Universidad Nacional Mayor de San Marcos

Universidad del Perú, Decana de América

Facultad de Química e Ingeniería Química
Escuela Académico Profesional de Ingeniería Química

Informe de laboratorio Nº4

Estudio de las propiedades cinéticas de la enzima

Asignatura
Bioquímica

Profesor
Woolcott Hurtado Juan Carlos

Integrantes
Sánchez Huacachi Johant Manuel - 19070129
Pachas Quispe Leonardo Victor - 19070126
Saigua Guisado Ricardo Gonzalo - 19070042
Rojas Ancieta Yefef Edu - 19070039

Horario
Martes, 18 -22 h

Sección 1

Lima, 20 de noviembre del 2021

 ÍNDICE

Introducción............................................................................................................................. 3
Fundamento teórico................................................................................................................... 4
Detalles experimentales............................................................................................................. 8
Discusión de resultados............................................................................................................10
Conclusiones.......................................................................................................................... 10
Bibliografía............................................................................................................................ 11
Anexo.................................................................................................................................... 12
 Informe de laboratorio Nº 4
Estudio de las propiedades cinéticas de las enzimas

1. Introducción

Se sabe que las enzimas son catalizadores biológicos donde la mayoría de estas son de
naturaleza proteica. Las enzimas se unen a un determinado sustrato para formar un complejo
enzima-sustrato, donde seguidamente se descompone para dar la enzima libre y un producto.
La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Estos
estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y de
la especificidad de la enzima. La mayoría de las reacciones son transcurridas de manera lenta
si no son catalizadas, por esa razón las enzimas cumplen un papel fundamental en estas
reacciones, ya que catalizan mediante la estabilización del estado de transición, disminuyendo
así la energía de activación y por consiguiente la velocidad de reacción aumenta. Cabe
recalcar que la velocidad de una reacción catalizada por una enzima es la cantidad de sustrato
consumido o la cantidad de producto generado en un intervalo de tiempo en una mezcla de
reacción que incluya la enzima y los constituyentes necesarios para que la reacción proceda.
La velocidad de una reacción catalizada por un enzima puede medirse con relativa facilidad,
ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar la enzima. La medida se realiza
siempre en las condiciones óptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc y se
utilizan concentraciones saturantes de sustrato. Por otro lado, también existen factores que
alteran a la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas como la temperatura, el pH, la
concentración del sustrato y la concentración de la enzima; donde estas influyen modificando
el funcionamiento de las enzimas En estas condiciones, la velocidad de reacción observada es
la velocidad máxima (Vmax). La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparición de
los productos o la desaparición de los reactivos. En este sentido, el objetivo de la práctica es
estudiar la dependencia de la velocidad de reacción catalizadas por las enzimas y de las
condiciones de sus interacciones.
 2. Fundamento teórico

Cinética enzimática
Es un campo de estudio de la bioquímica que se encarga de estudiar las reacciones químicas
catalizadas por las enzimas. Estos catalizadores biológicos incrementan la velocidad de una
reacción química mediante la disminución de su energía de activación. En la cinética
enzimática, las dos propiedades de mayor importancia son el tiempo que tarda una enzima en
llegar a su punto de saturación y la velocidad máxima que puede alcanzar la reacción
catalizada por dicha enzima. La velocidad de una reacción enzimática puede ser medida en el
laboratorio. Como la enzima no se consume en el proceso de catálisis de la reacción, se suele
medir la disminución de la concentración de sustrato en el tiempo o el aumento de la
concentración del producto. Al seguir la velocidad de aparición de producto (o de
desaparición del sustrato) en función del tiempo se obtiene la llamada curva de avance de la
reacción, o simplemente, la cinética de la reacción. A medida que la reacción transcurre, la
velocidad de acumulación del producto va disminuyendo porque se va consumiendo el
sustrato de la reacción. Para evitar esta complicación se procede a medir la velocidad inicial
de reacción (v0). La velocidad inicial de la reacción es igual a la pendiente de la curva de
avance a tiempo cero. De esta forma, la medida de v0, se realiza antes de que se consuma el
10% del total de sustrato, de forma que pueda considerarse la [S] como esencialmente
constante a lo largo del experimento. Además, en estas condiciones no es necesario
considerar la reacción inversa, ya que la cantidad de producto formada es tan pequeña que la
reacción inversa apenas ocurre. De esta forma se simplifican enormemente las ecuaciones de
velocidad.

Para el estudio de la cinética enzimática se mide el efecto de la concentración inicial de

sustrato sobre la velocidad inicial de la reacción, manteniendo la cantidad de enzima
constante. Si se representa V0 frente a [S0] obtenemos una gráfica como la de la figura 1.
Cuando [S0] es pequeña la velocidad inicial es directamente proporcional a la concentración
de sustrato, y por tanto, la reacción es de primer orden. A altas [S0], la enzima se encuentra
saturada por el sustrato y la velocidad ya no depende de [S0]. En este punto, la reacción es de
orden cero y la velocidad es máxima (Vmax).

Cinética enzimática de Michaelis-Menten

Este modelo está basado en la acción de enzimas que actúan sobre un sustrato simple y no es
aplicable a las enzimas alostéricas; es decir, aquellas que tienen una región reguladora de la
actividad catalítica del sitio activo. Se denomina sustrato a la molécula sobre la que actúa la
enzima, donde ésta se une al sitio activo de la enzima, formando el complejo enzima-sustrato.
En este complejo el sustrato se transforma en producto, momento en el cual se libera de la
enzima. Existen muchos modelos para explicar la catálisis enzimática como el modelo de
Michaelis-Menten que tiene como ecuación:
 Fig.2: Ecuación de modelo de Michaelis - Menten

Donde [E] representa a la enzima, [S] al sustrato, [ES] al complejo - sustrato, [P] el producto
final y k1, k2 y k3 las constantes cinéticas de la reacción

El modelo de Michaelis-Menten se basa en la hipótesis básica de que la enzima y el sustrato

forman un complejo intermediario ES. Además:

[ E0 ]=[ E]+[ES]=cte

El proceso ES ------ P -E es irreversible (concentración de productos pequeña). Posee una

hipótesis cuasi estacionaria y establece lo siguiente: Después de una fase inicial transitoria, la
concentración de las distintas formas enzimáticas (E, ES) no varía.

Modelo matemático

E+ S ↔ ES↔ P+ E

V =V max S / K +s ❑

Factores que afectan la actividad enzimática

1. Temperatura: La velocidad de las reacciones enzimáticas aumenta con la

temperatura, dentro del intervalo en que la enzima es estable y activa. Por lo general,
la velocidad se duplica por cada 10 °C de aumento térmico. La actividad enzimática
máxima se alcanza cuando la temperatura es óptima, luego decrece y finalmente cese
por completo debido a la desnaturalización progresiva de la enzima por acción de la
temperatura.

Fig. 3: Representación gráfica de la Vrx vs temperatura (ºC)

2. pH: Los cambios de la concentración de iones hidrógeno (pH) influyen
considerablemente en la actividad de las enzimas. Debido a que estos iones poseen
carga, generan fuerzas de atracción y repulsión entre los enlaces de hidrógeno e iónico
de las enzimas. Esta interferencia produce cambios en la forma de las enzimas,
afectando así su actividad.

Fig. 4: Representación gráfica de la Vrx vs pH

3. Concentración del sustrato: Al aumentar la concentración del sustrato se incrementa

la velocidad de reacción. Esto se debe a que más moléculas de sustrato colisionan con
las moléculas de enzima, por lo que el producto se formará más rápido. Sin embargo,
al superar cierta concentración de sustrato no habrá ningún efecto sobre la velocidad
de reacción, pues las enzimas estarían saturadas y funcionando a su máxima
velocidad.

Fig. 5: Representación gráfica de la Vrx vs la concentración del sustrato

Factores que afectan la actividad enzimática

1. Modelo de llave - cerradura: Fue el primer modelo para explicar la interacción

enzima-sustrato propuesto por el químico Emil Fisher, donde la estructura del sustrato
y la del sitio activo son exactamente complementarias, de la misma forma que una
llave encaja en una cerradura

Fig. 6: Modelo enzimático de llave - cerradura

2. Modelo de ajuste inducido: Estudios posteriores sugirieron que el sitio activo es

mucho más flexible que una cerradura. La interacción física entre las moléculas de
enzima y sustrato produce cambio en la geometría del sitio activo, mediante la
distorsión de las superficies moleculares. Este modelo llamado encaje inducido
impondría cierta tensión a las moléculas reaccionantes, facilitando aún más la
reacción.

Fig. 7: Modelo enzimático de ajuste inducido

3. Detalles experimentales

Cinética de reacciones enzimáticas de α-amilasa de la saliva

Instrumentos:

- Termómetro de laboratorio
- gradillas con tubos de ensayo
- pipetas de 1 y 5 ml
- baño de agua, bureta de 25 ml
- vasos de precipitados.

Reactivos:

- Almidón
- Solución al 1% preparada
- Solución de yodo en yoduro de potasio (Lugol)
- Buffer fosfato-citrato 0,1 M con pH 5,6; 6,4; 7,2 y 8,0.

Material:

- Saliva diluida

a) Dependencia de la velocidad de reacción de la cantidad del enzima

Este experimento está basado en la determinación de la velocidad de hidrólisis del

almidón, revelada por la prueba de yodo dependiendo de la cantidad de α-amilasa
de la saliva.

Procedimiento:

Se tomó 4 tubos de ensayo para colocar a cada uno de ellos 1 ml de las diluciones
de saliva obtenidas. Seguidamente, se les agregó 4 ml de solución de almidón y
rápidamente se colocó en baño de agua a 38 °C controlando el tiempo de inicio.
Después de 1 o 2 minutos se tomó 2 gotas de líquido de cada muestra y se les
agregó 1 gota de solución de yodo en yoduro de potasio, donde al principio las
muestras dieron una coloración azul, luego rojo-violeta y por último roja.

Tabla 1. Concentraciones del sustrato y tiempos de reacción de la actividad

catalítica de la αamilasa de la saliva
 Fig 8. Gráfica de la velocidad de reacción en función de la cantidad del enzima

b) Dependencia de la velocidad de reacción enzimática de la temperatura

Este experimento está basado en la determinación de la velocidad de hidrólisis del

almidón por la acción de la α-amilasa de la saliva, en dependencia de la
temperatura.

Procedimiento:

Se colocó en un tubo 5 gotas de saliva para seguidamente hervir 2 minutos en el

baño de agua y luego enfriar. En otros dos tubos se colocó 5 gotas de saliva no
hervida. Luego, a todas las muestras se les agregó 10 gotas de solución de almidón
y se colocó el primer y segundo tubo en baño de agua a 38 °C. el tercero en agua
con hielo por 3 minutos. Finalmente, se le añadió ,a cada tubo, una gota de solución
de yodo en yoduro de potasio y se comparó el color.

c) Dependencia de la velocidad de reacción enzimática del pH del medio

Este experimento está basado en la comparación de la velocidad de la hidrólisis del

almidón, establecida con la muestra de yodo, por la acción de la α-amilasa de la
saliva en diferentes pH del medio.
 Procedimiento:

En 5 tubos de ensayo, se midió 10 gotas de las soluciones de buffer-citrato con los

valores de pH: 5,6; 6,4; 6,8; 7,2 y 8,0. seguidamente, se agregó a todas las muestras
5 gotas de saliva diluida 10 veces y 10 gotas de solución de almidón para luego
colocarlos en baño de agua a 38 °C. Después de 1-2 minutos se tomó 1 gota del
contenido en otros tubos de ensayo y se añadió 1 gota de yodo en yoduro de potasio.
apareció una coloración roja en una de las cinco muestras, esta etapa es la formación
de eritrodextrinas.

4. Discusión de resultados

Para comprobar que a mayor concentración de enzima hay mayor velocidad de

reacción, se utilizaron 4 tubos de ensayos en los cuales se introdujeron
concentraciones diferentes de enzimas, luego se agregó solución de almidón y se
colocó en un baño de agua a 38 °C dejando que la enzima actuara sobre el almidón,
luego se agregó gotas de Lugol a cada tubo para formar el complejo coloreado y
comparar la tonalidad que tomó cada tubo pasando de color azul a rojo indicando la
formación de las eritrodextrinas del almidón. Por otro lado, también se comprobó que
a mayor temperatura hay mayor velocidad de reacción, siendo la temperatura óptima
los 38 °C. pasado esa temperatura la velocidad de reacción va disminuyendo ya que la
enzima αamilasa de la saliva se desnaturaliza haciendo que no funcione de manera
óptima. Finalmente, se determinó el pH óptimo en la que la enzima pueda actuar, para
eso hubo 5 tubos de ensayo con diferentes pH, donde el pH óptimo de acción de la α-
amilasa de la saliva fue de 6,8 donde el almidón se hidroliza hasta la etapa de
eritrodextrinas, que es el resultado de una coloración roja.

5. Conclusiones

Se concluye que las enzimas son biomoléculas sensibles a cambios de temperatura y pH

así afectando su capacidad metabólica. Por otro lado, la enzima α-amilasa de la saliva
tiene un pH óptimo de 7,2 y una temperatura óptima de 38 °C, a estas condiciones la
enzima presenta mayor actividad catabólica. A altas temperaturas son capaces de
desnaturalizar y cambiar la conformación estructural de las proteínas causando que cese
su actividad, las bajas temperaturas tienen efectos sobre la entropía causando que las
colisiones enzima sustrato disminuyan.
6. Bibliografía

- Enzimas. Cinética enzimática. (s/f). Ehu.eus. Recuperado el 20 de noviembre

de 2021, de http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz3.htm

- Modelo de Briggs � Haldane. (s/f). Tripod.com. Recuperado el 20 de

noviembre de 2021, de https://biorreactores.tripod.com/C2MBH.htm

- (S/f). Unican.es. Recuperado el 20 de noviembre de 2021, de

https://ocw.unican.es/pluginfile.php/879/course/section/967/Tema%25202B-
Bloque%2520I-Enzimas.pdf

- Enzima alostérica. (s/f). Cun.es. Recuperado el 20 de noviembre de 2021, de

https://www.cun.es/diccionario-medico/terminos/enzima-alosterica

- Gonzales, M. Cinética enzimática. 2010. [Consultado 20 noviembre 2021].

Disponible en: https://quimica.laguia2000.com/conceptos-basicos/cinetica-
enzimatica

- Bolivar, G. Cinética enzimática. Sevilla, España. Lifeder. 2020. [Consultado

20 noviembre 2021]. Disponible en: https://www.lifeder.com/cinetica-
enzimatica/

- Fernandez, G. Cinética enzimática de Michaelis-Menten. Oviedo, España.

2012. [Consultado 20 noviembre 2021]. Disponible en:
http://www.quimicafisica.com/cinetica-enzimaticamichaelis-menten.html

- Briceño, K. Factores que afectan la actividad enzimática. Sevilla, España.

2020. [Consultado 20 noviembre 2021]. Disponible en:
https://www.lifeder.com/factores-actividadenzimatica/

- Biología. Modelos de acción enzimática. 2014. [Consultado 20 noviembre

2021]. Disponible en: https://www.blogdebiologia.com/modelos-de-accion-
enzimatica.html

- Instituto CBQ. Inhibición enzimática. Montevideo, Uruguay. 2018.

[Consultado 20 noviembre 2021]. Disponible en:
https://clasesparticularescbq.com/2018/09/06/inhibicion-enzimatica/
Anexo

a) ¿Qué entiende usted por cinética enzimática? ¿Ejemplos?

La cinética enzimática se encarga de examinar la velocidad de las reacciones

químicas en la que intervienen enzimas para catalizarlas. Por ejemplo, la
catálisis de la ruptura de los enlaces peptídicos por la enzima elastasa, la cual
degrada fibras elásticas que se encuentran en los alvéolos, presentes en
algunos hongos y bacterias.

b) ¿Qué establece el modelo de Briggs y Haldanen y el modelo de Michaelis-

Menten?

El modelo de Michaelis-Menten establece que solo es válido cuando la

concentración del sustrato [S] es mayor que la concentración de la enzima [E]
y para condiciones de estado estacionario; es decir, cuando la concentración
del complejo enzima-sustrato [ES] es constante. En este modelo se forma
reversiblemente un complejo entre [S] y [E] llamada [ES], seguido de una
degradación virtualmente irreversible en este complejo para dar un producto
[P] y generar el enzima libre [E]. Mientras que el modelo de Briggs y Haldane
es de mayor amplitud que el de Michaelis-Menten, ya que supusieron un
tiempo inicial lo suficientemente corto como para que no se forme el
complejo[ES] a partir de [E] y de [P], por ser la concentración de este último
muy pequeña, y lo suficientemente largo como para que la [ES] fuera
constante (Condición de estado estacionario)

c) ¿Cuál es el significado de Vm y Km?

Vm y Km son la velocidad máxima y la constante de Michaelis-Menten

respectivamente. Km mide la afinidad de la enzima por el sustrato, representa
una concentración de sustrato con la que se alcanza la mitad de la velocidad
máxima. Por otro lado, la Vm es la máxima velocidad de aparición del
producto de la reacción ( [S] → [P] )

d) ¿Cuáles son los factores que afectan la actividad enzimática?

La actividad enzimática es afectada principalmente por factores como la

temperatura, pH y concentración de sustrato. Pero hay otros factores que
también afectan a la actividad enzimática como la salinidad, concentración de
las enzimas, activadores enzimáticos, inhibidores enzimáticos, etc.
e) ¿Qué es una enzima alostérica, características e importancia de ellas en la
regulación de los sistemas biológicos?

Las enzimas alostéricas tienen diferentes sitios activos. Son un tipo de enzimas
que tienen la capacidad de cambiar de conformación al unirse un efector o un
modulador alostérico, que muchas veces corresponde al producto final de una
vía metabólica en la que la enzima está implicada.