Informe TP 6:

“Inhibidores”.

Integrantes: Antonia Quezada

Martina Perez
Carrera: Ingenieria en biotecnologia molecular
Curso: Bioquímica (BAN4213-1)
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Introducción
Los inhibidores son moléculas que afectan de forma negativa la velocidad de una reacción
enzimática (Nelson, Cox y Cuchillo, 2015). Existen inhibidores enzimáticos irreversibles y
reversibles. Los inhibidores irreversibles quedan unidos fuertemente a la enzima inactivandola y
los inhibidores reversibles se disocian rápidamente de la enzima o del complejo enzima sustrato
según el tipo de inhibidor.

Dentro del grupo de los inhibidores reversibles existen 3 tipos principales de mecanismos de
inhibición. El primero corresponde a la inhibición competitiva, en este tipo de inhibición el sustrato
(S) y el inhibidor (I) se unen de manera mutuamente excluyente a la enzima (E), es decir, solo uno
puede estar interactuando con la enzima a la vez, esto se debe a que, generalmente, compiten
por el sitio activo de la enzima, ya que el inhibidor presenta una semejanza estructural con el
sustrato (Voet, Voet y Pratt, 2007). Un inhibidor competitivo al unirse reversiblemente a la enzima
puede ser desplazado si se incrementa la concentración de sustrato, por lo tanto, a altas
concentraciones de sustrato toda la enzima se encontrará como complejo enzima-sustrato (ES) y
nada como complejo enzima-inhibidor (EI). De esta manera, un inhibidor competitivo no altera la
Vmax de la reacción, pero sí afecta la Km, aumentando este parámetro con su presencia (Nelson,
Cox y Cuchillo, 2015) lo que se evidencia en la ecuación de Michaelis-Menten.
𝑉𝑚𝑎𝑥[𝑆]
𝑉0 = α𝐾𝑚+[𝑆]
(1)
En la inhibición acompetitiva o incompetitiva el inhibidor se une solamente al complejo ES (Berg,
2008) por lo tanto la unión del inhibidor no se puede revertir sobrepasando su concentración con
la concentración de sustrato, ya que ambas interacciones no intervienen entre sí. Por lo anterior,
un inhibidor acompetitivo disminuye la Vmax y la Km de la enzima, siendo la ecuación de
Michaelis-Menten que modela esta inhibición la siguiente:
𝑉𝑚𝑎𝑥
[𝑆]
𝑉0 = α
𝐾𝑚 (2)
α
+[𝑆]

El último caso es el de una inhibición no competitiva. Este tipo de inhibición corresponde a un tipo
de inhibición mixta, llamada de esta forma ya que altera la forma de unión de la enzima al sustrato
y la actividad catalítica de este (Voet, Voet y Pratt, 2007). En este tipo de inhibición el inhibidor
puede unirse al complejo ES o a la enzima libre. La inhibición no competitiva tiene la peculiaridad
que el inhibidor tiene la misma afinidad por el complejo ES como por la enzima libre, así este tipo
de inhibidor actúa disminuyendo el número de recambio de la enzima en vez de disminuir el
número de moléculas de sustrato que se pueden unir a ella (Berg, 2008), disminuyendo la Vmax
sin afectar la Km, lo que se expresa en la ecuación de Michaelis-Menten.
𝑉𝑚𝑎𝑥
[𝑆]
𝑉0 = α
𝐾𝑚+[𝑆]
(3)

Para todas las ecuaciones que modelan los efectos del inhibidor se presenta un factor α que
[𝐼]
corresponde a 1 + 𝐾𝑖
, donde [I] es la concentración del inhibidor y Ki es la constante de inhibición
que puede interpretarse como la afinidad del inhibidor por el complejo ES o por E según
corresponda. Además, los valores que toman los parámetros cinéticos en presencia del inhibidor
se denomina Km aparente (Km app) y velocidad máxima aparente (Vmax app).

Para este trabajo práctico el objetivo principal es determinar el tipo de inhibidor que se utilizó en la
experimentación, para lo cual se debe reconocer las alteraciones que produce cada tipo de
inhibidor a los parámetro cinéticos e identificar la cantidad de inhibidor que afecta de manera
considerable dichos parámetros para lograr evidenciar los cambios, además de comprender
porque cierto tipo de inhibidor actúa alterando sólo un parámetro o ambos.

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Materiales y métodos
Se procedió de acuerdo con lo que se especifica en la guía de laboratorio del curso de Bioquímica
2022, por esto primero se determinó el volumen de inhibidor adecuado para observar sus efectos
sobre la actividad enzimática (Tabla I).

Se realizaron 5 tubos de un volumen final de 1,5 ml con diversos volúmenes del inhibidor
proporcionado junto a 0,1 ml de lactasa, 0,45 ml de amortiguador fosfato de sodio (este volumen
de buffer se calculó de igual forma que en el práctico anterior a partir del stock de amortiguador
que se encontraba a 0,1 M y deseando obtener una concentración de trabajo de 0,03 M) y 0,1 ml
de o-nitrofenil-𝛽-galactosido (ONFG) lo que se determinaron considerando que el stock se
encontraba a 30mM y se quería obtener una concentración de 2mM correspondiente al doble del
valor de la Km de la enzima para el sustrato mencionado, de esta manera:
𝐶1 · 𝑉1 = 𝐶2 · 𝑉2
30 𝑚𝑀 · 𝑉1 = 2 𝑚𝑀 · 1, 5 𝑚𝑙
𝑉1 = 0, 1 𝑚𝑙
Siendo que con 0,1 ml de ONFG presente en los 1,5 ml de volumen total de reacción se alcanza la
concentración deseada.

Tabla I. Protocolo de la actividad práctica con los volúmenes de cada componente utilizado para cada tubo (para el caso
de ONFG su concentración y volumen) y su tiempo de incubación durante determinación de la concentración inhibitoria
a una temperatura de incubación aproximada de 20°C.

[ONFG] ONFG Inhibidor Enzima Buffer H2O T. incubación Na2CO3 Vf

(mM) (mL) (mL) (mL) (mL) (mL) (min) (mL) (mL)

2 0,1 0 0,1 0,45 0,85 5 0,3 1,5

2 0,1 0,1 0,1 0,45 0,75 5 0,3 1,5

2 0,1 0,2 0,1 0,45 0,65 5 0,3 1,5

2 0,1 0,3 0,1 0,45 0,55 5 0,3 1,5

2 0,1 0,4 0,1 0,45 0,45 5 0,3 1,5

Para la segunda actividad se utilizaron los mismos volúmenes de componentes que para la
actividad 1 exceptuando que se usaron volúmenes crecientes de ONFG en este caso (Tabla II y
III). Para conseguir algunas de las concentraciones deseadas se deberían tomar volúmenes muy
pequeños del stock del ONFG, por lo que este se diluyó 10 veces respecto de su concentración
inicial, teniendo un volumen final de dilución igual a 3 ml, por ende:
𝐶1 · 𝑉1 = 𝐶2 · 𝑉2
30 𝑚𝑀 · 𝑉1 = 3 𝑚𝑀 · 3 𝑚𝑙
𝑉1 = 0, 3 𝑚𝑙
Obteniendo que la dilución de sustrato a partir del stock del mismo se logra mezclando 0,3 ml de
ONFG del stock y 2,7 ml de agua teniendo finalmente una solución de 3 ml de ONFG a 3 mM.

Para la curva de saturación en presencia del inhibidor (Tabla III) solo cambia el volumen de agua
utilizado para alcanzar los 1,5 ml ya que parte de este se reemplaza por el volumen de inhibidor a
utilizar.

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Tabla II. Protocolo de actividad práctica con volúmenes de cada componente utilizado en cada muestra, y concentración
en caso de ONFG, además de su tiempo de incubación para preparaciones enzimáticas sin inhibidor.

[ONFG] ONFG Enzima Buffer T. incubación

H2O (mL) Vf (mL)
(mM) (mL) (mL) (mL) (min)

0 0 0,1 0,45 0,95 5 1,5

0,4* 0,2 0,1 0,45 0,75 5 1,5

0,9* 0,45 0,1 0,45 0,5 5 1,5

2 0,1 0,1 0,45 0,85 5 1,5

3,8 0,19 0,1 0,45 0,76 5 1,5

4.6 0,23 0,1 0,45 0,72 5 1,5

*Tubos en los que se utilizó la dilución de ONFG.

Tabla III. Protocolo de actividad práctica con volúmenes de cada componente utilizado en cada muestra, y
concentración en caso de ONFG, además de su tiempo de incubación para preparaciones enzimáticas con inhibidor.

[ONFG] ONFG Enzima Buffer Inhibidor H2O T. incubación

Vf (mL)
(mM) (mL) (mL) (mL) (mL) (mL) (min)

0 0 0,1 0,45 0,4 0,55 5 1,5

0,4* 0,2 0,1 0,45 0,4 0,35 5 1,5

0,9* 0,45 0,1 0,45 04 0,1 5 1,5

2 0,1 0,1 0,45 0,4 0,45 5 1,5

3,8 0,19 0,1 0,45 0,4 0,36 5 1,5

4.6 0,23 0,1 0,45 0,4 0,32 5 1,5

*Tubos en los que se utilizó la dilución de ONFG.

Las diferentes mezclas de reacción se realizaron en tubos de ensayos y se midieron los diferentes
volúmenes con pipetas graduadas de 1ml, teniendo una pipeta para cada componente. El tiempo
de incubación se midió con cronómetros y la medición de absorbancia se realizó mediante un
espectrofotómetros 420 nm, el que se encontraba previamente calibrado.

Resultados brutos
A continuación, en la Tabla IV se muestra la absorbancia medida durante el experimento realizado
para determinar la concentración de inhibidor a partir de distintas alícuotas del mismo para luego
usar en el siguiente ensayo la alícuota que entrega un 50% de inhibición.

Tabla IV. Volúmenes (ml) de inhibidores con su respectiva absorbancia a 420 nm y velocidad (Abs/min) medida en
espectrofotómetro, luego de detenida la reacción.

Inhibidor (mL) Abs 420 nm Velocidad (Abs/min)

0 0,409 0,082

0,1 0,345 0,069

0,2 0,335 0,067

4
 0,3 0,257 0,051

0,4 0,219 0,044

A partir de estos resultados tabulados y la gráfica de la Figura 4 en el anexo, se determina que 0,4
ml de inhibidor entrega un 50% de inhibición a la preparación enzimática. Este volumen es el
usado para comparar la actividad enzimática con y sin inhibidor.

Realizado el experimento se puede medir la absorbancia para las muestras con inhibidor y para
las muestras sin presencia de este (Tabla V).

Tabla V. Absorbancias medidas a 420 nm para muestras con y sin presencia de inhibidor.

Muestra [ONFG] (mM) Abs 420 nm

aa A 0,001

1* 0 0,002

2 0,4 0,066

2* 0.4 0,028

3 0,9 0,148

3* 0,9 0,052

4 2 0,254

4* 2 0,088

5 3,8 0,393

5* 3,8 0,253

6 4,5 0,412

6* 4,5 0,271
*Muestras en presencia de inhibidor.

Con los datos de absorbancia recopilados se creó la curva de saturación graficando la abs/min en
función de la concentración del sustrato (Figura 5A). También se realizó el gráfico de
Lineweaver-Burk (Figura 5B) y a partir de ajuste manual se trazó una línea de tendencia con la
cual se extrajo los puntos 1/Vmax y -1/Km para calcular los valores Km y Vmax, siendo 5,6 mM y 0,2
Abs/min respectivamente para la muestra control, mientras que Km app es 5,6 mM y la Vmax app
es 0,1 Abs/min para las muestras con inhibidor.

Análisis de resultados
Con la ecuación de la recta obtenida en la curva de calibración para ONF realizada en prácticos
anteriores se calcula la actividad enzimática (U/ml) de cada muestra siguiendo el mismo
procedimiento que en el informe “Curva de saturación de la lactasa”, se tabulan estos resultados
junto a la concentración de ONFG y su absorbancia correspondiente (Tabla V).

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 Tabla V. Absorbancias medidas a 420 nm para muestras con y sin presencia de inhibidor.

Muestra [ONFG] (mM) Abs 420 nm Act. enzimática (U/ml)

1 0 0,001 0

1* 0 0,002 0

2 0,4 0,066 0,076

2* 0.4 0,028 0,021

3 0,9 0,148 0,196

3* 0,9 0,052 0,056

4 2 0,254 0,351

4* 2 0,088 0,109

5 3,8 0,393 0,555

5* 3,8 0,253 0,350

6 4,5 0,412 0,582

6* 4,5 0,271 0,376

*Muestras en presencia de inhibidor.

Dividiendo los valores de absorbancia por el tiempo de incubación se obtienen las velocidades, las
cuales es posible graficar en función de la concentración de ONFG (mM) (Figura 1).

Figura 1. Curva de saturación de velocidad de reacción (Abs/min) en función de la concentración de ONFG (mM). En
negro la muestra control y en naranjo muestra con inhibidor.

Luego, con el gráfico de dobles recíprocos que sigue la ecuación de Lineweaver-Burk, es posible
calcular Vmax, Km, Vmax app y Km app obtenidos experimentalmente en este práctico (Figura 2).
Para el caso de la recta con inhibidor se realizó un ajuste para obtener un valor de R2 confiable.

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Figura 2. Gráfico de dobles recíprocos. En naranja se muestra la gráfica en presencia de inhibidor y en negro la gráfica
control, ambas con su correspondiente ecuación de la recta y su valor de R2.

Como la ecuación de Lineweaver-Burk y la ecuación de la recta, obtenida al graficar los dobles

1
recíprocos en excel, son de la forma y = mx + n, se puede igualar n a 𝑉𝑚𝑎𝑥
, y despejar Vmax:
1 1
𝑉𝑚𝑎𝑥
= 𝑛 → 𝑉𝑚𝑎𝑥
= 5, 2396

𝑉𝑚𝑎𝑥 ≈ 0, 2 𝐴𝑏𝑠/𝑚𝑖𝑛
Obteniendo que la velocidad máxima es igual a 0,2 abs/min, para el control. Realizando el mismo
procedimiento para la muestra con presencia de inhibidor se obtiene una Vmax app de 0,5
Abs/min. Luego, con el valor de la pendiente de la ecuación de la recta del gráfico y la Vmax
calculada antes, se puede calcular el valor de Km con la pendiente de la ecuación
Lineweaver-Burk.
𝐾𝑚
𝑚= 𝑉𝑚𝑎𝑥
𝐾𝑚
27, 862 = 0,2
𝐾𝑚 ≈ 1, 9 𝑚𝑀
Obteniendo que Km es igual a 1,9 mM para la muestra control, mientras que la recta con inhibidor
nos da que la Km app es de 43,9 mM.

Discusión
A partir de la primera actividad se determinó que la concentración adecuada de inhibidor para
realizar luego la curva de saturación es de 0,4 ml del mismo, debido que con esta cantidad de
inhibidor la actividad enzimática disminuye aproximadamente a la mitad como se observa en el la
figura 4 del anexo, es decir, es aproximadamente el IC50 del inhibidor.

Desde la curva de saturación es posible observar la relación entre la concentración del sustrato
ONFG (mM) y su velocidad (Abs/min). En esta gráfica, cuando los datos alcanzan una meseta, en
la que la velocidad no aumenta significativamente con un aumento de [S], se infiere que se ha
alcanzado la velocidad máxima (Nelson y Cox, 2015). Si bien la curva control y la con inhibidor
siguen el comportamiento esperado para este tipo de gráfica, no es posible observar que ambas
curvas logren alcanzar la velocidad máxima, la cual es posible de reconocer al formarse una
asíntota. Por tanto, se puede deducir que las concentraciones de sustrato no fueron suficientes
para saturar a la lactasa.

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Respecto a los parámetros cinéticos calculados a partir del gráfico de dobles recíprocos, para el
gráfico realizado durante el laboratorio, el que se muestra en la figura del anexo, el inhibidor
obtenido fue uno no competitivo al mantenerse Km y disminuyendo Vmax, pero luego del
tratamiento de datos resultó ser un inhibidor competitivo. La razón por la cual se obtuvo un
inhibidor no competitivo de manera inicial probablemente se deba a que el ajuste manual no sea el
más correcto, además de que la línea de tendencia está muy influenciada por el último punto, el
cual es de una concentración menor y por lo tanto tiene una tendencia a presentar errores
mayores, entonces se quitó el último punto a la gráfica de dobles recíprocos en presencia del
inhibidor para tener un ajuste más confiable, considerando el valor de R2.

Como un inhibidor competitivo se une de manera reversible al sitio activo, es posible revertir la
dirección de la reacción al aumentar la concentración de sustrato, disminuyendo la probabilidad de
que la enzima se una al inhibidor, obteniendo así una Vmax normal. Por otro lado, como se ve
modificada la concentración de sustrato donde se obtiene ½ Vmax, se observará que la Km
aparente aumenta en presencia del inhibidor ya que su presencia hace que la concentración de
sustrato parezca menor de lo que es en realidad y por lo tanto que Km parezca mayor de lo que
es en realidad (Voet, Voet y Pratt, 2007). Este efecto sobre la Km aparente combinado con la
ausencia de efecto sobre Vmax es diagnóstico de inhibición competitiva, y se pone en manifiesto
fácilmente en una gráfica de dobles recíprocos (Nelson y Cox, 2015). Esta situación es la que se
logra observar en la Figura 2. Lo observado en la gráfica es confirmado al calcular los parámetros
cinéticos a partir de las ecuaciones de la recta para cada situación, donde las Vmax son muy
parecidas pero Km y Km aparente difieren enormemente.

El resultado de inhibidor competitivo fue corroborado por los docentes, donde se menciona que
este corresponde a la galactosa. La galactosa es uno de los productos de la reacción enzimática
por lo que puede unirse al sitio activo de la enzima y competir por el contra del sustrato. Entonces,
finalmente se tiene que la reducción de la actividad enzimática es resultado de una inhibición por
producto.

Cuestionario
1. ¿De qué factores depende el grado de inhibición alcanzado por un inhibidor competitivo?
El grado de inhibición alcanzado por un inhibidor competitivo depende de la cantidad de enzima
que se une al inhibidor (Voet, Voet y Pratt, 2007) lo cual depende a su vez de Ki como se muestra
en el siguiente esquema:

Figura 3. Diagrama de inhibición competitiva.

Cuando la enzima libre se une al inhibidor forma el complejo EI que es inactivo y su formación
genera una disminución en la velocidad de reacción. De la misma manera, la cantidad de inhibidor
que se une a E depende de Ki que corresponde a la afinidad del inhibidor por la enzima, mientras
más pequeño sea el valor de Ki la inhibición es más potente porque la unión entre la enzima y el
inhibidor es más fuerte. Por tanto, si se presenta un Ki pequeño el inhibidor presenta una gran

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afinidad por la enzima y se unirá con más fuerza a ella produciendo más fácilmente, y por
consiguiente en mayor cantidad, el complejo EI inactivo y la velocidad de la reacción será menor.

Por otra parte, la concentración de inhibidor y sustrato que se encuentran presentes también
determinan en parte el grado de inhibición que se alcanzará, ya que si se presenta una mayor
cantidad de un componente sobre otro se desplazará la reacción por ley de acción de masas
produciendo que esta se vea favorecida en la formación del complejo ES o EI según corresponda.

2. ¿Cómo podría calcular la Ki de un inhibidor no competitivo clásico?

El valor de Ki puede determinarse a partir de gráficos secundarios derivados del gráfico de dobles
α𝐾𝑚
recíprocos. En un gráfico de 𝑉𝑚𝑎𝑥
, que corresponde a la pendiente del gráfico de dobles
recíprocos, en función de la concentración de inhibidor o en un gráfico de la Km aparente en
función de la concentración de inhibidor, la intersección con el eje de las abscisas corresponde a
-Ki, entonces a partir de este valor se puede calcular Ki.

3. ¿Qué efecto tiene el aumento de la concentración de sustrato sobre la inhibición no

competitiva de una reacción enzimática? ¿Cómo puede explicar este fenómeno?
El aumento de la concentración del sustrato revierte la inhibición, ya que si la concentración de
sustrato sobrepasa la concentración del inhibidor por ley de acción de masas la reaccion tenderá a
la formación del complejo ES y por consiguiente a la disociación del complejo EI, de esta manera
a concentraciones muy altas de sustrato toda la enzima se encuentra como complejo ES y no se
ve afectada la velocidad máxima de la reacción, lo que se evidencia en el diagrama de más arriba.

Conclusiones
● El IC 50 indica una concentración inhibitoria a la cual es posible apreciar los efectos del
inhibidor sobre Km y Vmax
● Construir curvas de saturación y gráficas de dobles recíprocos en ausencia y presencia de
inhibidor permiten el reconocimiento del tipo de inhibición observada por medio del cálculo
de los parámetros cinéticos asociados.
● El inhibidor utilizado en la experimentación resultó ser competitivo lo que se ve respaldado
al ser a un producto de la reacción y por las alteraciones que genera en la Km y Vmax.
● Inhibidor competitivo altera sólo la Km porque al competir por el sitio activo el inhibidor y el
sustrato parte de la enzima se une al inhibidor generando que parezca que hay menos
concentración de sustrato presente, provocando que la concentraciones de sustrato con la
cual se alcanza la mitad de la velocidad máxima aumenta.

Bibliografía
● Nelson, D., Cox, M. y Cuchillo, C. (2015). Lehninger principios de bioquímica . Disponible
en http://bibliografias.uchile.cl/2006
● Voet, D., Voet, J. y Pratt, C. (2007). Fundamentos de bioquímica : la vida a nivel
molecular . Disponible en http://bibliografias.uchile.cl/1058
● Berg, J. (2008). Bioquímica . Disponible en http://bibliografias.uchile.cl/1049
● Harper, H., Murray, R. y Cedillo Juárez, J. (2001). Bioquímica de Harper . Disponible en
http://bibliografias.uchile.cl/1523

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Anexo

Figura 4. Gráfica de actividad enzimática de velocidad (Abs/min) en función de volúmenes de inhibidor (mL) realizada
durante el práctico.

A) B)

Figura 5. (A) Curva de saturación de velocidad de reacción (Abs/min) en función de la concentración de sustrato (mM)
para la curva control (morado) y la curva en presencia de inhibidor (naranjo). (B) Gráfica de dobles recíprocos del

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inverso de velocidad (1/Abs/min) en función del inverso de la concentración de sustrato (1/mM) para curva control
(morado) y curva en presencia de inhibidor (naranjo).

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