PCR

Reacción en cadena de la polimerasa:

Fundamentos moleculares y aplicaciones clínicas

SÍNTESIS CONCEPTUAL 2
BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR AÑO 2022
Diagnóstico de la infección aguda por SARS-CoV-2
 PCR: Reacción en cadena de la polimerasa

Kary B. Mullis, 1983

Premio Nobel de Química 1993

Amplificación de un segmento específico en una mezcla compleja de ADN

¿Qué elementos son imprescindibles en esta reacción?
Mecanismo molecular de la replicación
Arthur Kronberg, 1956 Premio Nobel de Medicina 1959
Aislamiento de ADN polimerasa de E.coli Arthur Kronberg and Severo Ochoa

“por descubrir los mecanismos biológicos de

replicación de los ácidos nucleicos"

¿Cuáles son sus ¿Cuáles son sus

sustratos? requerimientos?
Mecanismo molecular de la replicación
Sustratos de la ADN polimerasa

dATP dTTP dGTP dCTP

Desoxirribonucleósidos trifosfato
“dNTPs”
Mecanismo molecular de la replicación
Requerimientos de la ADN polimerasa Actividad de la enzima:
Polimerización en dirección 5’ a 3’

A- Molde de ADN simple cadena

B- Un extremo 3’-OH de una hebra previamente apareada

Mecanismo molecular de la replicación
Requerimientos de la ADN polimerasa
DNA elongation (Fig. 3.4a):
¿Qué elementos son imprescindibles en esta reacción?

▪ ADN (molde) ▪ Buffer (solución

amortiguadora)

▪ ADN polimerasa ▪ Mg2+

▪ dNTPs

▪ Primers (cebadores)
PCR: Reacción en cadena de la polimerasa
La importancia de los primers

Tamaño primers: 18-25 nt (son de ADN)

Las secuencias de los primers determinan la región que se va a amplificar

Cada ciclo de amplificación consta de tres pasos:

Primer paso:

Desnaturalización del ADN doble cadena, a 95º C

Cada ciclo de amplificación consta de tres pasos:

Segundo paso:

Hibridación de los primers (annealing), a 50º-70ºC

dependiendo de la composición de los primers
Cada ciclo de amplificación consta de tres pasos:

Tercer paso:

Síntesis de ADN, a 70º-75ºC

Algunos aspectos técnicos importantes:

Termociclador
Algunos aspectos técnicos importantes:
¿Cómo evitar la desnaturalización de la ADN polimerasa en cada ciclo?

Thermus aquaticus

Taq polimerasa
ADN polimerasa termorresistente

La Taq polimerasa no tiene actividad 3’ exonucleasa

(proofreading o lectura de prueba)
La amplificación es exponencial:

Después de 30 ciclos, habrá aprox 109 moléculas de ADN

específicamente amplificadas
La amplificación es exponencial:

A(n)= A0. 2n
Meseta o plateau

MODELO TEÓRICO

Cantidad de copias generadas

AMPLIFICACIÓN EMPÍRICA

Número de ciclos
¿Cómo se visualizan los productos de amplificación?
Electroforesis de ácidos nucleicos

El objetivo de la electroforesis en gel es separar moléculas de ADN según su tamaño

¿Cómo se visualizan los productos de amplificación?
Electroforesis de ácidos nucleicos

Bromuro de etidio

PCR de punto final

PCR de punto final
Aplicaciones en el contexto clínico
TALLER 1

Identificación de mutaciones Diagnóstico de infecciones

M 1 2 3 4 5
M 1 2 3 4
PCR en tiempo real o qPCR (cuantitativa)

SYBR green
RT-PCR: PCR con retrotranscripción
Permite amplificar indirectamente moléculas de ARN

ETAPA I : RETROTRANSCRIPCIÓN
TRANSCRIPTASA REVERSA

ARN cADN
RT-PCR: PCR con retrotranscripción
Permite amplificar indirectamente moléculas de ARN

PRIMERS ESPECÍFICOS

ARN cADN Amplificación

por PCR de
algunos
cADNs

Usualmente se combina con la PCR cuantitativa: RT-qPCR

RT-qPCR
Aplicaciones en el contexto clínico

Diagnóstico de infecciones virales

(virus de ARN) TALLER 1

▪ Diagnóstico de la infección aguda por SARS-CoV-2

▪ Determinación de VIH-1 en plasma

Conclusiones
M 1 2 3 4