GUÍA PARA SOLUCIÓN DE PROBLEMAS

PROBLEMAS DE INHIBICIÓN ENZIMÁTICA (Y CÁLCULO DE CONSTANTES CINÉTICAS).

El procedimiento para la solución de éstos problemas puede llevar, únicamente a determinar el tipo
de inhibición, a hacer un análisis sobre las características del inhibidor debido a su tipo, a la selección
de inhibidores por su tipo o al cálculo de la constante de inhibición y una valoración de ésta. En
cualquier caso, se debe hacer el cálculo de las constantes cinéticas de la enzima inhibida y no
inhibida, y evaluando el cambio que sufre cada una de las constantes, se puede identificar el tipo de
inhibidor del que se trata. Podemos resumir los efectos de los inhibidores (recordando que
trabajaremos sólo con reversibles) en una tabla:

Inhibidor km vmax
Competitivo Sube Se mantiene
No competitivo Se mantiene Baja
Acompetitivo Baja Baja
Mixto Sube Baja

El término se mantiene no necesariamente indica que el valor es exactamente igual, sino que la
variación puede ser muy pequeña. Para fines meramente teóricos, podemos considerar que si la
variación de la constante cuando la enzima está o no inhibida es menor al 10%, se considera que se
mantiene igual. Una vez que se conoce el tipo de inhibidor, se elige la gráfica o regresión adecuadas
para obtener el valor de kI, por ejemplo:

I. A partir de los datos de la siguiente tabla, determinar el tipo de inhibidor de que se trata
y el valor de la constante de inhibición. ¿Es un inhibidor eficiente de la enzima?

v (M/min)
[S] (mM)
[I]=0 nm [I]= 10 nm
0.0005 1.8 0.95
0.0025 6.67 4
0.005 10 6.67
0.01 13.3 10
0.02 16 13.3

En ocasiones, en lugar de indicar la concentración de inhibidor a la que se realiza cada ensayo,

únicamente se indica si fue con o sin el inhibidor. Sin embargo, cuando se desea llegar a kI, esta
información es necesaria; de otro modo, únicamente se podrá determinar el tipo de inhibidor.
Un primer paso, no indispensable, pero si conveniente, es asegurar que [S] y v se encuentren en los
mismos submúltiplos. En caso de no desear hacer la conversión, únicamente hay que recordar
cuáles serán las unidades adecuadas para cada una de las constantes cinéticas. En éste caso, las
unidades de [S] se encuentran en mM, y las de v en M, por lo que se convierte todo a micromolar.
 v (M/min)
[S] (M)
[I]=0 nm [I]= 10 nm
0.5 1.8 0.95
2.5 6.67 4
5 10 6.67
10 13.3 10
20 16 13.3

Una vez en las mismas unidades, se sacan los inversos de todos los valores de la tabla

1/v (min/M)
1/[S] (1/M)
[I]=0 nm [I]= 10 nm
2 0.55 1.05
0.4 0.15 0.25
0.2 0.1 0.15
0.1 0.075 0.1
0.05 0.0625 0.075

Se emplean los valores de 1/[S] como valores de x y los valores de 1/v como valores de y, y se hacen
dos regresiones, una para la enzima no inhibida y otra para la enzima inhibida.

Para la enzima no inhibida:

1/v (min/M)
1/[S] (1/M)
[I]=0 nm [I]= 10 nm
2 0.55 1.05
0.4 0.15 0.25
0.2 0.1 0.15
0.1 0.075 0.1
0.05 0.0625 0.075

Y se obtiene la regresión:
1 1
= 0.2537 + 0.0445
𝑣 [𝑆]

Para la enzima inhibida:

1/v (min/M)
1/[S] (1/M)
[I]=0 nm [I]= 10 nm
2 0.55 1.05
0.4 0.15 0.25
0.2 0.1 0.15
0.1 0.075 0.1
0.05 0.0625 0.075
Y se obtiene la regresión:
1 1
= 0.5037 + 0.0445
𝑣 [𝑆]

De modo que obtenemos que:

No inhibida Inhibida
m 0.2537 0.5037
b 0.0445 0.0445
2
r 0.9902 0.9975

Recordando que en el modelo de dobles inversos de Lineweaber-Burk:

1
𝑏=
𝑣𝑚𝑎𝑥

Y que:

𝑘𝑚
𝑚=
𝑣𝑚𝑎𝑥

Despejamos las constantes cinéticas de los parámetros de la recta obtenidos de las regresiones, y
llegamos a:

No inhibida Inhibida
Km (M) 5.7 11.33
Vmax (M/min) 22.5 22.5

Es importante recordar que se deben indica las unidades de cada una de las constantes, y que es
conveniente resumir éste tipo de resultados en una tabla como la arriba presentada. De los
resultados obtenidos, vemos que la velocidad máxima no cambia, pero la constante de afinidad
aumenta. Si revisamos la tabla al inicio del documento, esto corresponde a una inhibición de tipo
competitivo. Es importante determinar el tipo de inhibición, pues dependiendo de éste será la
regresión adecuada para obtener kI. En éste caso, es necesaria la regresión de [I] vs km/vmax (es decir,
la pendiente en cada regresión), por lo que tenemos:

[I] (nM) km/vmax

0 0.2537
10 0.5037

Idealmente, sería necesario para la determinación de kI el tener diferentes ensayos a diferentes

concentraciones de inhibidor (al menos 3). Cuando sólo se tiene un ensayo con y otro sin inhibidor,
el ensayo sin inhibidor ([I]=0) se puede emplear como segundo punto para obtener una
aproximación, más o menos precisa al valor de kI. Se obtiene la siguiente regresión:

𝑦 = 0.025𝑥 + 0.2537

Dado que se trata de un inhibidor competitivo, se despeja kI de la pendiente (km/kI), empleando km

sin inhibidor; se obtiene kI= 228 nM= 0.228 M. Como recordatorio, las unidades de km vienen de
las unidades de [S], las de vmax de v y las de kI de [I}.
Finalmente falta analizar si es o no un buen inhibidor. Recordando la definición de las constantes de
equilibrio, una kI de 228 nM significa que a esa concentración logra inhibir a la mitad de la enzima,
y siendo ésta una concentración baja, se considera un buen inhibidor.

PROBLEMAS DE ACTIVIDAD ENZIMÀTICA

II. Una preparación de proteasa posee 0.208 mgprot/L. Si 150 l de la dilución 1:10 de la
preparación liberan 30 mmol de tirosina en 10 min, al mezclarse con 850 L de sustrato,
¿cuál es la actividad específica (A.E.) de la preparación? (U=mol/h).

La solución de este tipo de problemas puede llevarse a cabo por distintos métodos y en diferente
orden; me resulta más sencillo resumirla en dos pasos (y en ocasiones un tercero):

1. Arreglar los datos pertinentes en términos de la actividad.

2. Calcular y aplicar los factores de dilución.
3. (Cuando es necesario) Dividir entre la concentración de proteína (A. E.)

1. Arreglar los datos en términos de actividad.

Para este problema, las unidades se definen como U=M/h, de modo que los datos que necesitamos
son que 150 L de solución enzimática con 850 L de sustrato liberan 30 mmol en 10 min (volumen
de la mezcla de reacción (1000 L). Ordenando en términos de actividad, tenemos:
30 𝑚𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑚𝑙𝑜
𝐴= = 0.003
(1000 𝜇𝐿)(10min) 𝜇𝐿 𝑚𝑖𝑛
Una vez ordenados los datos, se hace la conversión de unidades para que sean iguales a las de la
definición de U del caso en particular.
𝑚𝑚𝑜𝑙 1000 𝜇𝑚𝑜𝑙 1000000 𝜇𝐿 60 𝑚𝑖𝑛 𝜇𝑚𝑜𝑙 𝑈
𝐴 = 0.03 = 1.8 × 108 = 1.8 × 108
𝜇𝐿 𝑚𝑖𝑛 1 𝑚𝑚𝑜𝑙 1𝐿 1ℎ 𝐿ℎ 𝐿

2. Calcular y aplicar los factores de dilución

La actividad que calculamos, es la actividad en la mezcla de reacción, pero en el problema lo que

nos piden es la actividad en la preparación original. Para ello, debemos considerar los volúmenes de
trabajo y las diluciones utilizadas.

El primer factor de dilución viene dado por los volúmenes, 150 mL de enzima y 850 mL de sustrato:
150𝜇𝐿 + 850𝜇𝐿
𝐹. 𝐷. = = 6.67
150 𝜇𝐿

El siguiente factor de dilución está claramente estipulado como 1:10, por lo que únicamente es
necesario aplicarlo.
𝑈 𝑈 𝑈
𝐴 = (1.8 × 108 ) × 10 × 6.67 = 1.2 × 1010 = 1.2 × 104
𝐿 𝐿 𝜇𝐿
Con lo que obtenemos la actividad de la preparación.

3. Cálculo de actividad específica.

Finalmente, es necesario dividir la actividad de la preparación entre la concentración de proteína.

En esos casos, se debe cuidar que las unidades de la actividad y la concentración sean congruentes
para que la AE [=] U/mgprot.

𝑈
1.2 × 104 𝑈
𝜇𝐿 4
𝐴𝐸 = mgprot = 5.77 × 10 𝑚𝑔𝑝𝑟𝑜𝑡
0.208
𝜇𝐿

NOTAS:
a) Recordar que M=mol/L, y que 𝑚𝑜𝑙 ≠ 𝑀.
b) En el arreglo de términos conforme a la definición de unidades, siempre debe a ver un
término de volumen (o masa) en que se contiene la enzima; por ello es importante la
consideración anterior, para definir si dicho volumen está implícito en el producto
liberado/sustrato consumido que se indica (M) o si es necesario considerar le volumen de
reacción o de enzima como volumen del ensayo (mol).
c) Si al ordenar los términos conforme a la definición de unidades en lugar del volumen de
reacción (E+S) se emplea sólo el volumen de enzima, no es necesario emplear el factor de
dilución correspondiente a los volúmenes.
 PROBLEMAS DE APLICACIÓN DE ENZIMAS.

Finalmente, el tipo de problemas posiblemente más importantes es el saber cómo aplicar o diseñar
un proceso enzimático. Éste tipo de problemas sirve para calcular el tiempo necesario para
transformar cierta cantidad de sustrato o la cantidad de enzima necesaria para transformar cierta
cantidad de sustrato en un tiempo dado.

III. Se cuenta con una preparación de ARNasa a 40 U/mg. Se desea degradar el 95 % del
ARN (30 mol/mL) en 250 mL de lisado celular. ¿Cuánta enzima se debe adicionar para
que el proceso se lleve a cabo en 10 min?

En éste tipo de problema debemos comparar la actividad de la enzima con la actividad del proceso
para poder obtener el dato necesario. Para conocer la actividad del proceso, debemos relacionar la
cantidad de sustrato a transformar con el tiempo necesario. Recordemos que, dado que no se
provee una definición para la actividad enzimática, consideramos la definición de la unidad
internacional de la IUPAQ (mol/min):

(30 𝜇𝑚𝑜𝑙/𝑚𝐿)(250 𝑚𝐿)(0.95) 𝜇𝑚𝑜𝑙

= 712.5 = 712.5 𝑈
(10 𝑚𝑖𝑛) 𝑚𝑖𝑛

Multiplicando la concentración (30 mol/mL) por el volumen del sustrato, obtenemos la cantidad
total de sustrato en el sistema; adicionalmente, multiplicamos esa cantidad por el porcentaje que
queremos transformar (al ser un proceso sujeto al equilibrio, difícilmente se alcanzará una
transformación del 100%), obtenemos la cantidad de sustrato a transformar. Si eso lo dividimes
entre el tiempo, y se aplican las conversiones necesarias para la definición de la unidad, obtenemos
la “actividad del proceso” (712.5 U).

Ahora, sabemos que el proceso reuiere 712.5 U, y que en cada mg de preparación hay 40 U, por
medio de diferentes metodologías podemos relacionar ambos valores para calcular la masa (o
volumen, dependiendo el tipo de preparación) necesario de enzima. Por ejemplo, mediante una
regla de 3:

40U→1mg
712.5U→x

Dónde x= 17.8 mg de enzima son necesarios para el proceso.

IV. Se emplean 100 mL de una preparación de enzima isomerasa (300 U/mL) para
transformar el 65% de la glucosa (250 mM) en fructosa en 10L de solución. ¿Cuánto
tiempo durará el proceso?
Ahora, comenzamos por calcular la cantidad de sustrato a transformar:

1000 𝜇𝑚𝑜𝑙
(250 𝑚𝑀)(10𝐿)(0.65) ∙ = 1625000 𝜇𝑚𝑜𝑙
1 𝑚𝑚𝑜𝑙

Recordando que mM=mmol/L.

Ahora, debemos saber cuánta enzima se agrega en total:

(300 𝑈/𝑚𝐿)(100 𝑚𝐿) = 30000 𝑈

Ésta vez la relación entre la enzima utilizada y la requerida por el proceso se hace desglosando la
definición de unidad:

Enzima disponible: 30000 mol son transformados en 1 min

El proceso requiere transformar: 1625000 mol

Por lo tanto:

30000 mol→1min
1625000 mol→x

X= 54.16 minutos son necesarios para el proceso.