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Saúl Uriel Corona Bautista Problemas de cinética Enzimática

1. El profesor Thomas Charles quiere conocer la cinética de reacción de la enzima nibblasa, la


cual cataliza un paso de la hidrólisis de nucleótidos de la cadena opuesta del DNA de doble
cadena. Para llevar a cabo la reacción sin destruir todo su DNA, él incuba una serie de mezclas
de reacción, conteniendo la misma cantidad de enzima y diferente concentración de DNA.
Variando el tiempo toma una muestra de cada mezcla, precipita el DNA con ácido
tricloroacético y determina los picomoles (moles x10-12) de nucleótidos libres que han sido
liberados a la solución. Sus datos son los siguientes

[DNA] Nucleótidos libres en solución


(mol de nucleótidos/L) (pmol)
0 min 10 min 20 min 60 min
1.0 x 10-5 0.05 5.1 9.8 30
1.0 x 10-6 0.04 5.0 9.6 28
1.0 x 10-7 0.06 4.1 8.1 25
1.0 x 10-8 0.04 1.4 2.9 8.5
1.0 x 10-9 0.04 0.23 0.42 1.2

La reacción sigue una cinética del tipo de Michaelis-Menten?


Calcule la velocidad máxima de la reacción en picomoles por minuto
Calcule la Km de la enzima nibblasa con DNA de doble cadena
[DNA] (pmol de nucleótidos/L) Nucleotidos libres en solución (pmol) V pmol/min
0 min 10 min 20 min 60 min
1.00E+07 0.05 5.1 9.8 30 0.5
1.00E+06 0.04 5 9.6 28 0.48
1.00E+05 0.06 4.1 8.1 25 0.41
1.00E+04 0.04 1.4 2.9 8.5 0.14
1.00E+03 0.04 0.23 0.42 1.2 0.021

Si sigue la cinetica de Michaelis-Menten


Vmax= 0.5 pmol/min
Km= 305 pmol

0.6

0.5

0.4

0.3
V

0.2

0.1

0
-1.00E+04 1.00E+04 3.00E+04 5.00E+04 7.00E+04 9.00E+04 1.10E+05 1.30E+05 1.50E+05
[S]
2.-Se prepararon diez mezclas de reacción, cada una conteniendo la misma concentración de
enzima, pero diferentes concentraciones de sustrato, a las cuales se les determinó su velocidad
inicial, obteniendo los datos que se muestran a continuación. Empleando la ecuación de
Lineweaver-Burk, determine gráficamente la Vmax y la Km de la reacción.

a) Discuta cuál es el rango de las concentraciones de sustrato más útil para estas
determinaciones
b) Con los mismos datos emplee el trazo directo y compare los valores.
c) ¿Cuáles son las ventajas del trazo directo comparado con el de Lineweaver-Burk?

[S] (mol/L) V (mol/min) 1/[S] 1/V Lineweaver-Burk


1.00E-03 6.50E-05 1.00E+03 1.54E+04 Km= 0.58 mol/L
5.00E-04 6.30E-05 2.00E+03 15873 Vmax= 0.00011 mol/min
1.00E-04 5.10E-05 1.00E+04 19607
5.00E-05 4.20E-05 2.00E+04 23810
3.00E-05 3.30E-05 100000/3 30303
2.00E-05 2.70E-05 5.00E+04 37037
1.00E-05 1.70E-05 1.00E+05 58823
2.00E-06 9.50E-06 5.00E+05 105263 A) El rango mas util son los primeros valores
1.00E-06 2.20E-06 1.00E+06 454545 C) Es mejor el trazo con valores directos ya que no hay
5.00E-07 1.10E-06 2.00E+06 909090 necesidad de omitir valores de sustrato para los calculos

40000

35000
y = 5302.4x + 9418.8
30000

25000
1/V

20000

15000

10000

5000

0
0 1 2 3 4 5 6
1/[S]
7.00E-05

6.00E-05

5.00E-05

4.00E-05

3.00E-05

2.00E-05

1.00E-05

0.00E+00
0.00E+00 2.00E-04 4.00E-04 6.00E-04 8.00E-04 1.00E-03 1.20E-03
3.-Se prepararon cinco mezclas de reacción conteniendo concentraciones iguales de una enzima
que se mezcló con las concentraciones de sustrato indicadas en la siguiente tabla. El experimento
incluía otro juego de reacciones en presencia de un inhibidor de la enzima, el cual se adicionó en
una concentración de 2.2x10-4 M en cada mezcla de reacción.

a. Mediante el trazo de Lineweaver-Burk determine gráficamente la Km para el sustrato.


b. Determine la Vmax en la ausencia y presencia del inhibidor y la KI para el inhibidor. Indique
de que tipo de inhibidor se trata?

[S] (mol/L) En ausencia de Inhibidor Inhibidor presente


V (mol/min) V (mol/min)
1.0 x 10 –4 28 17
1.5 x 10 –4 36 23
2.0 x 10 –4 43 29
5.0 x 10 –4 65 50
7.5 x 10 –4 74 61

En ausencia Inhibidor En ausencia Inhibidor En ausencia Inhibidor


[S] (mol/L) 1/[S]
de Inhibidor presente de Inhibidor presente de Inhibidor presente
V V V V
1/V 1/V
(mol/min) (mol/min) (mol/min) (mol/min)
–4
1.0 x 10 28 17 2.80E-05 1.70E-05 10000 35714 58824
1.5 x 10 –4 36 23 3.60E-05 2.30E-05 6667 27778 43478
2.0 x 10 –4 43 29 4.30E-05 2.90E-05 5000 23256 34483
–4
5.0 x 10 65 50 6.50E-05 5.00E-05 2000 15385 20000
–4
7.5 x 10 74 61 6.10E-05 6.10E-05 1333 13514 16393
Sin inhibidor Con inhibidor
Km=0.00025 mol/L Km= 0.56 mol/L
Vmax= .000097 mol/min Vmax= 0.000099 mol/min
KI= 0.9999
Es un inhibidor competitivo
70000

60000 y = 4.9075x + 10098

50000

40000

Inhi. Ausente
inhibidor presente
30000

20000 y = 2.5717x + 10271

10000

0
-2000 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000
4.-Haciendo un trazo lineal de los datos siguientes, los cuales fueron obtenidos de un experimento
similar al del problema anterior.
a) Indique de que tipo de inhibidor se trata.
b) ¿Qué información adicional necesitarías para determinar la KI del trazo?
c) ¿Cómo usarías tu trazo para determinar la KI (no lo calcule)?

[S] (mol/L) En ausencia de Inhibidor Inhibidor presente


V (mol/min) V (mol/min)
0.50 x 10 –4 0.42 0.17
0.67 x 10 –4 0.50 0.20
1.0 x 10 –4 0.60 0.24
1.3 x 10 –4 0.66 0.27
2.7 x 10 –4 0.80 0.32
5.3 x 10 –4 0.88 0.36

En ausencia Inhibidor En ausencia Inhibidor En ausencia Inhibidor


[S] (mol/L) 1/[S]
de Inhibidor presente de Inhibidor presente de Inhibidor presente

V (mol/min) V (mol/min) V (mol/min) V (mol/min) 1/V 1/V


–4
0.50 x 10 0.42 0.17 4.20E-07 1.70E-07 20000 2173913 5882353
–4
0.67 x 10 0.5 0.2 5.00E-07 2.00E-07 14925 2000000 5000000
–4
1.0 x 10 0.6 0.24 6.00E-07 2.40E-07 10000 1666667 4166667
1.3 x 10 –4 0.66 0.27 6.60E-07 2.70E-07 7692 1515152 3703704
–4
2.7 x 10 0.8 0.32 8.00E-07 3.20E-07 3704 1250000 3125000
–4
5.3 x 10 0.88 0.36 8.80E-07 3.60E-07 1887 1136364 2777778

7000000

6000000

5000000

4000000

3000000
y = 59.326x + 1E+06
2000000

1000000

0
0 5000 10000 15000 20000 25000

a) Es un inhibidor A competitivo
b) La concentración del inhibidor
c) Extrapolaria para encontrar interseccion en X y despejar la KI
5. La siguiente tabla indica el rango en la cual una enzima cataliza la conversión de un sustrato
siguiendo una cinética del tipo de Michaelis-Menten: 1) en ausencia de inhibidor; 2) y 3) en
presencia de una concentración de 10 mM de cada uno de dos inhibidores. Asumir que [E]T es la
misma para todas las reacciones.

[S] (1) Vo (2) Vo (3) Vo


(mM) (M.s-1) (M.s-1) (M.s-1)
1 2.5 1.17 0.77
2 4.0 2.10 1.25
5 6.3 4.00 2.00
10 7.6 5.7 2.50
20 9.0 7.2 2.86

a. Determine el valor de la Vmax y la Km para el sustrato.


b. Determine la Vmax y la Km para el sustrato en presencia del inhibidor (2)
c. Determine la Vmax y la Km para el sustrato en presencia del inhibidor (3)
d. Calcule la KI para el inhibidor (2)
e. Calcule la KI para el inhibidor (3)
f. Indique de que tipo de inhibidor se trata (2)
Indique de que tipo de inhibidor se trata (3)

[S] (1) Vo (2) Vo (3) Vo 1/[S] (1) Vo (2) Vo (3) Vo (1) 1/Vo (2) 1/Vo (3) 1/Vo
(mM) (M.s-1) (M.s-1 ) (M.s-1) (mM) (mMs-1) (mMs-1) (mMs-1) (mMs-1) (mMs-1) (mMs-1)
1 2.5 1.17 0.77 1 2.50E-03 0.00117 0.00077 400 855 1299
2 4 2.1 1.25 2 4.00E-03 0.0021 0.00125 250 476 800
5 6.3 4 2 5 6.30E-03 0.004 0.002 159 250 500
10 7.6 5.7 2.5 10 7.60E-03 0.0057 0.0025 132 175 400
20 9 7.2 2.86 20 9.00E-03 0.0072 0.00286 111 139 350

1.00E-02
9.00E-03
8.00E-03
Ausencia del inhibidor

7.00E-03
6.00E-03
5.00E-03
4.00E-03
3.00E-03
2.00E-03
1.00E-03
0.00E+00
0 5 10 15 20 25
0.008
0.007
0.006
0.005
Inhibidor A

0.004
0.003
0.002
0.001
0
0 5 10 15 20 25

0.0035

0.003

0.0025
Inhibidor B

0.002

0.0015

0.001

0.0005

0
0 5 10 15 20 25
Sin inhibidor
Vmax= 0.0085 mMs-1
Km= 2.2 mM

Con ihibidor (A)


Vmax= 0.0072 mMs-1
Km= 4.2 mM
Es un ihibidor A competitivo

Con ihibidor (B)


Vmax= 0.0029 mM s-1
Km= 2.8 mM
Es un inhibidro A competitivo