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PRACTICA N°5 EFECTO DE LA CONCENTRACION DEL SUSTRATO : CALCULO DEL KM.

I.-INTRODUCCION.
Los conocimientos que tenemos sobre el efecto de la concentración inicial del sustrato sobre
la actividad enzimática comenzaron a realizarse a finales del siglo XIX. Ya en 1882 se
introdujo el concepto del complejo enzima-sustrato como intermediario del proceso de
catálisis enzimática. En 1913, Leonor Michaels y Maud Menten, desarrollaron esta teoría y
propusieron una ecuación de velocidad que explica el comportamiento cinético de los
enzimas.
Michaels determinó la denominada constante de Michaels (Km) que establece la afinidad
entre una enzima y su sustrato. Predijo y explicó la velocidad de reacción, es decir la cantidad
de sustrato que reacciona con la enzima por unidad de tiempo, así como los factores que
estimulan o inhiben dicha velocidad de reacción. Demostró que las sucesivas adiciones de
sustrato al medio de la reacción provocan un abrupto incremento de la velocidad de reacción
hasta un cierto punto en el que la enzima se satura y la adición posterior de sustrato ya no
afecta a la velocidad; es el momento en el que se alcanza la velocidad máxima de reacción
(Max).

II.- MARCO TEORICO.


La velocidad de una reacción enzimática depende de la concentración de sustrato. La Figura
de abajo muestra la velocidad de una reacción enzimática a 6 concentraciones distintas de
sustrato.
Concentración de sustrato desempeña un papel importante en diversas enzimas. Esto es
obviamente debido a una mayor concentración de sustrato significa un mayor número de
moléculas de sustrato están involucrados con la actividad de la enzima. Considerando que,
con una baja concentración de sustrato significa menor número de moléculas estará asociado
a las enzimas. Esto a su vez reduce la actividad de la enzima. Cuando la velocidad de una
reacción enzimática es máxima y la enzima se encuentra en su estado más activo, un aumento
en la concentración de sustrato no hará ninguna diferencia en la actividad de la enzima. En
esta condición, el sustrato es continuamente sustituidos por unos nuevos en el sitio activo de
la enzima y no hay alcance para añadir esas moléculas adicionales allí
III.- OBJETIVOS.
 Estudiar la influencia de la concentración del sustrato sobre la velocidad de una
reacción enzimática.
 Contrastar los efectos de una concentración creciente de sustrato sobre la cinética de
inhibición competitiva y no competitiva simple.
 Definir las condiciones de tasa iniciales y explicar la ventaja que se obtiene por medir
la velocidad de una reacción catalizada por enzima en estas condiciones.

III.- MATERIALES Y METODOS.


MATERIALES
 FENOL
 4 AMINOFENAZONA
 AGUA DESTILADA
 GLUCOSA OXIDASA
 PEROXIDASA
 GLUCOSA
 PIPETAS
 PROPIPETA
 ESPECTOFOTOMETRO
 TUBOS DE ENSAYO

METODOS
a) Para la primera muestra a un tubo de ensayo se le agregó con una pipeta, 1 ml de Reactivo
de Trabajo para luego añadirle 10 ul de Glucosa con la ayuda de una micropipeta, se
incubó a 37°C por 10 minutos. Después del tiempo estimado se llevó al
Espectrofotómetro para observar su absorbancia.

b) Para la segunda muestra a un tubo de ensayo se le agregó con una pipeta, 1 ml de


Reactivo de Trabajo para luego añadirle 20 ul de Glucosa con la ayuda de una micro
pipeta, se incubó a 37°C por 10 minutos. Después del tiempo estimado se llevó al
Espectrofotómetro para observar su absorbancia.

c) Para la tercera muestra a un tubo de ensayo se le agregó con una pipeta, 1 ml de Reactivo
de Trabajo para luego añadirle 30 ul de Glucosa con la ayuda de una micropipeta, se
incubó a 37°C por 10 minutos. Después del tiempo estimado se llevó al
Espectrofotómetro para observar su absorbancia.

d) Para la cuarta muestra a un tubo de ensayo se le agregó con una pipeta, 1 ml de Reactivo
de Trabajo para luego añadirle 40 ul de Glucosa con la ayuda de una micropipeta, se
incubó a 37°C por 10 minutos. Después del tiempo estimado se llevó al
Espectrofotómetro para observar su absorbancia.

El filtro fue de 505 nm para la lectura del fotocolorímetro. Para el cálculo de la concentración
de la glucosa se realizó con la siguiente ecuación:

[𝐺] = 𝐹 ×𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎

Donde “F” equivale 200mg/dl.


Al Obtener los resultados se colocaron en un gráfico para obtener el Km por medio de la
siguiente ecuación:
𝐾𝑚 = 𝑉𝑚𝑎𝑥 2
IV.- RESULTADOS.

Tubo 1 2 3 4
Reactivo de trabajo 1 1 1 1
(ml)
Glucosa (ml) 10 20 30 40
Incubar a 37° 10 10 10 10
Absorbancia 0,024 0,0033 0,036 0,082
Glucosa 9 12,375 28,5 31,875

Longitud de onda 505 mm


(glucosa)= F x Abs. Tubo problema
F= 375 ml
V.-DISCUSIÓN.
Según el autor Mathews (1992) nos expresa que el valor de un Km de una enzima para un
sustrato específico es la concentración del sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la
mitad de la velocidad máxima y que la Vmax es la velocidad teórica máxima de la reacción
es catalizada por la enzima. A concentraciones muy altas de sustrato el valor de la velocidad
se aproxima al de la velocidad máxima de la reacción, pero nunca se llega a ésta. Según Los
valores de Km y Vmax son característicos de una enzima, y se conocen como parámetros
cinéticos de la enzima. Aunque son constantes, dependen de las condiciones en las que se
lleva a cabo la reacción, ya que hay que recordar que la enzima es una proteína cuya
estructura y carga eléctrica se modifican cuando los componentes de la solución cambian.
Según lo Observado y determinado en la práctica, un sustrato va a ser una molécula sobre la
cual va actuar una enzima. Mediante crezca la concentración de sustrato, la velocidad de la
reacción aumentará debido al aumento de la probabilidad de formación de complejos enzima-
sustrato. El km es la afinidad que tiene el enzima por su sustrato, cuanto mayor es Km menor
es la afinidad ( donde predominan las formas Enzima y Sustrato libres), cuanto menor es Km
mayor es la afinidad (predomina la forma Enzima - Sustrato). En cuanto a la velocidad
máxima (Vmáx) se va a estimar el número de centros activos del enzima es decir al aumentar
la concentración de sustrato, la actividad enzimática aumenta, hasta alcanzar la velocidad
máxima, punto donde la enzima se satura, debido a que las enzimas tienen todos sus sitios
activos ocupados
Según UNAM (2015) La velocidad inicial de una reacción es la velocidad medida antes de
que se haya formado suficiente producto para permitir que la reacción inversa ocurra.
Además, la velocidad inicial de una reacción enzimática es siempre proporcional a la
concentración de la enzima a cualquier concentración de sustrato. La velocidad de
transformación de los sustratos de una reacción en los correspondientes productos, mediante
una enzima y bajo condiciones de estado estacionario, es dependiente tanto de las
concentraciones de la enzima como de los sustratos. Normalmente esa dependencia puede
ser expresada matemáticamente por la ecuación de Michaelis-Menten.
En esta práctica se observó, mediante una gráfica trazada con los datos obtenidos, que la
actividad catalítica de una enzima se determina midiendo la velocidad inicial de la reacción,
debido a que la velocidad de una reacción catalizada enzimáticamente es proporcional a la
cantidad de enzima. Luego la reacción transcurre linealmente y deja de ser lineal (curva) por
lo tanto a concentración de sustrato llega a su equilibrio.
VI.-CONCLUSIONES.
Al momento de incubar la muestra de Reactivo de Trabajo con Glucosa pudimos observar
unos minutos después una reacción que fue el cambio de color, de un rosado pálido a otro un
poco más intenso.
Gracias al análisis de la muestra y la formula dada pudimos encontrar la concentración de la
glucosa, la cual nos sirve para poder realizar la curva de calibración.
Al término de la práctica se observó que los diferentes parámetros utilizados en cada uno de
los análisis influyeron de gran forma en la actividad enzimática, por lo tanto, el objetivo fue
cumplido.
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Granados, J. (2014). Cinética Enzimática. Colombia: Universidad Nacional Abierta y a


Distancia.
Koolman, J., & Rohm, K. (2003). Bioquimica: Texto y Atlas. Madrid: Editorial Medica
Panamericana.
López , J., & García, F. (2015). Los Cuatro Mosqueteros de la Cinética Enzimática.
Eubacteria, 40.
Mathews, C. (1992). Bioquimica. McGraw-Hill.
Rodwell, V., Bender, D., Botham, K., Kennelly, P., & Weil, P. (2016). Bioquimica Ilustrada.
Mexico: McGraawHill.
UNAM. (2015). Efecto de la Concentración de una Enzima