CÁTEDRA DE QUÍMICA BIOLÓGICA—FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES—UNSa

LABORATORIO 5:
CINÉTICA ENZIMÁTICA Parte II: ESTUDIO CINÉTICO DE LA FRUCTOSIDASA SOBRE LA
SACAROSA
OBJETIVOS
– Determinar la concentración óptima de fructosidasa.
– Determinar la velocidad inicial del progreso de la reacción enzimática.

INTRODUCCIÓN
Las enzimas son caracterizadas por sus propiedades cinéticas. La cinética enzimática estudia
la velocidad de las reacciones catalizadas enzimáticamente, definiendo principalmente dos
parámetros:

1. Velocidad: el conocimiento de la velocidad nos permite conocer el mecanismo de las

reacciones enzimáticas y así comprender las rutas metabólicas. La velocidad o catálisis
enzimática mide su concentración.
2. Km: representa una constante útil que relaciona la velocidad de una reacción enzimática
con la concentración de sustrato, por ejemplo, los valores de Km de muchas enzimas son
próximos a los de la concentración fisiológica de sus sustratos.
- Km es constante para una enzima dada, al conocer el Km se puede determinar si una enzima es
idéntica a otra, o si son diferentes proteínas que catalizan una misma reacción (isoenzimas). Si
las Km en diferentes tejidos son iguales, significa que la enzima que cataliza dicha reacción es la
misma. Si son Km distintos, la misma reacción es catalizada por diferentes enzimas.
– Si conocemos Km podemos ajustar las condiciones de ensayo de forma que la concentración de
sustrato sea mucho mayor que Km y con eso optimizar la actividad de la enzima.
– Km indica la afinidad de la enzima por un sustrato, el sustrato con el menor valor de Km es el
que tiene más afinidad por la enzima.
En la práctica para estudiar una reacción catalítica se puede medir el aumento de
concentración de producto formado o la disminución de reactivos, en función del tiempo.
Al medir el incremento de la concentración de productos en función del tiempo, obtenemos,
la curva de avance de la reacción, las que en las reacciones enzimáticas tienen la forma indicada
en la Figura 1.

Fig. 1. Curva de avance de una reacción enzimática mono-sustrato. [S], concentración de

sustrato; [P], concentración de producto.
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Velocidad inicial
Durante la etapa inicial de la reacción, cuando sólo una pequeña cantidad de sustrato se ha
convertido en producto, la curva es lineal. La pendiente a tiempo cero, es la V inicial (V 0). Se
observa que a medida que transcurre la reacción, el producto se acumula (P), el sustrato
disminuye (S), y la velocidad comienza a disminuir. Esto es debido a que:
− Disminuye la concentración de sustratos que al consumirse deja de ser saturante.
− Se acumulan productos tendientes a establecer el equilibrio de la reacción.
− Los productos pueden inhibir la enzima como un tipo de inhibición competitiva.
− La enzima o coenzima participante puede sufrir alguna inactivación a la temperatura o pH de la
reacción debido a su inestabilidad.
Por todo esto en el estudio de la acción enzimática se adopta la medida de la velocidad inicial
donde estos factores no han tenido tiempo de actuar. Esto permite determinar qué efecto
produce sobre la velocidad inicial la variación de un solo factor, manteniendo el resto constante.
Para determinar la velocidad inicial, hay que efectuar la medición haciendo el análisis en
tiempos tan pequeños en que no exista una acumulación de productos.

La velocidad de una reacción enzimática es función de la concentración de sustratos

Si mantenemos constante la concentración de Enzima, podemos determinar el efecto
de la concentración de sustrato sobre la Velocidad inicial. A concentraciones de sustratos muy
pequeñas, la velocidad de reacción es directamente proporcional a la concentración de sustrato,
y por lo tanto se aproxima a una reacción de primer orden. A concentraciones de sustrato altas,
todos los centros catalíticos de la enzima están ocupados por el sustrato y por lo tanto la
velocidad de reacción es independiente de la concentración de sustrato. En este punto, un
aumento de la concentración de sustrato no puede aumentar la velocidad y por eso la velocidad
es máxima y la reacción es de orden 0. La ecuación de Michaelis-Menten explica las curva
hiperbólica que se obtienen cuando la velocidad es función de la concentración de sustrato
(Figura 2, A).
Como la curva de velocidad inicial (V) en función de concentración de sustrato [S] es una
hipérbola, se hace difícil determinar la velocidad máxima (Vmax) y la constante de Michaelis-
Menten (Km) a partir de la gráfica directa pues involucra medir un valor asintótico de Vmax, en
general prácticamente imposible. Reestructurando la ecuación de Michaelis-Menten se logra
transformarla en una ecuación lineal que tiene la forma: y = a x + b. El método más utilizado es
el de los dobles recíprocos de Lineweaver-Burk en el que se representan las inversas de las
velocidades en función de las inversas de las concentraciones de sustrato (Figura 2, B).
A

B
Fig. 2. A, Ecuación de Michaelis-Menten y representación gráfica; B, Dobles recíprocos de la ecuación de
Michaelis-Menten y representación gráfica.
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TRABAJO DE LABORATORIO
En este trabajo práctico se determinará, en primer lugar, la concentración óptima de
enzima fructosidasa mediante un ensayo indirecto en el que la glucosa será detectada
espectrofotométricamente tras su conversión en derivados coloreados. A continuación, se
realizará una experiencia para determinar el tiempo en el cual resulta óptimo determinar la
velocidad inicial, es decir el tiempo de reacción en el cual no hay acumulación significativa de
productos y la concentración de sustrato es aún saturante. Recordemos que la enzima, extraída
y diluida en el práctico anterior, hidroliza la sacarosa dando como productos glucosa y fructosa
y que esta última isomeriza completamente a glucosa en medio alcalino.
Recordemos también que se medirá el aumento de la concentración de producto
(glucosa) en función del tiempo por el método de determinación de azúcares reductores* de
Somogyi- Nelson.

Fundamento de Somogyi-Nelson: En medio alcalino y en caliente, el reactivo cúprico (Cu ++) de

Somogyi es reducido a Cu2O (cuproso: Cu+) por la acción de azúcares reductores (glucosa). El
Cu2O liberado actúa sobre el reactivo arsenomolíbdico de Nelson formando un complejo
coloreado en el que el molibdeno se reduce. El complejo se lee espectrofotométricamente a 520
nm.

*Los azucares con el grupo aldehído libre son reductores. Los productos de la hidrólisis de la
sacarosa son isómeros: glucosa y fructosa. En medio alcalino la fructosa se isomeriza a glucosa
a través del enediol intermediario que es la forma reactiva de los azucares reductores.

Materiales
1) Instrumental de uso común:
– Balanza, centrífuga, baño termostático, baño de agua hirviendo, espectrofotómetro.
2) Elementos de uso por grupo:
– Reactivos de Somogyi-Nelson (ver TP anterior)
– Solución Buffer acetato 0,1 N pH 4,8.
– Solución de sacarosa 0,2 M.
– Diluciones enzimáticas.
– Gradilla, tubos, baño de hielo.
– Curva de calibración de glucosa (construida en TP anterior)
Procedimiento
Se realizarán 2 determinaciones:
1. Elección de la concentración óptima de enzima
Para elegir la concentración óptima que permita determinar los parámetros cinéticos en
laboratorio, se incuba las diluciones sucesivas de la enzima fructosidasa con su sustrato
específico sacarosa en iguales concentraciones en todos los tubos. La incubación se realiza un
tiempo fijo de 10 min.
Luego realice la experiencia siguiente:
IMPORTANTE! Trabajar en baño de hielo
Incubar [S] + [E] Determinar [P] por método de Somogyi-Nelson
Tubo Sacarosa Dilución enzimática Buffer Incubar Rvo. Hervir Rvo. H2O Abs Glucosa
0.2M acetato Somogyi 10 Nelson dest µmoles
Bco 0.2 --- 0.5 mL 10 min 1 mL min 1 mL 2 mL
1 mL 0.1 mL dilución 1/80 0.4 mL a Baño
2 0.1 mL dilución 1/160 María
3 0.1 mL dilución 1/320 37°C y
4 0.1 mL dilución 1/640 enfriar
5 0.1 mL dilución 1/1280
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Todos los tubos deben mantenerse en un baño de hielo hasta el momento de llevarlos al
baño a 37°C. Exactamente a los 10 min de incubación detener la reacción pasando los tubos al
hielo y agregando a cada tubo 1 mL de Somogyi. Luego continuar con el método de Somogyi-
Nelson para determinar la cantidad de azúcares reductores. Leer en espectrofotómetro a 520
nm. Finalmente calcular el producto formado (µmoles glucosa) por minuto de incubación,
utilizando la curva de calibración de la glucosa.
1. Graficar concentración de producto formado µmoles de glucosa/min en función de dilución de
enzima.
2. Establecer cuál es la concentración óptima de enzima para poder trabajar en un rango medible
y calcular los parámetros cinéticos en el próximo trabajo práctico.

Determinación de la velocidad inicial:

Se prepararán los siguientes tubos, manteniendo siempre en hielo hasta llevarlos a un baño
de 37 ºC. La concentración de enzima utilizada será la que cada grupo determinó como óptima
en el trabajo práctico anterior.

Incubar [S] + [E] Determinar [P] por método de Somogyi-Nelson

Tubo Sacarosa Buffer Enzima Tiemp Rvo. Rvo. H 2O Abs Por curva
0.2M Acetato mL o Somogyi Nelson dest calibración
mL mL min Hervir Enfriar [Glucosa]
10 en moles
Bco 0.2 0.5 — Incb. 0 1 mL min baño 1 mL 2 mL
1 0.4 0.1 a 5 Baño de
2 0.1 37°C 10 María hielo
3 0.1 15
4 0.1 20

a) Graficar la curva de avance de la reacción enzimática (concentración de producto formado —

µmoles de glucosa—en función del tiempo de incubación).
b) Deducir cual es el tiempo óptimo de incubación para medir la velocidad inicial.

BIBLIOGRAFÍA

– BERG J.M., TYMOCZKO J.L., STRYER L. 2008. Bioquímica. Sexta edición. Editorial Reverté
– TORRES, H., H. CARMINATTI y C. CARDINI. 1983. Bioquímica Gral. Ed. El Ateneo. Buenos Aires.
– RAWN. 1991. Bioquímica - Problemas - Ed. Interamericana McGraw-Hill. España.
– SUMMER, J. y SOMMERS, F. G. 1943. Chemistry and Methods of Enzymes. Academic Press,
Inc., Publishers, New York, N.Y.