CAPÍTULO 14

Clonación acelular: reacción

en cadena de la polimerasa (PCR)

14.1 PRINCIPIO DEL MÉTODO 202 14.5.3 PCR con "comienzo en caliente" 208
14.2 ETAPAS DEL PROCESO 203 14.5.4 PCR "larga" 208
14.3 CARACTERÍSTICAS 204 14.5.5 PCR "anidada" 208
14.4 AUTOMATIZACIÓN 205 14.5.6 PCR inversa 208
14.5 VARIANTES DEL MÉTODO 205 14.5.7 PCR con adaptadores 209
14.5.1 PCR en tiempo real 205 14.5.8 PCR asimétrica 209
14.5.2 RT-PCR: amplificación de RNA 206

Se comienza en este capítulo la descripción de la clonación molecular, o clonación de moléculas de ácido

nucleico, con la técnica que permite amplificar el DNA (o RNA) sin emplear células. Por ello, se trata de una
clonación acelular de acuerdo con la clasificación establecida en el capítulo anterior.
La PCR (acrónimo de polymerase chain reaction, reacción en cadena de la polimerasa) es hoy día una
herramienta imprescindible en los laboratorios de biología molecular e ingeniería genética. El objetivo de esta
técnica es la amplificación directa de un gen o un fragmento de DNA, presente en muestras muy diversas, sin
necesidad de una purificación previa. Cuando el objetivo es un RNA, puede aplicarse la PCR de forma
indirecta, si previamente se sintetiza su DNA complementario. Se pueden emplear como muestra para hacer
PCR homogenados, extractos crudos de tejido, sangre completa, mezclas de fragmentos de DNA obtenidos con
enzimas de restricción, muestras resultantes de la extracción y aislamiento de DNA, etc. Sin embargo, debe
resaltarse que, por razones que se comprenderán más adelante, es un requisito imprescindible que se conozca la
secuencia de una parte de la región de DNA o RNA que se quiere amplificar (salvo en el caso de algunas
variantes como la PCR inversa, pág. 208).
Por estas características, en especial la capacidad de amplificación, la PCR es un método idóneo para
preparar ácidos nucleicos en una cantidad muy superior a la presente en la muestra original, tanto con fines de
clonación acelular como para la detección.

14:1

Las aplicaciones de la PCR son muy numerosas y variadas. Como ejemplos, pueden citarse: clonación
acelular de fragmentos de DNA, detección de secuencias sin purificación previa, preparación de muestras para
secuenciación de ácidos nucleicos, establecimiento de polimorfismos de secuencia, rastreo de mutaciones,
tipificación de DNA para trasplantes, diagnóstico de enfermedades genéticas (incluido el diagnóstico prenatal),
determinación de secuencias específicas de DNA relacionadas con situaciones patológicas definidas, resolución
de problemas forenses o arqueológicos, estudios evolutivos, detección de microorganismos infecciosos, detec-
ción de células tumorales, amplificación de DNA para su posterior clonación celular, etc.

© 2012. Elsevier España, S.L. Reservados todos los derechos 201

 202 I I . T R A N S M I S I Ó N D E L A I N F O R M AC I Ó N G E N É T I C A Y T E C N O LO G Í A S R E L A C I O N A D A S

14.1 PRINCIPIO DEL MÉTODO

La PCR no es una técnica analítica per se, sino más bien una metodología, resultante de la aplicación práctica de
tres conceptos, ya descritos (págs. 164, 168 y 145, respectivamente):

1. Desnaturalización del DNA para dar moléculas monocatenarias.

2. Hibridación específica de la molécula monocatenaria con un oligonucleótido. Ésta es la etapa que justifica
por qué se debe conocer parte de la secuencia.
3. Replicación de la molécula monocatenaria mediante una DNA polimerasa que emplea el oligonucleó-
tido anterior como cebador: también se puede denominar elongación o extensión del cebador, o polime-
rización.

Mediante la aplicación en forma cíclica de estos tres procesos se consigue un número muy alto de copias del
fragmento de ácido nucleico en un corto espacio de tiempo, como se verá a continuación.
A pesar de esta aparente complejidad, en teoría es un método sencillo, sensible y relativamente rápido para
amplificar secuencias. En la práctica, se requiere un control preciso de las variables que condicionan este triple
proceso (secuencia diana, cebadores, enzimas y resto de componentes), además de instrumentos adecuados
(termocicladores) para establecer con precisión las condiciones de cada etapa y repetirlas cíclicamente (tiempo,
temperatura, número de ciclos, etc.). Se consigue de esta forma amplificar secuencias de tamaños diversos,
comprendidos entre 50 pb y 2,5 kb.
Para la realización práctica se precisan en la mezcla de reacción los siguientes "reactivos":

a) Los cuatro dNTP, en exceso, como sustratos para la síntesis de las innumerables copias de DNA. Para ser
reconocidos por la polimerasa, deben ir acompañados de Mg2+ que es, además, una coenzima requerida por
la polimerasa.
b) Dos oligonucleótidos monocatenarios (coloquialmente, "oligos"), por lo común sintéticos, de 18 a 30 nt.
Sus secuencias han de ser complementarias, respectivamente, a los dos extremos 3’ de la región diana, uno
en cada hebra, de modo que los oligos puedan ejercer de cebadores para la replicación de las dos hebras en la
región diana. Por esta razón no puede amplificarse una región de DNA si no se conoce la secuencia de sus
dos extremos. De hecho, es la posición donde hibridan los cebadores la que define cuál es el fragmento que
se amplifica (secuencia diana).

14:2

c) Una DNA polimerasa termoestable, es decir, enzimáticamente activa a temperaturas relativamente altas
(habitualmente en torno a 75
C). La replicación a temperaturas elevadas impide la formación de híbridos
parcialmente desemparejados y contribuye así a la especificidad y rendimiento del proceso. Por otra parte,
la estabilidad de la polimerasa a temperaturas de hasta 95
C (aunque no mantenga su actividad, no se
desnaturaliza) permite que recupere su actividad al enfriarse de nuevo y evita así la necesidad de reponer
la enzima en sucesivos ciclos. La enzima más empleada se denomina polimerasa Taq, por proceder de la
bacteria Thermus aquaticus, que vive en manantiales de agua caliente. Esta enzima tiene el inconveniente de
carecer de la actividad correctora de pruebas (exonucleasa 3’) (pág. 150), por lo que la frecuencia de errores
es superior a la propia de la replicación (alrededor de un error por cada 5.000 nucleótidos incorporados); a
pesar de ello, es suficiente para los propósitos de la técnica. Hoy día existen otras DNA polimerasas
termoestables que pueden emplearse como alternativa.
 14. Clonación acelular: reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 203

14.2 ETAPAS DEL PROCESO

Como ya se ha indicado, se requiere una sucesión de ciclos (en general entre 20 y 40, de 1,5 a 5 minutos de
duración cada uno) formados por desnaturalización, hibridación y replicación, para conseguir una enorme
amplificación del número de moléculas que contienen la secuencia de interés o diana. La duración total es
cercana a 2 horas, dependiendo de las condiciones experimentales concretas.
Cada ciclo de una PCR consta, pues, de tres etapas:

1. Desnaturalización: calentamiento para la separación de las dos hebras del DNA, mediante una incubación
breve (30-120 s) a una temperatura comprendida entre 68 y 97
C, que debe ser superior a la de fusión (Tm,
pág. 167) de la región de DNA que quiere amplificarse.
2. Hibridación: enfriamiento rápido por debajo de Tm, de forma que se permite el emparejamiento (pág. 168)
del DNA monocatenario de interés con los oligos cebadores. En general se usan temperaturas comprendidas
entre 37 y 65
C que se mantienen entre 10 y 120 s.
3. Elongación (o replicación): etapa de amplificación propiamente dicha (72-75
C, 1-3 min), en la que la
DNA polimerasa termoestable elonga los cebadores, empleando como molde ambas hebras originales. La
replicación transcurre (pág. 147) en dirección 5’ ! 3’ a partir del extremo 3’-OH de cada cebador,
empleando como sustrato los cuatro dNTP, hasta terminar la lectura del molde o hasta que se eleve la
temperatura en una nueva etapa de desnaturalización (siguiente ciclo).

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Además de las 3 etapas de cada ciclo, suelen añadirse una etapa previa y una final al conjunto de todos los
ciclos. La previa, a elevada temperatura (incluso superior a la de las etapas de desnaturalización), sirve
principalmente para inactivar proteasas y nucleasas de la muestra, así como para asegurar la des-
naturalización completa del DNA de partida, en especial si éste tiene gran tamaño o posee regiones muy
compactadas (caso de un DNA genómico completo). La etapa final, por su parte, consiste en una prolongación
de la última elongación, para permitir que se completen todos los fragmentos.

Web 14.1. Mecanismo de la PCR: reacciones y resultados en los 4 primeros ciclos.

Debe destacarse que si la muestra de partida, como ocurre en el ejemplo descrito, está formada por
moléculas de DNA de mayor tamaño que la región diana sólo aparecen copias exactas de la diana a partir
del tercer ciclo. Si la muestra de partida hubiese sido el propio fragmento diana, todas las copias aparecidas
desde el primer ciclo serían iguales a él.
204 I I . T R A N S M I S I Ó N D E L A I N F O R M AC I Ó N G E N É T I C A Y T E C N O LO G Í A S R E L A C I O N A D A S

Además de la amplificación global, por aumento del número de moléculas de DNA, debe notarse cómo el
número de copias de la diana se incrementa mucho más rápidamente que el de otras copias más largas. Todo
ello hace que en la mezcla final, al terminar la PCR, los fragmentos diana superen abrumadoramente en número
a cualquier otro tipo de fragmento, incluyendo, obviamente, las moléculas de DNA originales de la muestra
(que no se han amplificado). En la siguiente tabla se observa el enorme grado de amplificación conseguido, de
un millón de veces en 20 ciclos y un billón en 40 ciclos. Esto es lo que permite aplicar la PCR a muestras sin
necesidad de purificar su DNA, y analizar de manera directa los resultados, en los que sólo se podrá detectar el
fragmento amplificado.

N.
de ciclos realizados N.
total de copias N.
de copias "largas" N.
de copias diana Dianas/total
1 2 2 0 0
2 4 4 0 0
3 8 6 2 25%
4 16 8 8 50%
5 32 10 22 69%
10 1.024 20 1.004 98%
20 ffi106 40 ffi106 99,996%
40 ffi1012 80 ffi1012 100%
x x
x 2 2x 2 -2x

14.3 CARACTERÍSTICAS

A continuación se comentan algunas características del proceso de PCR.

Rendimiento: puesto que los productos de cada ciclo sirven de molde para el siguiente, la acumulación de
copias (tanto totales como dianas) es exponencial en vez de lineal. Sin embargo, en la práctica el rendimiento
de cada etapa no es completo, por lo que las cifras se ven algo reducidas. A pesar de ello, siguen siendo muy
elevadas. El número de copias al final de los ciclos realizados puede calcularse como:

N = N0 (1 + R)X siendo: N = número de copias obtenidas

N0 = número de moléculas iniciales
R = rendimiento de cada ciclo (generalmente, de 70 a 85%),
expresado en tanto por uno (0,70-0,85)
X = número de ciclos

Se han desarrollado modificaciones del método descrito, encaminadas a aumentar la eficiencia, sobre todo
en lo relativo a la concentración de Mg2+ (habitualmente entre 1 y 4 mM) y al tiempo y temperatura de hi-
bridación.
Duración: la duración de cada una de las tres etapas de cada ciclo y el número de ciclos deben optimizarse,
dependiendo de la secuencia concreta que quiera amplificarse. En muchos casos la elección de estas condiciones
debe hacerse de forma empírica.
Especificidad: es muy elevada. Está determinada especialmente por la secuencia de los dos cebadores
utilizados y por las condiciones de hibridación. Se puede determinar la especificidad analizando en electro-
foresis el producto de la PCR: la aparición de una banda única indica que la técnica ha actuado con buena
especificidad. Por ejemplo, si la temperatura de hibridación se reduce en exceso se producen falsos positivos
debidos, fundamentalmente, a emparejamientos imperfectos del cebador con secuencias distintas de la diana,
aunque similares, que resultan así también amplificadas.
Capacidad de detección (común aunque incorrectamente denominada sensibilidad): es muy alta (bajo límite
de detección), tanto que la PCR puede permitir detectar una única molécula de DNA en casi cualquier tipo de
muestra clínica, forense o arqueológica (pelo, sangre, semen, etc.). Sin embargo, esta característica supone
también un elevado riesgo de contaminación por moléculas de origen ajeno a la muestra.
Fidelidad: es decir, la capacidad de copiar secuencias con precisión, sin introducir mutaciones (cambios en la
secuencia de nucleótidos). Esta característica depende sobre todo de que la polimerasa empleada tenga o no
14. Clonación acelular: reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 205

actividad correctora de pruebas (3’-exonucleasa, pág. 150). Así, la frecuencia de error oscila entre 2  104 de
una polimerasa Taq convencional y 1  106 de la polimerasa Pfu, que sí tiene actividad 3’-exonucleasa. En
todo caso, la elección de la enzima dependerá del objetivo de la PCR. No es crítica la fidelidad si sólo se pretende
obtener una sonda, pero es fundamental si el objetivo es la identificación de mutaciones poco frecuentes.

14.4 AUTOMATIZACIÓN

La automatización de la PCR es sencilla y de bajo coste, dado el carácter cíclico repetitivo del proceso, el empleo
de componentes estables al calor, la necesidad de añadir reactivos únicamente al comienzo y el desarrollo de
sistemas electrónicos para programar los cambios de temperatura. Al mismo tiempo es imprescindible, pues
sólo mediante la automatización se hace factible la realización de un número elevado de ciclos y se aumenta la
precisión del proceso. Ello facilita un empleo cada vez más específico y sensible en el laboratorio clínico. Los
instrumentos diseñados para el desarrollo de reacciones de PCR se denominan termocicladores y suelen admitir
varias decenas de muestras simultáneas, con volúmenes comprendidos entre 25 y 100 ml.

14.5 VARIANTES DEL MÉTODO

Han surgido numerosas modificaciones derivadas del método básico inicial, con el propósito de mejorar el
rendimiento o la especificidad, adaptarse a muestras particulares, amplificar moléculas de RNA en lugar de
DNA, producir moléculas monocatenarias, etc. A continuación, se comentan de forma breve algunas de las
variantes más significativas.

14.5.1 PCR en tiempo real

La PCR, en su diseño original, es una técnica de punto final, es decir, analiza el producto obtenido tras finalizar
la reacción. Este planteamiento resulta ser poco cuantitativo: muestras con diferente cantidad de DNA inicial
pueden producir resultados similares tras la amplificación, y viceversa. Por supuesto, esto no es un problema
para algunas aplicaciones, pero existen casos en los que es importante analizar múltiples muestras de forma
comparada (notablemente, la expresión de genes bajo diferentes situaciones). Debido a esta necesidad, se
ha desarrollado la técnica de PCR cuantitativa (qPCR) o PCR en tiempo real, que mide la velocidad a la que
se va amplificando el DNA. (En ocasiones, se usa RT-PCR para indicar real time PCR, pero este acrónimo es
poco adecuado, pues se confunde con la PCR con transcriptasa inversa, descrita a continuación.)
Las razones por las que la PCR tradicional no es cuantitativa comprenden, a grandes rasgos, la baja
detectabilidad y la poca proporcionalidad de la señal propias de los métodos empleados para revelar el
DNA (tradicionalmente, la tinción de los geles de electroforesis con etidio, un intercalante, pág. 141) y la
tendencia de la reacción a saturarse en los ciclos finales (por agotamiento de los sustratos, inhibición por los
productos finales y degradación de éstos, entre otros factores). El planteamiento cinético de la qPCR consiste en
medir no la cantidad de producto formado al final, sino la velocidad a la que se está formando en momentos
moderadamente tempranos de la reacción. En concreto, se observa la fase en la que la reacción es aún
exponencial –por tanto, mantiene la proporcionalidad respecto a la cantidad inicial de DNA– y se cuantifica
el número de ciclos que han sido necesarios para alcanzar una cantidad prefijada de DNA producto. Cuanto
mayor sea la abundancia en la muestra, antes se alcanzará la cantidad prefijada.
La cuantificación depende de un compuesto que se una al DNA bicatenario, producto de la reacción de
amplificación. Habitualmente se utilizan fluorocromos (bien intercalantes o bien ligandos en el surco menor,
con mejor detectabilidad que el etidio) que se unen muy preferentemente al DNA bicatenario e incrementan de
forma notable su fluorescencia. De forma automatizada, prácticamente en continuo, se mide la intensidad
de fluorescencia en cada muestra al finalizar cada ciclo de amplificación, como índice del número de copias
conseguidas. Obviamente, esta determinación no es demasiado selectiva, pues es independiente de la secuencia
del DNA y no permite diferenciar si ese DNA bicatenario corresponde efectivamente a la amplificación
selectiva del DNA diana. Por ello, se ha desarrollado una segunda generación de métodos de detección basados
en el uso de sondas de hibridación (Capítulo 12), dirigidas contra una secuencia interna del DNA diana. Tras la
etapa de desnaturalización de cada ciclo la sonda hibrida con el DNA amplificado. Puesto que es preciso
diferenciar la fluorescencia de la sonda unida al DNA diana de la que posee la sonda libre, se han diseñado
diversas estrategias para asegurar que la sonda libre no muestre señal.
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14:4

14.5.2 RT-PCR: amplificación de RNA

El nombre, "PCR con transcriptasa inversa" (iniciales de reverse transcriptase), indica que se trata de una
amplificación de RNA (especialmente mensajero) a través de la síntesis previa de su cDNA (DNA
 14. Clonación acelular: reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 207

complementario al RNA), que después se amplifica por PCR. Es decir, no se obtienen copias del RNA de
partida, sino de DNA, aunque se conserva, obviamente, la secuencia de aquél.
Es el método con mayor capacidad de detección de los disponibles para la medida de la expresión génica in
vitro. Se utiliza preferentemente para amplificar mRNA de células asequibles con una expresión elevada de
ciertos genes, aunque también se ha aplicado al análisis de transcritos de genes expresados en grado mínimo.
La mezcla inicial contiene todos los componentes necesarios: muestra de RNA, transcriptasa inversa, DNA
polimerasa, cebadores y dNTP. El proceso comienza (por ejemplo, 45 min a 48
C) con la síntesis de una hebra
de cDNA por la acción de la transcriptasa inversa, una polimerasa de DNA dirigida por RNA (pág. 149),
permaneciendo el cDNA unido al molde como molécula bicatenaria híbrida RNA:cDNA. En una segunda
etapa (por ejemplo, 2 min a 94
C) se desnaturaliza la molécula bicatenaria y comienza la amplificación según
el mecanismo de una PCR normal: la hebra de cDNA liberada actúa como molde para una segunda hebra de
DNA y luego la molécula bicatenaria se amplifica en sucesivos ciclos.

14:5

Web 14.2. Técnica RT-PCR.

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En teoría, basta con una molécula de RNA que esté intacta entre los dos sitios de unión a los cebadores para
conseguir la amplificación. Bajo el mismo principio, también puede amplificarse RNA usando la
polimerasa Tth (también termoestable, aislada de la bacteria termófila Thermus thermophilus), que contiene
al mismo tiempo actividades DNA polimerasa y transcriptasa inversa.

14.5.3 PCR con "comienzo en caliente"

Esta modificación (hot start PCR) consiste en privar a la mezcla de reacción de alguno de sus componentes
(frecuentemente la polimerasa) hasta que se haya alcanzado una temperatura superior a la de hibridación. De
este modo, se evita la elongación de cebadores que hayan podido asociarse al comienzo con poco rigor (a
secuencias parcialmente homólogas con la diana) y, como resultado, se aumenta de manera señalada la
especificidad de la amplificación.

14.5.4 PCR "larga"

Denominada L-PCR (Long PCR) o LA-PCR (Longer and Accurate PCR, "PCR más larga y exacta"), su
objetivo es superar los límites de la PCR convencional para amplificar con fidelidad regiones diana de gran
tamaño (entre 5 y 40 kb). El principal factor limitante es la ausencia de actividad correctora de pruebas en la
polimerasa Taq (pág. 202), por lo que se añade una cantidad menor de otra enzima con capacidad de
corrección de pruebas (por ejemplo, la Pfu) para contrarrestar la carencia de esta actividad y, al mismo tiempo,
seguir aprovechando la eficacia de elongación de la polimerasa principal (Taq o similar).

14.5.5 PCR "anidada"

La especificidad puede aumentarse realizando una segunda reacción de PCR, con dos cebadores nuevos que
hibridan dentro del fragmento diana amplificado por el primer par, lo que da lugar a productos de PCR más
cortos, pero más específicos. Las copias correctas de la primera diana contendrán ambas secuencias comple-
mentarias a los nuevos cebadores, a diferencia de los productos no específicos generados en la primera PCR
(que se observan en la electroforesis como varias bandas o una banda difusa) que, por ello, no resultarán
amplificados en la segunda. Este método también sirve para aumentar el factor de amplificación conseguido, al
suponer dos rondas de amplificación.

14:6

14.5.6 PCR inversa

Esta variante se emplea para clonar regiones desconocidas de un DNA, situadas en posición vecinal a secuen-
cias diana conocidas. Es decir, en lugar de amplificar la región interna, flanqueada por los dos cebadores (PCR
convencional), se amplifica la región externa, que flanquea a los cebadores. Para ello es necesario cortar el DNA
 14. Clonación acelular: reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 209

a ambos lados de la región diana con una enzima de restricción (pág. 212), de tal forma que los extremos
cohesivos resultantes puedan hibridar entre sí, formando una molécula circular. Ésta se cierra mediante una
ligasa y se realiza la PCR con cebadores que hibridan con los extremos 5’ de la secuencia conocida, por lo que la
elongación se extenderá alrededor del círculo. Se generan copias de un DNA lineal delimitado, como en la PCR
normal, por la posición de ambos cebadores.

Web 14.3. Técnica de PCR inversa.

14.5.7 PCR con adaptadores

También puede amplificarse una región de DNA de secuencia desconocida ligando a sus fragmentos de
restricción unos adaptadores, oligonucleótidos sintéticos con extremos cohesivos (pág. 215) compatibles
con los generados en la muestra. A continuación, una vez desnaturalizados, se añaden cebadores específicos
para las secuencias 3’ de los adaptadores. Se amplifica así el conjunto de adaptadores y secuencia diana, pero
debe señalarse que se amplifican por igual todos los fragmentos de restricción presentes, no sólo uno.

14:7

Web 14.4. Técnica de PCR con adaptadores.

14.5.8 PCR asimétrica

En este caso, se trata de generar copias monocatenarias de un DNA. En la variante más simple, se añaden
cantidades muy diferentes de ambos cebadores, de modo que tras los primeros ciclos de PCR uno de ellos se
agota y, disponibles ya suficientes copias del DNA diana, sólo una de sus hebras sigue amplificándose gracias al
cebador más abundante.