Ténicas

Ópticas de
Análisis II
MCQ Fernando Bedolla Cazares
fernando.bc@morelia.tecnm.mx
 Aplicaciones de los Métodos Ópticos de Análisis

• Análisis Cuantitativo

- Determinación de pureza
Farmacia (antibióticos, hormonas, analgésicos)
- Detección de impurezas.
Medioambiental (fenol, fluor, cloro en agua potable y aguas
resudiales).
- Monitoreo de reacciones (ensayos enzimáticos) 2
- Titulaciones fotométricas.
- Determinación de constituyentes de mezclas complejas.

• Análisis Cualitativo
- Detección de grupos funcionales.
- Elucidación estructural (Reglas de Woodward).
 Análisis Cuantitativo

• Aplicaciones amplias para compuestos orgánicos e inorgánicos.

• De amplia selectividad
• Sencilla adquisición de datos.

- Determinación de azúcares reductores y totales (prueba del fenolsulfúrico),

determinación de proteínas (prueba del ác. bicincónico “BCA”, Bradford, Biuret).
- Turbidimetría y densidad óptica (cinéticas de crecimiento celular, biomasa). 3
- Patrón interno, externo y adición estándar.
 Ley de Lambert-Beer

También llamada de “Beer-Bouger”.

“La cantidad de luz absorbida o transmitida por una solución colorida es una
función exponencial de la concentración de la sustancia absorbente presente
y de la longitud de la trayectoria (espesor) en donde se encuentra la muestra”.

b 4

* Transmitancia
* Absorbancia
T = P/Po
A = abc = ebc T = 10^-A
Po P %T = 10^-A *100
A = -log10 T = log Po/P c %T = P/Po x 100%
 La ley está relacionada con 4 factores:

Poder radiante incidente o una cantidad proporcional de él, cuando se mida con
un solvente puro en el haz de luz (Po).
1. Poder radiante transmitido (P).
2. El espesor o anchura (en cm) del líquido absorbente en la celda (b).
3. La concentración de la sustancia en la solución en moles por litro (c). b
5

Esta ley se cumple cuando:

Po P
1. Se usa luz de una sola longitud de onda (monocromática).
c
2. La solución contiene solo una especie capaz de absorber la longitud de onda
en particular.
3. Únicamente la luz transmitida a través de la solución se mide como luz
emergente.
a es una constante de absortividad (coeficiente de extinción, absorción específica
o índice de absorbencia), que es igual a la relación de la absorbencia al producto
de concentración por longitud de trayectoria óptica.

Cuando sus unidades son en L mol-1 cm-1 la absortividad se denomina

absortividad molar o coeficiente de extinción molar “e”, en donde a mayor e se
requiere menor concentración de analito para el análisis y viceversa.

b como espesor tiene una magnitud en centímetros.

6
c es la concentración en gr/L o en moles/L.

A = ebc
 Calibración
Conjunto de operaciones para establecer, bajo ciertas condiciones específicas, la relación
entre las señales producidas por un instrumento analítico y los correspondientes valores
de concentración o masa de los patrones de calibrado.

7
 Curva de Calibración
Sirve para determinar la relación entre la respuesta analítica y la concentración
del analito. Se determina mediante normas químicas.

Por medio de soluciones patrón de concentraciones conocidas, se puede obtener el dato de la concentración de un analito
en una muestra problema.

8
 Componentes de una curva de calibración estándar
Para la determinación de la concentración, la absorbancia de una solución de muestra desconocida se mide y se compara
con la curva de calibración para determinar su concentración.

80

70
y = 44.284x - 0.58
R² = 0.9991
Señal Analítica

60

50
9

40 Curva estándar

30

20

10

0
0 0.5 1 1.5 2

X (Concentración: %, g/mL, g/L, mg/mL, ppm, °Brix.

 A) Método de Patrón Externo
Por medio de soluciones patrón de concentraciones conocidas, se puede
obtener el dato de la concentración de un analito en una muestra
problema.

10

Su éxito depende en gran medida, de la exactitud que

tengan la concentración de los patrones y de lo que se
parezca a la matriz
 Ag (ng/mL) A
Método de Patrón Externo, ejemplo 0
5
0.003
0.127
10 0.251
En un laboratorio se analizaron una serie de disoluciones estándar de plata por 15 0.39
espectrometría de absorción atómica de llama, obteniendo los resultados siguientes: 20 0.498
25 0.625
30 0.763

a) Determine la pendiente, la ordenada en el origen y el coeficiente de determinación de la gráfica de calibración.

b) Se realizó, por triplicado, un análisis de una disolución de plata en las mismas condiciones que el calibrado 11
anterior, obteniendo un promedio de absorbancias de 0,308. Calcule la concentración de la citada disolución.

[C1] [C2] [C3] [C4] [C5] [C6] [C7]

 a) Ag (ng/mL) A 𝑦 = mx + b 𝑦! − 𝑦"
0 0.003 𝑚=
5 0.127
𝑥! − 𝑥"
X1 0 0.003 Y1
10 0.251 X2 30 0.763 Y2
15 0.39 m= 0.0253
20 0.498
25 0.625
30 0.763 𝑦 = mx + b 𝑏 = 𝑦 − mx

0.8
𝑏 = 0.763 − 0.0253(30)
y = 0.0252x + 0.0021
0.7
R² = 0.9994 12
0.6 𝑏 = 0.004
0.5
𝑦 = 0.0253x + 0.004
Absorbancia

0.4 Series 1

Lineal (Series 1)
0.3
𝒚 = 𝟎. 𝟎𝟐𝟓𝟐𝒙 + 𝟎. 𝟎𝟎𝟐𝟏
0.2

0.1

0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
Concentración (ng/mL)
 X1 0 0.003 Y1
b) 10 0.251 𝑦! − 𝑦"
X 0.308 X2 30 0.763 Y2 𝑚= m= 0.0253
15 0.39 𝑥! − 𝑥"

𝑥 − 𝑥$ 0.308 − 0.251
𝑦# = 𝑦$ + (𝑦 − 𝑦$) 𝑦! = 10 + (15 − 10)
𝑥" − 𝑥$ " 0.39 − 0.251

x y
x0 0.251 10 y0 0.057
𝑦! = 10 + (5) 𝑦! = 10 + 2.05 𝑦# = 12.05 ng/mL
0.308 ? 0.139
x1 0.39 15 y1
13
0 0.003
X 0.308
0.308 − 0.003
30 0.763 𝑦! = 0 + (30 − 0)
0.763 − 0.003
x y
x0 0.003 0 y0
0.305
x 0.308 ? 𝑦! = 0 + (30)
0.76
𝑦! = 0 + 12.03 𝑦# = 12.03 ng/mL
x1 0.763 30 y1
 B) Método de Patrón Interno

Se utiliza para compensar errores, como interferencias no espectrales de componentes de la matriz, fluctuaciones
debidas del método y errores instrumentales.

Se selecciona como estándar interno, una sustancia

diferente del analito que presente propiedades similares a
las del analito, tal que ambos sean afectados similarmente 14
durante el análisis.

Se aplica este método en técnicas instrumentales que

permitan la determinación multielemental.
 Método de Patrón Interno, ejemplo
Una muestra problema de Cu2+ dio una absorbancia de 0.262 en un análisis por emisión atómica. Después se mezcló 1 mL
de una disolución patrón de cobre con concentración 100 ppm junto con 95 mL de la muestra problema. Se añadieron 4
mL para tener un volumen final de 100 mL. La absorbancia de la nueva disolución fue 0.5. Determina la concentración de
Cu2+ en la muestra problema.

A
A [patron] ppm
0.5
0.262 100

V H2O (mL) 15
V (mL) V (mL) 100
95 1
Vf (mL)
#1 #2 #3 100

1 ppm = 1mg/L
𝐶"𝑉" Solución A [Cu2+] mg/L
𝐶! = C1 (mg/L) 100
𝑉! V1 (L) 0.001
#1 0.262 ?
#3 0.5 1
V2 (L) 0.1
C2 (mg/L) 1
 Solución A [Cu2+] mg/L 𝑦! − 𝑦"
#1 0.262 ? 𝑦 = mx + b 𝑚= m= 0.238
𝑥! − 𝑥"
#3 0.5 1

0.262 = 0.238 (0) + b 0.5 = 0.238 (1) + b 𝒚 = 𝟎. 𝟐𝟑𝟖𝐱 + 𝟎. 𝟐𝟔𝟐

b = 0.262 b = 0.262
Cuando y = 0, x= ?

0.6
x -1.101
0.5
y = 0.238x + 0.262 16
R² = 1
⎪x⎪ 1.101 [Cu2+] mg/L, en 100 mL
0.4
Absorbancia

0.3 1 ppm = 1mg/L

Series1

0.2 Lineal (Series1)

C2 (mg/L) 1.101
0.1 V2 (L) 0.1
𝐶!𝑉! V1 (L) 0.095
0 𝐶" =
-1.5 -1.3 -1.1 -0.9 -0.7 -0.5 -0.3 -0.1 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 1.1 1.3 𝑉" C1 (mg/L) 1.159
Concentración (mg/L)
C1 (ppm) 1.16
Podemos realizar el mismo cálculo utilizando la misma ecuación, (cuando solo tenemos 2 pares de datos en
el problema)

𝑉
𝑥 + 𝑉%& 𝐶%&
' 𝐴%&
=
𝑥 𝐴#

0.001 𝐿
𝑥 + 0.1 𝐿 100 𝑚𝑔/𝐿 0.5
= 17
𝑥 0.262

Al realizar iteraciones en la calculadora podemos determinar el x 1.101 mg/L

valor de X (Concentración de (Cu2+ )

Recordemos que el valor de la concentración calculada

corresponde a los 100 mL totales, no a los 95 mL iniciales.
 C) Método de Adición Estándar

Especial para analizar muestras complejas (suelos, minerales, sangre

completa, orina, etc.), donde usualmente, los componentes de la
matriz afectan las medidas de la señal analítica

El método consiste en la adición de un volumen fijo de la muestra, a

las soluciones estándares diluyendo a un volumen final constante. 18

Este método no elimina las

interferencias, solo las compensa ya
que se obtienen todas las señales
analíticas bajo las mismas
condiciones.
 Método de Adición Estándar, ejemplo
La concentración de Ag en una muestra de desechos fotográficos se determinó por espectrometría de absorción atómica
con el método de las adiciones estándar. Se obtuvieron los siguientes resultados: a un volumen de 10 mL de muestra se
agregan volúmenes variables de una solución patrón de 100 mg/L de Ag y se completa hasta un volumen final de 25
mL. Determine la concentración de Ag en la muestra de desechos fotográficos

19

#1 #2 #3 #4 #5 #6 #7
 [C] patrón 100 mg/L 0.1 mg/mL
m 0.0475
plata (mL) patrón (mL) agua (mL) [C] mg/mL [C] mg/L Abs
#1 10 0 15 0 0 0.32 𝑦 − 𝑦" = m(x − 𝑥" )
#2 10 0.5 14.5 0.002 2 0.41
#3 10 1 14 0.004 4 0.52 𝑦 − 0.6 = 0.0475 (x − 6)
#4 10 1.5 13.5 0.006 6 0.6
#5 10 2 13 0.008 8 0.7 𝑦 − 0.6 = 0.0475x − 0.285
#6 10 2.5 12.5 0.01 10 0.77
#7 10 3 12 0.012 12 0.89 𝑦 = 0.0475x + 0.315 20
1
0.9
y = 0.0466x + 0.3218 cuando 𝒚 = 𝟎
0.8
R² = 0.9976
absorbancia

0.7
0 = 0.0466x + 0.3218
0.6
0.5
0.0466x = −0.3218
0.4
0.3
0.2
x = −0.3218/0.0466
0.1
0 x = −6.9, en 25 mL
0 2 4 6 8 10 12 14
Concentración (mg/L)
 1
0.9 y = 0.0466x + 0.3218
0.8
R² = 0.9976

absorbancia
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2 x = 6.9 mg/L
0.1
0
-8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 x = 6.9 mg/L
Concentración (mg/L) 21
cuando 𝒚 = 𝟎
6.9𝑚𝑔/𝐿(0.025𝐿)
𝐶" =
0 = 0.0466x + 0.3218 0.01 𝐿

0.0466x = −0.3218
𝑪𝟏 = 17.25 mg/L o ppm
x = −0.3218/0.0466
𝐶!𝑉!
𝐶" =
x = −6.9, en 25 mL 𝑉"
 Fuentes de Error Comunes

Toda medición está sometida a un

porcentaje de error, que
principalmente está dado por:

Fuentes Descripción
22
La suciedad en las cubetas disminuye la I0 en el trayecto de la luz radiante hacia el detector, de este modo
Cubetas sucias
se detectarán valores erróneamente bajos de la intensidad de la dispersión.
Su presencia dispersa la energía radiante, tendiendo a elevar la intensidad de la dispersión. Factores como:
Interferentes Lipemia muy alta, contaminación microbiana y turbidez. Las muestras pueden no ser apropiadas y no
deben ser utilizadas a menos que sean centrifugadas o preparadas manera apropiada.

Aquellos compuestos que son excitados por la radiación incidente por lo que se obtienen valores falsamente
Compuestos fluorescentes
elevados de intensidad de dispersión.

Se debe tener principalmente cuidado con la temperatura y posibles condiciones adversas que pueden
Conservación de los reactivos:
modificarlos (Reactivos turbios o con precipitados).

Fluctuaciones en la potencia
Para evitar que este factor sea una fuente de error se recomienda utilizar estabilizadores de voltaje.
eléctrica:
 Análisis de mezclas

La espectroscopia proporciona suficientes datos para:

- La identificación de sustancias puras y ayudar en la caracterización

estructural (ya que la curva de absorción completa de una sustancia pura es
única y permite ser distinguida de todas las demás).

- Puede establecerse el tipo general y, en algunos casos, la identidad de los

constituyentes de mezclas simples.
23

Se basa en que, a una determinada l la absorbancia observada es igual a la suma de las absorbancias de cada componente
 Espectros no superpuestos Espectros superpuestos parcialmente

24

La elección de la λ es función de grado de

superposición
 Determinación de mezclas, ejemplo

Se pueden determinar las concentraciones de una mezcla de Fe+3 y Cu +2 formando el complejo con hexacianorutenato (II) ,
Ru(CN)6 -4 , que forma un complejo de color azul- violáceo con el Fe+3 (λmax = 550 nm) y un complejo gris pálido con el
Cobre (λmax = 396 nm)

Las absortividades molares de los complejos de metal se resumen en la tabla siguiente:

25
Cuando una muestra que contiene Fe+3 y Cu+2 se analiza en una cubeta de 1
cm de paso óptico la absorbancia a 550 nm fue de 0,183 y la absorbancia a
396 nm fue de 0,109.

¿Cuál es la concentración molar de Fe +3 y Cu+2 en la muestra ?

 a 550 nm : 0,183 = 9970 CFe + 34 CCu
a 396 nm : 0,109 = 84 CFe + 856 CCu

Despejamos CCu en la primera ecuación:

0.183 − 9970 𝐶#$ 𝑪𝑪𝒖 = 𝟏. 𝟐𝟕𝟓𝒙𝟏𝟎'𝟒 M

𝐶!" =
34
Y sustituimos en la segunda:
0.183 − 9970𝐶#$
0.109 = 84𝐶#$ + 856( ) 26
34

0.109 = 84𝐶#$ + (4.607 − 251009.41𝐶#$ )

250925.41𝐶#$ = 4.498

4.498
𝐶#$ = 𝑪𝑭𝒆 = 𝟏. 𝟕𝟗𝟐𝒙𝟏𝟎'𝟓 M
250925.41
 Titulaciones fotométricas

Absorbancia

Absorbancia
Una curva de titulación fotométrica es un gráfico de Punto de
equivalencia
Punto de
equivalencia
absorbancia, corregida por cambios de volumen,
como una función del volumen del titulante.

Algunos factores que influyen en los resultados de la Reactivo en volumen Reactivo en volumen
valoración fotométrica son el pH de la solución, la
naturaleza del disolvente y temperatura. a) Absorbancia de los tituladores b) Absorbancia de los productos
27
Son mejores que las titulaciones por potenciometría o conductimetría, pero se
requieren tituladores automáticos programables.

Ventajas:

1. Se mide directamente la absorbencia de la concentración.

2. Alto grado de sensibilidad.
3. No hay contacto directo con la muestra.
4. Es útil en titulaciones exactas en sistemas acuosos diluidos y los que contienen
electrolitos débiles así como en sistemas no acuosos.
Se utiliza para valorar vitaminas ( A, C y D),

Determinar la presencia de ácido ascórbico y porfirinas en muestras de suero

y orina.

En casos de intoxicación por CO, la técnica es ampliamente usada para

detectar la formación de carboxihemoglobina en sangre.

28
 Análisis Cualitativo

Los picos de absorción correlacionan con los tipos de enlaces en las especies en
cuestión, por lo que la absorción puede ser útil para “identificar los grupos
funcionales“ presentes en una molécula.

29

OH O CH3
CO2H O
H
N
HO OH N
OH O H
O
ácido carmínico índigo
 Reglas de Woodward-Fieser:
La correlación del espectro UV y la estructura química

El análisis estructural a partir de espectros electrónicos es muy impreciso.

Sin embargo, desde 1940 hasta finales del siglo pasado se han desarrollado
espectros de un elevado número de moléculas que han permitido correlacionar
la estructura con los picos máximos de absorción.
30

Las correlaciones más populares fueron las de Woodward, Fieser y Scott para los
compuestos orgánicos insaturados, dienos y esteroides.

Por medio de tablas se colectaron incrementos, diversos factores y

particularidades estructurales para la predicción de la banda de absorción
p→p*
 Aplicación de las Reglas de Woodward-Fieser

Dienos heteroanulares o polienos del tipo: Valor base: 215 nm

Dienos homoanulares o polienos del tipo: Valor base: 253 nm 31

Grupos polares:
Incrementos: O Ac 0 nm
Por cada sustituyente alquilo 5 nm O Alk 6 nm
Por cada doble enlace exocíclico 5 nm S Alk 30 nm
Por cada C=C conjugado adicional (extra) 30 nm Cl, Br 5 nm
Por cada fenilo conjugado 60 nm N (Alk)2 60 nm
 Tipo de estructura de interés estructura básica X=H 207 nm
X = alquino 215 nm
X = OH, O-alquilo 193 nm
Ciclohexano - 11nm

Cadena abierta o ciclo de 6C

(ciclo de 5C: 202 nm)
Incrementos: posiciones a b g d+
- cada doble enlace conjugado adicional 30 nm 32
Alquilo 10 12 18 18
- doble enlace C=C de naturaleza exocíclica 05 nm
- dieno de naturaleza homoanular 39 nm -Cl 15 12
por cada sustituyente, añadir (en nm).
-Br 25 30

Incremento debido al disolvente: -OH 35 30 50

Agua + 8nm
-O-Alquilo 35 30 17 31
Cloroformo - 1nm
Eter - 7nm -O-Acilo 6 6 6 6
Ciclohexano - 11nm
-N(R)2 95
Base 214 Base 253 33
incrementos incrementos
Residuos alquilo +15 (3 residuos alquilo) Residuos alquilo +15 (3 residuos alquilo)
Enlace exociclico +05 (enlace exo C=C) Enlace exociclico +05 (enlace exo C=C)
lmax = 234 nm lmax = 273 nm
Obslmax = 235 nm Obslmax = 275 nm
 34

Correcciones de solventes para enonas Correcciones de solventes para enonas

Base 215 Solvente Corrección (nm) Solvente Corrección (nm)

incrementos
Etanol 0 Eter +7
Residuos alquilo (a) +10
Residuos alquilo (b) +12 Metanol 0 Agua -8
lmax = 237 nm
Dioxano +5 Hexano +11
Obslmax = 232 nm
Cloroformo +1 ciclohexano +11
 35
Base 215 Base 202
incrementos incrementos
Residuos alquilo 2(b) +24 Residuos alquilo (b) +12
Enlace exocíclico (C=C) +05 Residuo OH (a) +35
lmax = 244 nm lmax = 249 nm
Obslmax = 245 nm Obslmax = 247 nm
Base 215
incrementos
Residuos alquilo 2(b) +24
Residuo OH (a) +35
lmax = 274 nm
Obslmax = 270 nm

36
 Reglas de Fieser-Kuhn Para sistemas poliénicos conjugados de más de 4 enlaces C=C:

lmax = 114 + 5M + n(48-1.7n) – 16.5 Rendo – 10 Rexo

emax = (1.74x104)n

Donde:
n: # de dobles enlaces conjugados.
M: # sustituyentes alquilo (o similares) unidos al sistema conjugado.
Rendo : # de anillos con dobles enlaces endocíclicos en el sistema conjugado. 37
Rexo : # de anillos con dobles enlaces exocíclicos en el sistema conjugado.

Licopeno

Valores calculados: Valores experimentales (hexano):

lmax = 114 + 5(8) + 11[48.0 - 1.7(11)] - 0 -0 = 476 nm lmax = 474 nm
emax = (1.74 x 104) 11 = 19.1 x 104 emax = 18.6 x 104
 Análisis Cualitativo

β-caroteno

38

Valores calculados: Valores experimentales (hexano):

lmax = 114 + 5(10) + 11[48.0 - 1.7(11)] - 16.5(2) -10(0) = 453.3 nm lmax = 452 nm
emax = (1.74 x 104) 11 = 19.1 x 104 emax = 15.2 x 104
Técnicas
Ópticas de
Análisis II
MCQ Fernando Bedolla Cazares
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