UNIDAD DE CIENCIAS BÁSICAS

ASIGNATURA DE BIOQUÍMICA

GUÍA DE PRÁCTICAS

SEGUNDO AÑO

SESION 2. FACTORES QUE AFECTAN LA

ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
 SESION 2. FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD
ENZIMÁTICA

1. INTRODUCCION.

Las enzimas pueden aislarse de las células para estudiar sus propiedades en
un tubo de ensayo (in vitro). Las diferentes enzimas muestran distintas
respuestas a los cambios de sustrato, temperatura, pH, concentración de
enzima, cofactores e inhibidores.

Concentración de sustrato. La velocidad de una reacción es el número de

moléculas de sustrato que se convierten en producto por unidad de tiempo,
esta aumenta con la concentración de sustrato hasta que se alcanza una
velocidad máxima, lo cual refleja la saturación de los sitios de unión de las
enzimas. La mayoría de las enzimas presentan una cinética de Michaelis-
Menten, en la cual la gráfica de la velocidad de reacción con la concentración
de sustrato es hiperbólica.

Temperatura. La velocidad de reacción aumenta con la temperatura hasta que

se alcanza una velocidad máxima, debido a que un mayor número de
moléculas de sustrato tendrá suficiente energía para pasar la barrera
energética. Una mayor elevación de la temperatura causa una disminución en
la velocidad como resultado de la desnaturalización de la enzima.

pH. La concentración de protones afecta la velocidad en diversas formas.

Primero el proceso catalítico requiere que la enzima y el sustrato tengan grupos
químicos específicos ya sea en estado ionizado o no ionizado con el fin de
interactuar. Los pH extremos pueden conducir a la desnaturalización de las
enzimas. Este pH al cual se obtiene la máxima actividad enzimática es
diferente para las distintas enzimas y con frecuencia refleja la concentración de
protones a la cual la enzima funciona en el cuerpo.
2. OBJETIVO.

Determinar el efecto de la concentración de sustrato, pH y temperatura sobre la

velocidad de la reacción.

3. FUNDAMENTO DEL METODO.

Se utiliza como enzima la fosfatasa alcalina y como sustrato un compuesto

artificial: p-nitrofenil-fosfato que, al poseer un resto orgánico con un grupo
fosfato unido, puede ser reconocido por la enzima. El sustrato al ser hidrolizado
origina un producto, el p-nitrofenol, compuesto coloreado que en solución
alcalina absorbe a una longitud de onda de 405 nm, por lo que su aparición en
el transcurso de la reacción puede seguirse colorimétricamente. Para detener
la reacción se añadirá fosfato, ya que el exceso de este producto de la reacción
inhibe la actividad enzimática.

4. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS.

4.1. EQUIPOS.

Espectrofotómetro Baño de agua

Cronometro

4.2. MATERIALES.

Tubos de vidrio 13 x 100 Gradilla

Micropipetas Tips de micropipetas

Recipiente de bioseguridad
4.3. REACTIVOS.

Tampón: Glicina 100 Mm pH 10.4

Sustrato: p-nitrofenil-fosfato 0.3 mM

Enzima: Fosfatasa alcalina de mucosa intestinal bovina

Fosfato: K2HPO4 1 M

5. PROCEDIMIENTOS.

EFECTO DE LA CONCENTRACION DE SUSTRATO.

5.1. En seis tubos de ensayo añadir el volumen de reactivos correspondiente,

según la siguiente tabla:

TUBOS N° 1 2 3 4 5 6

Tampón (ml) 3.0 2.7 2.4 2.0 1.0 0

Sustrato (ml) 0 0.3 0.6 1.0 2.0 3.0
Enzima (ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

5.2. Mezclar por inversión e incubar a 30º C por 10 minutos.

5.3. Retirar los tubos y añadir 0.5 ml de la solución de fosfato, mezclar por
inversión.

5.4. Leer en el espectrofotómetro a 405 nm usando como blanco el tubo 1.

5.5. Con los valores de absorbancia obtenidos representar la gráfica de

Michaelis Menten.
6. RESULTADOS.

Los resultados de absorbancia y concentración de los tubos son:

TUBOS N° 1 2 3 4 5 6

Sustrato (ml) 0 0.1 0.5 1.0 2.0 3.0

Concentración de 0 0.0085 0.0489 0.085 0.171 0.257
sustrato (mM)
Absorbancia 0 0.068 0.328 0.558 0.889 1.124
Concentración 0 0.0038 0.017 0.030 0.048 0.062
producto (mM)
Velocidad 0 0.00038 0.0017 0.003 0.0048 0.006
(mM/min)

Con estos datos se graficará la velocidad contra la concentración de sustrato.

7. BIBLIOGRAFIA.

Denise R. Ferrier. Bioquímica. 7ª ed. Wolters Klumer España. 2018

https://elibro.net/es/lc/bibliotecafmh/titulos/124797?fs_q=bioquimica&prev=fs&fs
_page=2

Universidad de Córdova. Practicas generales de Bioquímica y Biología

Molecular

https://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biol-
mol/pdfs/30%20FOSFATASA%20ALCALINA.pdf
 INFORME DE PRÁCTICA

(EFECTO DE LA TEMPERATURA Y pH)

1. Ingrese al link http://biomodel.uah.es/lab/abs/activ_enz.htm

2. Empieza con una temperatura constante y varié el pH, de esta manera
encontrará el pH óptimo de la enzima, el cual será donde resulté la
mayor absorbancia
3. Presione los botones sustrato añadir y luego muestra añadir, aparecerá
un reloj indicando que se está incubando la reacción.
4. Luego presione el botón añadir DNS y aparecerá la cubeta de color
amarillo, presione el botón tomar medida y aparecerá la absorbancia de
la reacción, anote los datos de pH, temperatura y absorbancia en la
tabla que aparece a la derecha.
5. Luego con este pH optimo encontrado varié las temperaturas para
encontrar la óptima.
6. Realice en Excel dos graficas: pH vs absorbancia y temperatura vs
absorbancia.
 CUESTIONARIO

1. De acuerdo con la gráfica ¿Cuál es el pH óptimo de la enzima utilizada en el

experimento?

a) 6.0 b) 7.0

c) 8.0 d) 9.0

2. De acuerdo con la gráfica ¿Cuál es la temperatura optima de la enzima

utilizada en el experimento?

a) 70 oC b) 50 oC

c) 80 oC d) 60 oC

3. Del ejemplo del experimento: efecto de la concentración de sustrato,

utilizando la gráfica de Lineweaker-Burk determine la constante de Michaelis
(Km) y la velocidad máxima (Vmax) de la enzima fosfatasa alcalina.

a) 0.02 y 0.01 b) 2 y 1

c) 0.002 y 0.001 d) 0.2 y 0.1