TRABAJO PRÁCTICO Nº 7: PROBLEMAS DE CINÉTICA ENZIMÁTICA

Los alumnos deben repasar todos los conceptos de cinética enzimática, tanto de las clases teóricas como de los prácticos de enzimología 1, 2 e isoenzimas. Asimismo, deben practicar la resolución de problemas. Los que se incluyen en esta guía son algunos ejemplos resueltos que se discutirán en clase práctica, pero se sugiere la resolución de los otros problemas propuestos en la guía y la interpretación de los gráficos resultantes de los prácticos anteriores. Traer calculadora, papel milimetrado y otros elementos necesarios la resolución de problemas.
Problema 1: 1- Un sustrato S se transforma por una enzima, y la velocidad de desaparición se mide cada 30 seg. durante 3 min. Se preparó en tubos de ensayo una serie de seis tubos con 1.5 µg de enzima (peso mol 30,000) añadiéndose un mismo volumen de disolución de sustrato a distintas concentraciones. Los resultados están resumidos en la tabla. ¿Cuáles son las velocidades iniciales para cada tubo con distinta concentración de sustrato? Tiempo (min)
0

0.5 1 1.5 2.0 2.5 3 Conc. Inicial (µmoles ml-1)

S 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.0

1

S 0.49 1.05 1.66 2.23 2.81 3.40 2.32

2

S 0.71 1.52 2.36 3.18 4.00 4.55

Sustrato transformado (µmol) 3 4 S S 1.10 1.36 2.24 2.74 3.48 12.66 38.50

5

S 1.45 3.00 200.00

Solución: Paso 1. Corregir cada lectura sustrayendo el cambio aparente en la disolución testigo (0S) en el tiempo correspondiente.
1

S 0.4 9 0.9 5 1.4 6 1.9 3 2.4 1 2.9

2

S 0.7 1 1.4 2 2.1 6 2.8 8 3.6 -

3

S

4

1.1 2.1 4 3.2 8 -

S 1.3 6 2.6 4 -

5

S

1.45 2.90 -

Paso 2. Representar µ moles de sustrato transformado para cada concentración frente al tiempo (Figura). Trazar la mejor recta para cada serie de puntos. 1

00 x x x x x 10-3 M 10-3 M 10-3 M 10-3 M 10-3 M 1 V= 0.95 µmol min-1 2 V= 1.44 µmol min-1 3 V= 2.90 µmol min-1 Estos valores se representan unos frente a otros Velocidad inicial (µmol min-1) Conc. Estos valores serán las pendientes de las porciones lineales y serán también las velocidades iniciales.32 2 [ S] 4.55 3 [ S] 12.4 S Sustrato transformado (µmol) 5 S 3 S 2 S 1 S Tiempo (minutos) De esta figura determinar la velocidad de sustrato transformado por minuto para cada concentración de sustrato en el tramo lineal de cada curva. [1S] 2.66 [4S] 38.31 µmol min-1 4 V= 2. Sustrato (M x 103) 2 .64 µmol min-1 5 V= 2.50 [5S] 200.

1 [S] = 0.1 Vmáx Entonces [S] = 0.Problema 2: v0 = Vmáx [S] Km + [S] Utilizando la ecuación de Micaelis-Menten. se debe aumentar la [S] 81 veces.1 Km + 0. 0.1 Km 0. SOLUCIÓN Poniendo v0 = 0.9 Vmax encontramos que [S] = 9 Km.0096 a) ¿Cuál es la velocidad máxima para esta reacción? b) ¿Por qué la velocidad inicial permanece constante a una [S] mayor de 5x10-4 M c) ¿Cuál es la concentración de enzima libre para una [S] de 5x10-4 M? d) ¿Cuál es la Km de la enzima? e) Calcular la velocidad inicial para [S]=1x10-6 3 .1 [S] = 0.0.1 Km 9 [S] = Km Es decir.1 [S] [S] .9 [S] = 0.20 -6 5x10 0.25 -4 5x10 0. Poniendo entonces [S] = Km / 9 v0 = 0.25 5x10-5 0.1 Km + [S] [S] = (Km + [S]) . calcular el cambio en la [S] necesaria para aumentar la velocidad de una reacción del 10 al 90 % de la velocidad máxima.071 5x10-7 0.25 5x10-3 0. [S]90% = 9 Km = 81 [S]10% Km/9 Es decir. Problema 3: Las velocidades iniciales a varias concentraciones de sustrato para una reacción catalizada por una enzima hipotética son: [S] (moles/l) V (µmoles/min) 5x10-2 0.

01 0.2 mmoles urea consumidos mg-1 min-1. e) Sabiendo la Km y Vmax.25 µmol / 10-2 l = 1. 1/V inicial frente a 1/[S]. con los resultados siguientes: Concentración de urea (mmoles dm-3) 30 -1 -1 V inicial (mmoles urea consumidos min mg enzima ) 3.12 0. d) Empleando la ecuación de Michaelis.02 3 0.03 -1 0.y [S]=1x10-1 f) Calcular la concentración de producto formado en los cinco primeros minutos de reacción utilizando 10 ml de una disolución de sustrato 2x10-3 M. todos los enzimas ocupados.25 µmol. obtenemos una Km 0 1. y obtenemos: V = 0.25 µmol/min.24 0.25 x 102 µmol/l Problema 4: Se estudió la actividad de la enzima ureasa.25 µmol/min. a esa [S] se da la Vmax. Tenemos 10 ml de sustrato. como sabemos la Vmax. que cataliza la reacción: CO(NH2)2+H2O <=> CO2+2NH2 en función de la concentración de urea. b) Porque todos los enzimas está ocupados transformando un sustrato.25 x 10-5 moles/l. luego 1. aunque existen otras formas de linealizar que no son motivo de nuestro estudio). La gráfica de la doble inversa se indica en la Figura. ya que por encima de [S] de 5x10-4 no aumenta.70 400 12.018 µmol/min y V = 0. Observar la distribución de los puntos y tener presente cuando se eligen los valores adecuados para la concentración de sustrato al planificar un experimento.04 0. 60 5.20.18 0.04 1/[urea] (dm mmoles ) Ejemplo resuelto de acuerdo con el método de doble inversa o de Lineweaver-Burk.070 ó 0.30 1/Vinicial (mg min mmoles ) -1 0. SOLUCIÓN a) Vmax = 0. 0.00 0.06 0. Problema 5: 4 .0096 y sus correspondientes [S]. De la gráfica se puede calcular que Km es 105 mmoles dm-3 y la Vmáx es 15.42 150 8. c) Cero. aplicamos Michaelis utilizando esas [S].00 0. f) A [2x10-3] la V = Vmax = 0.25 µmol/min. utilizando la velocidad 0.53 100 7. En 5 min 0.94 250 10.25 x 5 = 1.37 ¿Cuáles son los valores de Km y Vmáx para esta reacción? SOLUCIÓN Los datos se ordenan en la forma adecuada para una gráfica lineal (por ejemplo.

14 0. obteniéndose los siguientes resultados Concentración de sustrato (mmol L -1) Concentración del inhibidor (mmol L -1) 0 0.40 0.63 0.67 0.5(mmol L -1) de inhibidor y Km=0.5 1.71 0.20 0. y Km. Km=0.0 Velocidad de reacción ν0 (µmol L -1 min-1) 0.67 0.10 0.Se investigó el efecto de un inhibidor I sobre la velocidad de una reacción catalizada enzimáticamente sobre un solo sustrato.25 0.50 0.40 0.1 (mmol L -1) sin ihnhibidor.20 0.57 0.5 1/Vmáx [I ] 0 (mmol L-1) [I ] 0.2(mmol L -1) con 0.50 A) ¿De que manera actúa el inhibidor? B) Obténgase los valores para Vmáx.50 0.80 0.33 0.0 (mmol L-1) 0 -15 -10 -5 0 5 10 -1 -1 15 20 25 -1/Km 1/[S] 0 [(mmol L ) ] Gráfica de Lineweaver-Burk del efecto de un inhibidor A partir de la gráfica se puede observar que la pendiente de las curvas se modifica con los cambios en la concentración del inhibidor pero no la intersección en el eje 1/ ν0 (1/Vmax). Por ello los datos anteriores indican que el inhibidor I está actuando como un inhibidor competitivo. SOLUCIÓN A) La manera más sencilla de deducir cómo actúa un inhibidor es graficar 1/ν0 en función de 1/[S]0 para cada concentración del inhibidor. 8 7 1 1/ν 0 (µ mol L -1 min-1 ) 6 5 4 3 2 1 0 0.33 0. B) De la intersección en el eje 1/ν0 se puede estimar Vmax= 1(µmol L -1 min-1) y de la intersección con el eje 1/[S]0 los valores de Km=0.05 0.83 0.3 (mmol L -1) con 1(mmol L-1) 5 .5 (mmol L-1) [I ] 1.

ensayado siempre bajo idénticas condiciones en 1 ml de volumen total incluyendo 0. o a especies distintas de la enzima propias de cada órgano.5x103 µg/h y Km = 5 mM.23 0. PROBLEMAS PARA RESOLVER Problema 7: Calcular qué velocidad se obtendrá en una reacción enzimática si la velocidad máxima es igual a 100 y la concentración de sustrato es a) 10 Km b) Km/3. Si la velocidad media para esta reacción con una concentración de sustrato de 5·10 -2 M fue 0.Problema 6: A partir de los siguientes datos de una reacción enzimática. calcular la velocidad inicial en el caso anterior. Sol.14 0. Con inhibidor: Vmax es la misma y Km=9 mM. producto sin inhibidor y producto con inhibidor y se representa. Sin inhibidor: Vmax = 0. [S] mM µg producto/h µg producto/h (sin inhibidor) (6 mM inhibidor) 2 139 88 3 179 121 4 213 149 10 313 257 15 370 313 SOLUCIÓN Se calculan los inversos de [S] y de v.: 0.39 0.: los valores de Km son los mismos Problema 10: La fructosa difosfatasa (que cataliza la hidrólisis de la fructosa difosfato a fructosa-6-fosfato y fosfato) es inhibida por AMP.107 µmol/min Problema 9: Se detectó actividad de una determinada enzima en extractos de hígado y cerebro. Sol.14 5 0. se llevaron a cabo estudios cinéticos con distintos sustratos.: a) 91 %. Sol.128 mmoles/min.085 2 0. determinar de que manera está actuando el inhibidor. Para dilucidar si la actividad detectada era atribuible a la misma enzima presente en ambos órganos. b) 25% Problema 8: Una enzima cuya Km es 2. Los siguientes datos se obtuvieron a partir de un estudio de la enzima del hígado de rata: FDP (µmoles ml-1) 4 6 10 20 40 6 .4 · 10 -4 M se ensaya con una concentración de sustrato de 2·10 -7 M.1 ml de extractos de cada órgano.30 Den las características de la enzima que puedan ser determinadas a partir de estos datos. Determinar la Km y la velocidad máxima.23 10 0. Uno de los sustratos. resultó ser transformado a las siguientes velocidades iniciales: Concentración de sustrato Velocidad (µmoles/min) (µmoles/ml) Hígado Cerebro 1 0. y muéstrese cuáles de ellas son de interés en relación con la cuestión de la identidad de las dos enzimas.50 0.

Mx10-5 0.125 0.1x10-5 M 7 .00 0.20 V(mmol P/ min) 1.01 M sustrato.102 µ moles ml-1 min-1 Problema 11: Una determinada enzima cataliza la reacción A ↔ B. se decidió hacer un estudio estructural y cinético de dicha enzima: [A] mM 1.1 Solución: Se calcula siguiendo el mismo procedimiento que el problema 4 a) Vmax = 50 µmol/min b) Vmax’ = 9. ¿Qué velocidad inicial se esperaría para pH 5.5 a) Calcular la Km y la Vmax en presencia y ausencia de inhibidor b) Que tipo de inhibidor es? 3.41 0. Por otra parte.66 mmol P/min b) KM = 0.0 V(µmol/min) sin inhibidor 10. Vmáx sin inhibidor 0.010 0.059 0.20 donde J es un inhibidor de E cuya influencia como tal se quiere estudiar.083 Comentar estos resultados en relación a las constantes cinéticas en cada caso.101 0.25 mM (con inhibidor) (Inhibición Competitiva) Problema 13 La cinética de una enzima viene determinada como función de la concentración de sustrato en presencia y ausencia del inhibidor I.1 2.3 0. Sol.25 0.66 0.: Km 8 µ moles ml-1. Sol.25 0.185 µ moles ml-1 min-1.008 Km (M) 0.002 0. b) Que tipo de inhibidor es J? c) Cuál sería el efecto sobre la Vmax de la enzima.000 5 6 7 8 9 pH Habiéndose conseguido aislar de Salmonella typhimurium una enzima (E) que cataliza la reacción A→P. Se ha observado previamente que la Vmáx de esta reacción no varía dentro de un rango de pH entre 5 y 9: Vmáx= 100 µmoles/min/µg de enzima.5 mM c) KM’ = 1. y Vmax para la transformación A--P en presencia de E. y 1 µg de enzima.043 0.5 22. [J] = 0.0 33.55 0. la Km varía según se muestra en esta figura: El ensayo fue realizado en presencia de 0.8 6.: Para pH 5.AMP (µmoles ml-1) Velocidad inicial (µmoles ml-1 min-1) 0 0.00 0.5 µmol/min c) KM = 1. [S].4 14.006 0. a) Calcular la Km de la enzima estudiada para A.5 V(µmol/min) con inhibidor 10-4 M 2.004 0.056 0. un aumento de la concentración de J? Solución: Se calcula siguiendo el mismo procedimiento que el problema 4 a) Vmax = Vmax’ = 1.0 40.25mM.071 0.034 0.150 8 0.8 9.5 8.5: 50 µ moles/min/µ g de enzima Para pH 8: 100 µ moles/min/µ g de enzima Problema 12: 0.076 0.5 y 8? Explique.71 0.9 4. Vmáx con inhibidor 0.50 0.41 V (nmol P/min) con J 0. en cada uno de los bufferes.5 1.

Problema 22 Una reacción enzimática se lleva a cabo a diferentes concentraciones de sustrato en ausencia y presencia de dos inhibidores diferentes: [Ia] = [Ib] = 1.67 2.5x10-3 M.86 4.2 1.22 3.01M. Problema 16 Una enzima se ensayo con una [S] inicial de 2.62 0.8 1.1 3. No Competitiva Problema 14 ¿Qué relación numérica existe entre Km y [S] cuando una reacción enzimática alcanza el 87 % de la Vmax? Problema 15 100 ug de una enzima a 25 °C descomponen en 10 min el 1% de un sustrato 0.5 mM.2x10-6 M? Problema 21 Calcular Km y Vmax de una enzima sabiendo que la recta obtenida en una representación de Lineaweaver y Burk corta el eje de ordenadas en 5x103 (moles/min)-1. Si la Km para el sustrato es 5x10 -3 M.2 0. Problema 20 Una enzima cataliza una reacción a una velocidad de 35µmoles/min cuando la concentración de sustrato es 0.d) Inh. y que la pendiente de dicha recta es 120 min/L. La siguiente tabla muestra los datos obtenidos: [S] (mM) v (µmol/min) v (Ia) (µmol/min) v(Ib) (µmol/min) 0.43 2.16 0.08 3. Si la concentración de alcohol en el medio de reacción es de 59. Problema 17 Una enzima cataliza una reacción con una velocidad máxima de 5 µmoles por minuto.44 6. calcular la Vmax y la cantidad de producto formado en 10 min de reacción.10 -5 M.18 2.1 M. La KM para el sustrato es 2x10 -5 M.81 8 .8 µg/ml.5 mM.63 1. La misma cantidad de enzima descompone en 1 min el 10% de un sustrato 10 -3 M. Si la ponemos en presencia de una concentración 500 mM de sustrato.15 7. Problema 19 Calcular que velocidad se obtendrá en una reacción enzimática si la velocidad máxima es igual a 100 y la concentración de sustrato es igual a) 10 Km y b) Km/3. ¿Cuál será la velocidad inicial a las concentraciones de sustrato: a) 3. ¿Qué proporción de enzima estará libre y que proporción estará combinada con el sustrato? (PM etanol 46 g/mol). ¿Qué cantidad de sustrato se logrará transformar en 10 min? Problema 18 La KM para el etanol de la enzima alcohol deshidrogenada de levadura es de 1. en 6 min la mitad del sustrato había reaccionado. siendo su Km para el sustrato de 0.6 3. Calular Vmax y ctividad específica de la enzima. c) 2x10-4 M.48 5.4 0. d) 2x10-6 M y e) 1.83 1. b)4x10-4 M.3x10 -2 M.

corta el eje de las abscisas en -40 Litros/mol? Problema 26 La Km para el etanol de la enzima alcohol deshidrogenada de levadura es de 1.3 80 74. pero con distintas concentraciones iniciales de sustrato obteniéndose las velocidades iniciales que se indican [S] x10-3 (mM) v (nmol/min) 303 120 149 98 128 92. convenientemente extrapolada. ¿Qué proporción de enzima estará libre y que proporción estará combinada con el sustrato? (PM etanol 46 g/mol) 9 .000 0.6 Determine la Km y Vmax y exprese también la cantidad de enzima en UI/mL. Si la concentración de alcohol en el medio de reacción es de 59. b) ¿Qué tipo de inhibidor es Ia e Ib? Problema 23 25 µL de una preparación de Ribonucleasa A se lleva a ensayo a un volumen de reacción estándar de 1 mL y a temperatura y pH óptimos.8 µg/ml. Problema 25 1.588 Determine la Km y Vmax.500 0.417 0.3x10 -2 M.a) determinar todos los parámetros cinéticos de la enzima.252 ¿Qué información puede obtenerse a partir de una representación gráfica del método de Lineaweaver & Burk cuando la recta obtenida.370 0. Problema 24 La descarboxilación enzimática de β-cetoácido procede con las velocidades iniciales para las concentraciones que se citan: [cetoácido] (mM) 2.6 100 83.250 0.500 v (µmol CO2/2 min) 0.714 0.526 0.

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