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Universidad de San Carlos de Guatemala Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacia Escuela de Qumica Biolgica Departamento de Bioqumica Bioqumica I, QF,

BB Resolucin hoja de trabajo Cintica e inhibicin enzimtica Instrucciones En parejas resolver cada uno de los problemas planteados. Entregar la resolucin al finalizar el perodo de clase en el cubculo de instructores de Bioqumica. 1. La enzima lactato deshidrogenasa permite la conversin de piruvato en lactato en presencia del cofactor NADH + H, el cual se oxida formando NAD+. En un laboratorio se determinaron algunas constantes cinticas de la lactato deshidrogenasa a condiciones experimentales, observndose que a una concentracin de sustrato ([S]) de 0.01 M la velocidad inicial (Vo) de reaccin es de 35 mM/s y el valor de Km es de 2.46 mM. En base a los datos proporcionados determine: a. La velocidad mxima de la reaccin (Vmax). Vmax = 43.61 mM/s b. Vo cuando [S] es de: 18 mM y 0.034 M. Vo con [S] 18 mM = 38.37 mM/s Vo con [S] 0.034M (34mM) = 40.66 mM/s

2.

En un laboratorio de alimentos se determin la actividad enzimtica de la amilasa presente en el germen de trigo a condiciones experimentales. El principal inters de los investigadores era determinar el comportamiento de la enzima cuando se enfrenta a diferentes concentraciones de sustrato. Los resultados obtenidos se reflejan en la siguiente tabla: Concentracin de almidn (mM) 6.25 * 10-6 4.5 * 10-5 1 * 10-4 1 * 10-3 1 * 10-2 Vo (mM/s) 35.12 56.25 60.03 74.91 76.02

Determine los valores de Km y Vmax para la amilasa a condiciones experimentales. S (mM) 6.25E-06 4.50E-05 1.00E-04 1.00E-03 1.00E-02 Vo (mM/s) 35.12 56.25 60.03 74.91 76.02 1/S 1.60E+05 2.22E+04 1.00E+04 1.00E+03 1.00E+02 1/Vo 0.0284738 0.0177778 0.0166583 0.0133494 0.0131544

Amilasa
0.035 0.03 0.025 0.02 0.015 0.01 0.005 0 0.00E+00 5.00E+04 1/S 1.00E+05

y = 9E-08x + 0.014 R = 0.957

-5.00E+04

1/Vo

1.50E+05

2.00E+05

Vmax = 71.43 mM/s Km 6.42 E -06

3.

Una enzima cuyos valores cinticos son: Km = 2 * 10-4 mM y Vmax = 55 mM/s, se hace reaccionar a una concentracin de sustrato de 3 * 10-2 mM y en presencia de un inhibidor competitivo ([I] = 2.5 * 10-3 mM; Ki = 1.5 * 10-3 mM). Calcule la Vo en presencia de inhibidor competitivo a las concentraciones de sustrato e inhibidor dadas. Calcular primero el valor de con los datos del inhibidor = 2.67 Con el valor de calcular el valor de Km (Km aparente) Km = 5.33 E-04 mM Luego incluir esos datos en la frmual de Michaelis y Mentel, modificada para inhibicin competitiva. Vo = 5.40 E+01 mM/s Para estudiar la gluclisis en un microorganismo fermentador de glucosa se decidi analizar la actividad de la enzima hexoquinasa (primera enzima de la gluclisis), en presencia de un inhibidor. En la tabla siguiente se presentan los datos obtenidos: Concentracin de sustrato (M) 0.3 * 10-3 0.5 * 10-3 1 * 10-3 3 * 10-3 9 * 10-3 Vo (mM/s) Inhibidor 5 * 10-3 mM 4.1 6.4 11.3 22.6 33.8

4.

Inhibidor 0 mM 10.4 14.5 22.5 33.8 40.5

Pasar todos los datos a la misma dimensional y establecer los valores de los inversos. S (mM) 3.00E-01 5.00E-01 1.00E+00 3.00E+00 9.00E+00 Vo mM/s I=0 I = 5mM 10.4 4.1 14.5 6.4 22.5 11.3 33.8 22.6 40.5 33.8 1/S 3.33E+00 2.00E+00 1.00E+00 3.33E-01 1.11E-01 Vo mM/s 1/Vo no I 1/Vo con I 0.096153846 0.2439024 0.068965517 0.15625 0.044444444 0.0884956 0.029585799 0.0442478 0.024691358 0.0295858

a. Calcule los valores de Km y Vmax de la hexoquinasa sin inhibidor.

Sin inhibidor
0.12 0.1 0.08 1/Vo 0.06 0.04 0.02 0

y = 0.022x + 0.022 R = 0.998

0.00E+00 5.00E-01 1.00E+00 1.50E+00 2.00E+00 2.50E+00 3.00E+00 3.50E+00 1/S

Vmax = 45.45 mM, Km = 1 mM b. Calcule los valores de Km y Vmax en presencia de inhibidor.

Con inhibidor
0.3 0.25 0.2 1/Vo 0.15 0.1 0.05 0

y = 0.066x + 0.022 R = 1

0.00E+00 5.00E-01 1.00E+00 1.50E+00 2.00E+00 2.50E+00 3.00E+00 3.50E+00 1/S

Vmax = 45.45 mM, Km = 3 c. Qu tipo de inhibicin se observa? Explique. Inhibicin competitiva ya que se observa el mismo valor de Vmax en presencia y ausencia del inhibidor, y nicamente se determina variacin en el valor de Km a medida que se evala el efecto del inhibidor. d. Calcule el valor de Ki. Es necesario determinar primero el valor de = Km(con inhibidor) / Km (sin inhibidor) =3 Luego determinar el valor de Ki tomando el cuenta el valor de Km Ki = 2.5 mM

Frmulas Michaelis y Mentel Vo = Vmax [S] Km + [S] Lineweaver Burk (dobles recprocos) 1 = Km 1 + 1 . Vo Vmax [S] Vmax

Inhibicin competitiva Vo = Vmax [S] Km + [S] = 1 + [I] . Ki Ki = [E] [I] [EI] 1 = Km 1 + 1 . Vo Vmax [S] Vmax

Inhibicin acompetitiva Vo = Vmax [S] Km + [S] ' = 1 + [I] . Ki Ki = [ES] [I] [ESI] 1 = Km 1 + . Vo Vmax [S] Vmax