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PCR A TIEMPO REAL

Mara Maiques R4-Bioqumica Clnica 25-Abril-07

VEAMOS
Herramientas para detectar mutaciones Molculas fluorescentes y tecnologa FRET PCR a tiempo real: equipos y mtodos de deteccin Interpretacin de resultados Utilidades de PCR a tiempo real Ventajas y aplicaciones Conclusiones

en RGre SYB

Secuenciacin
Hib rida ci n

SONDAS ESPECFICAS

COMPONENTES DE LA REACCIN

SONDAS SYBRGreen ESPECFICAS

FLUORESCENCIA

*FLUORESCENCIA
E
Estado de Mxima Excitacin Estados Intermedios
CALOR

Estado Fundamental

Tiempo

E = h/

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)


FRET es un proceso por el cual un fluorforo (DONADOR) en estado excitado, transfiere su energa a una molcula prxima (ACEPTOR)

E1= h/1

E3= h/3 E1 > E2 > E3 1 < 2 < 3 E2= h/2

FRET se produce slo si las dos molculas (DONADOR Y ACEPTOR) estn suficientemente juntas, disminuyendo su eficacia al aumentar la distancia entre ellas

MTODOS DETECCIN: sybr-green


SYBR Green I

ELONGACIN Unin inespecfica al DNAds Requiere empleo curvas de melting Emite seal intensa que aumenta proporcionalmente al producto acumulado

ANLISIS DE RESULTADOS

Umbral de deteccin

Ct: primer ciclo de la PCR en el que se detecta producto amplificado Ct es inversamente proporcional a la cantidad de DNA o RNA de partida

en RGre SYB

Secuenciacin
Hib rida ci n

SONDAS ESPECFICAS

COMPONENTES DE LA REACCIN

Sondas especficas

MTODOS DETECCIN: sondas FRET


Fluorescein LC Red

ANNEALING Hibridacin de sondas especficas, marcadas con 2 fluorocromos (donador y aceptor) Su aproximacin disminuye la fluorescencia emitida x el donador (FRET)

MTODOS DETECCIN:

sondas de hidrlisis (TAQMAN)

Sondas especficas con un fluorocromo en cada extremo (Reporter y Quencher) Apantallamiento cuando la sonda est intacta

ELONGACIN

INSTRUMENTACIN

ANLISIS DE RESULTADOS

Umbral de deteccin

Ct: primer ciclo de la PCR en el que se detecta producto amplificado Ct es inversamente proporcional a la cantidad de DNA o RNA de partida

en RGre SYB

Secuenciacin
Hib rida ci n

SONDAS ESPECFICAS

DISCRIMINACIN ALLICA

Alelo normal o wild-type

Alelo mutante

DISCRIMINACIN ALLICA

WILD-TYPE HETEROCIGOTO

HOMOCIGOTO

UTILIDADES DE LA PCRtr
Deteccin de mutaciones, discriminacin allica Cuantificacin - absoluta (patrn de diluciones estndar) - relativa (respecto a un control) Caracterizacin de productos de PCR

UTILIDADES DE LA PCRtr
Deteccin de mutaciones, discriminacin allica Cuantificacin
GENES DE REFERENCIA

- absoluta (patrn de diluciones estndar) - relativa (respecto a un control) Caracterizacin de productos de PCR

UTILIDADES DE LA PCRtr
Gene -actin -actin GAPDH 5.8S,18S, 28S RNA 2-microglobulin G6PDH PBGD aldolase HPRT U3, U8, ... ornithin decarboxylase ... Genomic structure / pseudogenes multigene family; > 20 genes; 1 active locus 20 pseudogenes multigene family; pseudogenes multigene family; 10-30 genes; > 200 in mouse mostly pseudogenes pseudogenes no pseudogenes no pseudogenes Regulation e.g. : hormones of tyroid gland : stomach tumor : lung, pancreatic, colon cancer : insulin, EGF

Deteccin de mutaciones, discriminacin allica no pseudogenes SH


pseudogenes pseudogenes Pseudogenes

SE U

EE K

NG PI

: Non-Hodgkin lymhoma abnormal expression in tumors : kidney, stomach tumor : hormones, oxidant stress, growth factors

NE E

: tumors

Cuantificacin absoluta

UTILIDADES DE LA PCRtr
Deteccin de mutaciones, discriminacin allica Cuantificacin - absoluta (patrn de diluciones estndar) - relativa (respecto a un control) Caracterizacin de productos de PCR

Cuantificacin relativa
Ge n Re fe re ncia 8 6 4 2 0 0 10 20 30 Log ng RNA y = -1,0365x + 28,82 R = 0,9936
2

Gen Diana
8 6 4 2 0 0 Log ng RNA 20 40 y = -0,7147x + 27,213 2 R = 0,9852

MUESTRAS Cerebro

C t

Ct GD 28.36

Ct GR 15.22

ng GD 0.84

ng GR 589

GD/GR 1.43* 10-3

C t

Ratio 1

Msculo Hgado Rin

32.33 20.71 24.58

15.74 15.12 15.15

0.13 33.11 5.13

302 661 646

4.17*10-4 5.01*10-2 7.94 * 10-3

0.29 35.08 5.56

UTILIDADES DE LA PCRtr
Deteccin de mutaciones, discriminacin allica Cuantificacin - absoluta (patrn de diluciones estndar) - relativa (respecto a un control) Caracterizacin de productos de PCR

Caracterizacin de productos de PCR


Cada producto de PCR se caracteriza por su Tm (T a la que el 50% del DNA est en forma de cadena sencilla) Diferentes DNA tienen distintas Tm y productos no especficos Amplificacin como dmeros DNA-primers tambin. Deteccin con SYBRGREEN
La Tm vara con:

GC
La Tm depende de:

41 C 10 C

GC 10,000 pb

50 pb

Identificacin del producto sales, MgCl , Sybr-green Concentracin de 2 Grado de homologa entre la sonda y el DNA

VENTAJAS DE LA PCRrt
Amplificacin especfica Automatizacin y disminucin del tiempo de anlisis Reaccin monitorizada a tiempo real No procesamiento post-PCR: no contaminacin Ciclos de amplificacin rpidos (<2h) Deteccin de cambios en la seal <2x Ms especfico, sensible y reproducible Coste similar a PCR convencional

APLICACIONES DE LA PCRrt
Determinacin agentes patgenos Expresin gnica en tejido en diferentes estadios de la enfermedad o tras tratamiento Delecin o amplificacin de genes Discriminacin allica Diagnstico clnico de tumores o respuesta a tto Genotipado, deteccin de SNPs, haplotipo Validacin de resultados de experimentos con arrays Metilacin de DNA y estudio de apoptosis Monitorizacin de patrones de expresin de citoquinas

CONCLUYENDO
La baja probabilidad de contaminacin, la exactitud de los resultados y la sencillez, rapidez y automatizacin del mtodo, hacen de la PCRrt una tcnica cada vez ms utilizada en todos los laboratorios

MUCHAS GRACIAS!