en los aminoácidos de la proteína podían convertirla de soluble a insoluble en la misma cepa de E. coli. 80 Otro ejemplo de la ayuda que presta el diseño genético en la purificación de proteínas es el concepto de las colas de afinidad. El gen de la proteína de interés se fusiona en fase con una secuencia de DNA que codifica alguna secuencia aminoacidica (cola de afinidad) que simplifica la purificación de dicha proteína, modificando sus propiedades de una manera conocida de antemano.81,82 Uno de los primero ejemplos fue la fusión de algunos residuos de arginina al extremo carboxi-terminal de la urogastrona. Esto hace convertirse a la proteína en extremadamente básica y unirse frecuentemente a una matriz de intercambio ionico cationico. Al unirse a este tipo de matrices solo un 10% de las proteínas totales celulares, se puede obtener una gran purificación al eluir dicha columna. La columna de poliargininas puede ser eliminada tras la purificación mediante una carboxipeptidasa A inmovilizada; al ser introducida la proteína tratada otra ves en la misma columna la posición en la que eluye cambia, pero no la de los contaminantes que se hubiese podido arrastrar. Se han descrito otras funciones que permiten purificar posteriormente por afinidad

80

R. Wetzel, L. J. Perrry, and C. Veilleux, Biol Technology, 1991, 9, 731.

Cola

Matriz o ligando

Condiciones

de Condiciones

de

elución Gradinete de NaCl Etilenglicol Gradiente de pH bajo +-HCl de guanidino Dipeptido His-Trp4 Iminodiacetato pH8 Gradiente de pH 2+ sefarosa (Ni ) bajo Péptido Anticupero anti Flag NaCl 0.15 M, CaCl EDTA, pH 7.4 antigenicocFlagTM pH7.8 2 1Mm b-galactosidasaf Sefarosa TPEG 1.6 M NaCl, pH7 Borato 0.1 M Colramfenicol pNaCl 0.3M pH 7.8 Cloramfenicol 5mM acetiltransferasag amonicloranfenicol sefarosa Proteína Ah Sefarosa con IgG pH 7.6 Acido acético 0.5 M Gltation S- Sefarosa con pH7.3 Agente reductor de j.k trasnferasa glutation tioles poliargininaa polifenialaninab polihistidinac S-Seforosa Fenil sefarosa Nitroltriacetato sefarosa (Ni2+) S.J. Brewer and H.M Sassenfeld, trends. Biotechnol., 1985, 3, 119. b M. person, M.G. Bergstrand, l. bulow, and K. Moosbach, Anal. Biochem. , 1988, 172, 330. E. Hochui, W. Bannwarth, H. dobeli, R. gentz , and D. Stuber, Bio/Technology, 1988, 6, 1321. d M.C.smith, T.C. furman, T.D. INGOLIA, AND c. Pidgeon, J. boil. Chem.., 1988, 263, 7211. Ct.p. Hopp, K.S. Prickett, V.L. Price, R.T.Libby, C.J. March, D.L. Urdal, and P.J. Colon, Bio/Technology, 1988, 6, 1204. A.Ullman, Gene, 1984, 29, 27.gJ. A. Knott, C.A. Sullivan, and A. Weston . Sankar and A.G. Porter, J.Virol, 1991, 65, 2993.kD.B. Smith and K.S.Johnson, Gene, 1988,67,31. Los problemas de purificación de fusiones por afinidad son, en 1 lugar los derivados de las condiciones necesarias para la posterior elución y, en 2 lugar, los inherentes al eliminación de la cola de afinidad una ves que sea purificada la proteína. Un ejemplo son las funciones de la proteína A, que aunque se han aplicado con éxito al factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-1)84, a la fosfatasa alcalina proteína muy estable, y, con menor éxito a la galactosidasa, 85 adolecen de 2 ventas. La 1 es que si se utilizan las condiciones extremas de pH o grandes concentraciones de sustancias caotropicas que se requieren para eluir a la proteína A de la IgG inmovilizada ne la columna, las proteínas de fusión pueden desnaturalizarse. En 2 lugar, existen la dificultad de eliminar proteolítica o químicamente los residuos de la proteína A de las proteínas de fusión una vez que se han purificado sin alterar la estructura del producto deseado. El problema podría ser resuelto introduciendo genéticamente puntos de corte específicos para determinadas proteasas o bien enlaces lábiles mediante acidos en aquellas zonas de unión entre el residuo que permite el aislamiento y la proteína recombinante de interés.
81 82

unión pH 4-8 (NH4) SO41m, pH7 pH8 +-HCl de guanidino

H. M. Sassenfeld, Trends Biotechnol. 1990, 8, 88. R. F. Sherwood, Trends Biotechnol., 1991, 9, 1. 84 B. Nilsson, E. Holmgren,, S. Josephson, S. Gatenbeck, L. Philipson, and M. Uhlen. Nucleic Acids Res-. 1985, 13, 1151. 85 B. Nilsson, L. Abrahmsen, and M. Uhelem, EMBO J., 1985, 4, 1075.

CONCLUSION

La electroforesis constituye parte importante del procedimiento rutinario del análisis de los ácidos nucleicos y proteínas. Y así como el microscopio permite visualizar microorganismos y estructuras similares, la electroforesis nos ayuda a observar los ácidos nucleicos y proteínas (de los cual se trato este trabajo) al final del procedimiento. El principio básico de la electroforesis consiste en la migración de las moléculas a través de un gel u otro tipo de matriz de naturaleza porosa, en el cual, por acción de un campo eléctrico, serán separadas de acuerdo a su tamaño o peso molecular. Para controlar el avance de la separación de las moléculas en la matriz y establecer un patrón de fragmentos, las moléculas deberán ser teñidas con diferentes colorantes. Estos pasos facilitan la visualización de las moléculas a manera de simples bandas las cuales serán posteriormente analizadas e interpretadas. En biología molecular, la mayoría de los estudios básicos y aplicados requieren el uso de la electroforesis; sin embargo, este procedimiento presenta variaciones de acuerdo al tipo de estudio que se piensa ejecutar. En la electroforesis de tipo vertical, se analizan tanto moléculas de ADN como proteínas, mientras que en la electroforesis horizontal generalmente se trabaja con ADN o ARN. De otro lado, existen otros métodos electroforéticos que presentan ciertas modificaciones, así tenemos la electroforesis en campo pulsado, mayormente usada para separar fragmentos muy grandes de ADN (ADN genómico), la electroforesis bidimensional para un análisis más sofisticado de las proteínas etc. Es importante señalar que la electroforesis en asociación con otras técnicas tales como PCR, e hibridación, brinda una gran ayuda en el campo de la salud. Gracias a esta técnica es posible visualizar las bandas de ARN o ADN de patógenos, detectar cambios o mutaciones a nivel genético, visualizar una nueva proteína, entre otros.

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