Para el cálculo de las actividades enzimáticas, lo primero que hay que hacer es las gráficas de

actividad de cada fracción.

Recuerden que hay que graficar Abs vs t (min), y de acuerdo a las gráficas, se escogen las
zonas lineales. Calculen la pendiente de cada trazo, sólo con los puntos lineales. Ya que tengan la
pendiente, hay que calcular la ACTIVIDAD ENZIMÁTICA. El primer paso para calcular la actividad es
transformar el dato de absorbancia/min (es decir, la pendiente de la gráfica) a unidades de
concentración/min. ¿Cómo cambiamos abs a conc? Usando la ley de Lambert y Beer! Si sabemos
que el coeficiente de extinción molar del NADH es 6220 M-1 cm-1, podemos calcular la velocidad de
la reacción (Vr):

𝑚 (𝑎𝑏𝑠⁄min )
𝑉𝑟 =
6220 (𝑀−1 𝑐𝑚−1 ) ∗ 1 𝑐𝑚

Este cálculo nos devuelve el ritmo de cambio de [NADH] en M/min. Sin embargo, hay que
considerar la cantidad real de enzima añadida a la celda, con todo y su factor de dilución. Por lo
tanto, para tener el dato de Actividad Enzimática (AE), hay que hacer el siguiente cálculo:
𝑉𝑟 ∗ 𝑉𝑜𝑙𝑅 ∗ 𝐹𝐷
𝐴𝐸 =
𝑉𝑜𝑙𝐸
Donde

VolR: Volumen de reacción en la celda (1 ml)

FD: Factor de dilución. Por ejemplo, si diluyeron la muestra 1:100, el factor de dilución es 100. Si
no diluyeron la muestra y la pusieron directo en la celda, el FD es 1

VolE: Volumen añadido de enzima (0.005 ml)

Finalmente, si multiplicamos el valor de AE por el volumen total de muestra (en ml),

tendremos el dato de Actividad Enzimática Total (AET). Recuerden que cada fracción tenía su
volumen: el Extracto Crudo tenía alrededor de 20 ml, los precipitados entre 2 y 3 ml, el desalado era
0.6 ml y las fracciones de cromatografía como 0.05-0.1 ml (ustedes deben tener el dato exacto de
volumen de cada fase de purificación, usen su dato). Nota: si transformamos las unidades de
concentración de “M” a “mmol/ml” (unidad equivalente a la anterior), podemos escribir la unidad
de AET como “mmol/min”.

Lo único que resta es calcular la Actividad Enzimática Específica (AEE), pero por ahora no
podemos hacerlo porque nos falta el dato de la cantidad de proteína, mismo que vamos a obtener
con el Bradford. De todas formas les adelanto que la AEE se calcula dividiendo AET entre la cantidad
de proteína en mg de cada fracción, de manera que las unidades de AET quedarán como
mmol/(mg*min)