TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR: HERRAMIENTAS

DE DIAGNÓSTICO COMPLEMENTARIAS A LA
EVALUACIÓN HISTOPATOLÓGICA

Purificación de Ácidos Nucleicos

Dr. Mario A. Lorenzetti

lorenzetticonicet@gmail.com
Algo de historia
1º aislamiento de Ac. nucleicos en 1869 Friederich Miescher a partir de
glóbulos blancos en un laboratorio de la universidad Tübingen, en Alemania

Agregando
Lisis celular de sal neutraliza Agregado de
con las cargas etanol frío y
detergente negativas del dejar reposar
ADN Filtrado

Método sencillo, rápido y económico - Bajo rendimiento y pureza del ac. nuc.

-
Sentó las bases del trabajo con Ac. Nuc. - Co purificación ADN, ARN y proteína
- -
- -

Aún hoy se utiliza en docencia - NO apto para Biología Molecular

-
Objetivo

Aislamiento de ác. nucleicos mediante métodos físicos y/o químicos ¿Para qué?

Investigación Diagnostico Medicina Estudios de Mejoramiento

básica médico forense filiación agroindustrial
Objetivo
¿Para qué queremos purificar ácidos nucleicos?
Para aislarlo de otros componentes celulares e impurezas que podrían degradarlo o inhibir
determinaciones enzimáticas posteriores.
Para concentrar el material genético a partir de una muestra biológica pequeña y
conservar su calidad a lo largo del tiempo.

Inhibidores
6
Muestra 5
RNAsas, hemoglobina, lípidos, cationes 2

Ambientales 7
1 4
DNAsas, RNAsas, Pirógenos, cationes
3 1 Adsorción del Ac. nucleico al plástico de los tubos
Técnica 2 Degradación del Ac. nucleico extraído
Talco, etanol, fenoles, heparina, etc 3 Inhibición de la retro transcriptasa
4 Inhibición de la ADN polimerasa
5 Interferencia con la unión de los primers
6 Interferencia con la unión de sondas y fluoróforos
7 Degradación del Ac. nucleico sintetizado
Objetivo

¿Para qué queremos purificar ácidos nucleicos?

Para aislarlo de otros componentes celulares e impurezas que podrían degradarlo o inhibir
determinaciones enzimáticas posteriores.
Para concentrar el material genético a partir de una muestra biológica pequeña y
conservar su calidad a lo largo del tiempo.

Pérdida de material por adsorción al plástico -

- hidrólosis
Degradación de los ácidos nucleicos por - - ácida del
efectos del pH fragmentación ác. nucleico
- -

-
Precauciones antes de comenzar

Material plástico desechable libre de contaminantes

•Enzimas que degradan al ADN (DNAsas).
•Enzimas que degradan al ARN (RNAsas).
•Pirógenos.

Reactivos de pureza certificada

• Los reactivos de grado molecular garantizan resultados
precisos, confiable y reproducibles.
• Agua, soluciones, enzimas y/o reactivos químicos.

Estos cuidados, o falta de

Material plástico desechable de baja adsorción
los mismos, determinan
• Evitan la pérdida de material por pegado al plástico.
el éxito o el fracaso de la
• Evitan la degradación de los ácidos nucleicos por pegado
al plástico durante la conservación prolongada. purificación y de las
técnicas posteriores!
Tipos de muestras

¿Qué tipo de muestra podemos usar?

CMSP

Sangre entera o CMSP (PBMC), EDTA Manchas de sangre

Biopsias de órganos/tejidos sin formol Papel de filtro para muestras
Hisopados Médula de los huesos
Saliva muestras congeladas (-80ºC /-190ºC)
Esperma Biopsias fijadas en formol e incluidas
Cultivos celulares en parafina (FFIP)
bacterianos
virales

Muestras en fresco Muestras de archivo

Consideraciones especiales

Biopsias en fresco - proceso estandarizado

Laboratorio
Biopsia/pieza Lisis celular y
Hipoxia y muerte Degradación
quirúrgica sin liberación de
celular del ARN
conservantes RNAsas
Consideraciones especiales

Biopsias fijadas en formol e incluidas en parafina

0
Fragmentación por acidificación 0
Fijar con formol buffereado pH 7 0
Genera crosslinking con proteínas -
-
Deparafinar en xileno a 50-55ºC 8 hs
- -
Conservado (tiempo, temp. Y humedad) -
-
Cortar rulos con navajas independientes -
DNA-Protein
Crosslinking
-
Historia antigua
1º aislamiento de Ac. nucléicos Friederich Miescher a partir de glóbulos
blancos en 1869 en un laboratorio de la universidad Tübingen, en Alemania

Agregando
Lisis celular de sal neutraliza Agregado de
con las cargas etanol frío y
detergente negativas del dejar reposar
ADN Filtrado

Método sencillo, rápido y económico - Bajo rendimiento y pureza del ac. nuc.

-
Sentó las bases del trabajo con Ac. Nuc. -
-
Co purificación ADN, ARN y proteina
-
- -
-
Aún hoy se utiliza en docencia NO apto para Biología Molecular
-
Purificación de ADN

Purificación orgánica por separación de fases - fenol:cloroformo:isoamílico 25:24:1

Inc. 56ºC Agregado Fase Fase descartar descartar
2 a 8hs Sc. F:C:I acuosa acuosa SN SN

+ +
Sc. de lisis mezclar y Clorof:Isoam Isopropílico Etanol 70% Evaporar
(proteinasa K y centrifugar mezclar y centrifugar Incubar a -20ºC frío y etanol y
SDS) 14000 rpm 10 min a 14000 rpm 10 min a y centrifugar centrifugar resuspender en
4ºC 4ºC 14000 rpm 10 min a 4ºC buffer TE
Muestra biológica Proteinasa K degrada Separación de fases. Fase Este paso lava el fenol En presencia de alcohol El Etanol 70% lava el Utilizar el ADN en
para purificar ADN proteínas y disgrega la acuosa contiene el ADN, Isopropílico el ADN alcohol Isopropílico. reacciones
(Si la muestra es muestra, el detergente sales e hid. de carbono. precipita. Pellet de Ac. nucleicos enzimáticas o
FFIP, deparafinar en desestabiliza las Fase orgánica retiene Pellet de Ac. nucleicos NO debe ser perturbado conservar a -20ºC
xileno 8hs a 50ºC) membranas celulares y proteínas y detritos NO debe ser perturbado
atrapa restos celulares celulares

Método sencillo y económico Es laborioso lograr ajustar el pH del fenol

No requiere de equipamiento sofisticado Toxicidad del fenol y el cloroformo

Buen rendimiento, cantidad de ADN purificado Baja pureza del ADN, co purificación con ARN
 Purificación de ADN

Purificación por adsorción a fase sólida – columnas mini-spin

Inc. 56ºC Etanol 100% Descartar Descartar descartar Centrifugar
2 a 8hs Transferir eluato eluato eluato 6000g

Proteinas K + a la Buffer 1 Buffer 2 Transferir 1 minuto

solución de lisis columna mini- con Etanol y con Etanol y columna + Buffer y CONSERVAR
con SDS) spin y centrifugar centrifugar 6000g centrifugar TE e incubar 5 el eluato con el
6000g 1 min. 1 min. 20000g 3 min. min en mesada ADN
Muestra biológica para Proteinasa K degrada En presencia de etanol y Este buffer 1 con alta El buffer 2, de menor El buffer TE, pH 7 y baja Utilizar el ADN en
purificar ADN en PBS proteínas y disgrega la sales (PBS), el ADN es fuerza iónica eluye fuerza iónica, lava el fuerza iónica favorece el reacciones
(respetar la cantidad muestra, el detergente insoluble y con sus cargas iones inhibidores de la buffer 1 y la centrif. a alta «despeagdo» del ADN de enzimáticas o
máxima de muestra a desestabiliza las negativas neutralizadas, PCR velocidad impide el la membrana y lo protege conservar a -20ºC
extraer) membranas celulares y se adsorbe a la arrastre de buffer 2 con de pequeños cambios de
atrapa restos celulares membrana de Silica etanol pH

Método sencillo, rápido y reproducible Protocolos adaptados a todo tipo de muestra

Reactivos NO tóxicos provistos en el kit Las columnas se pueden saturar

Buen rendimiento, pureza y calidad Costo del kit

Purificación de ADN

Purificación por adsorción a fase sólida – opciones de columnas mini-spin

Escalabilidad y bajo riesgo de contaminación

Accesorio para columnas y bomba de vacío
son adicionales y costosos
Costo del equipo y costo de mantenimiento
 Purificación de ADN

Purificación por adsorción a fase sólida – perlas magnéticas

Inc. 56ºC Binding Colocar en Descartar Descartar Transferir
2 a 8hs buffer Imán SN SN SN

Proteinas K + y perlas Incubar Resuspender Resuspender

solución de lisis magnéticas 3 min. y adicionar y adicionar
con SDS) recubiertas en Buffer de Buffer de
silica. lavado. elución
Muestra biológica para Proteinasa K degrada El ADN es se Por la acción Por la acción En este buffer de menor Utilizar el ADN en
purificar ADN en PBS proteínas y disgrega la adsorbe a las perlas magnética, las perlas y magnética, las perlas y fuerza iónica, el ADN se reacciones
(respetar la cantidad muestra, el detergente magnéticas de silica el ADN adsorbido el ADN adsorbido separa de las perlas enzimáticas o
máxima de muestra desestabiliza las quedan retenidos por quedan retenidos por magnéticas. Las perlas conservar a -20ºC
a extraer) membranas celulares y el imán el imán magnéticas quedan
atrapa restos celulares retenidas por el imán

Método sencillo, rápido y reproducible Protocolos adaptados a todo tipo de muestra

Reactivos NO tóxicos provistos en el kit Opción de automatización completa

Buen rendimiento, pureza y calidad Costo del kit, imán y equipo automatizado
Purificación de ARN
Ribonucleasas RNAsas (RNase)

Son proteínas, endo y exonucleasas, que

degradan el ARN

Regulan los ARN celulares y defensa

contra los virus con genoma ARN

Presentes en las secreciones corporales:

lágrimas, saliva y especialmente la piel

Presentes en el ambiente y en los

materiales de trabajo del laboratorio
Consideraciones especiales

Biopsias en fresco - proceso estandarizado

Laboratorio
Biopsia/pieza Lisis celular y
Hipoxia y muerte Degradación
quirúrgica sin liberación de
celular del RNA
conservantes RNAsas
Purificación de ARN

Purificación orgánica por separación de fases – Isotiocianato de guanidina y fenol

Isotiocianato Cloroformo centrifugar Fase descartar descartar
guanidina 12000g acuosa SN SN
ARN
ADN
Prot.
+ ARN ARN
Incubar 15 min Isopropanol Etanol 75% Evaporar
5 min. a homogeneizar e a 4ºC e incubar frío y etanol y
temperatura incubar 3 min. a 10 min. a 4ºC y cent. centrifugar 7500g resuspender en
ambiente temp. ambiente 12000g, 10 min. 4ºC 5 min. a 4ºC buffer TE
Muestra biológica La solución actúa como Las fases orgánica y Se separan las fases y se En presencia de El lavado con Etanol 75% Utilizar el ARN en
para purificar ADN sc. de lisis e inhibidora acuosa comienzan a forma una pequeña isopropanol y a baja remueve al isopropanol. reacciones
(En fresco a -80ºC de RNAsas. Se puede separarse. El ARN se interfase. temperatura el ARN no es Pellet de ARN enzimáticas o
con/sin Isot. guan. disgregar tejido en mantiene en la fase soluble y precipita NO debe ser perturbado conservar a -80ºC
y atendiendo a forma mecánica acuosa, el ADN y
cantidad máx.) proteínas en la orgánica

Buen rendimiento, cantidad de ARN purificado Puede existir co purificación con ADN

Adaptable para purificar ADN y proteínas Probable contaminación con fenol (qPCR)

No requiere de equipamiento sofisticado Solución MUY irritante y residuo tóxico

Purificación de ARN

Purificación por adsorción a fase sólida – columnas mini-spin

Sc. lisis con
β-ME Transferir Transferir Descartar descartar Centrifugar
+ DTT el SN el SN el eluato el eluato 8000g

Disgregar Agregar un Centrifugar Sc. lavado Transferir 1 minuto

mecánicamente y volumen de 8000g 15 seg. con Etanol y columna + y CONSERVAR
centrifugar a Etanol 70% centrifugar 8000g (2 Buffer TE el eluato con el
16000g 3 min. veces) 15 seg. y 2 min. ARN
Muestra biológica Disgregar y En presencia de etanol y El RNA (>200 bases) se La Sc. de lavado, con El buffer TE, pH 7 y baja Utilizar el ADN en
fresca, a -80ºC o homogeneizar lo más sales (PBS), el ARN es adsorbe a la membrana. menor fuerza iónica, lava fuerza iónica favorece el reacciones
estabilizada rápido posible. El β-ME insoluble y con sus cargas Opcionalmente se puede RNA y la centrifugación «despeagdo» del ARN de enzimáticas o
(respetar la cantidad y el DTT inhiben a las negativas neutralizadas, realizar tratamiento con larga seca la membrana e la membrana y lo protege conservar a -80ºC
máxima de muestra) RNAsas y estabilizan el se adsorbe a la DNAsa en este paso impide el arrastre de de pequeños cambios de
RNA membrana de Silica Etanol pH

Método sencillo, rápido y reproducible Las columnas se pueden saturar

El entramado final de la
resina de sílica y los
tiempos cortos de
Protocolos para distintas muestras centrifugación favorecen Residuos con guanidina son tóxicos
la adsorción de los ARN >
a 200 nucleótidos y
favorecen la elución del
Buen rendimiento, pureza y calidad ADN genómico Costo del kit
Purificación de ácidos nucleicos

Cuantificación del ácido nucleico purificado

Electroforesis en gel de agarosa Absorbancia UV Fluorometría Electroforesis capilar
Tamaño Cantidad

Productos de PCR y/o plásmidos ADNg, ARN, prod. PCR y/o plásmidos ADN, ARN para bibliotecas NGS ADN, ARN para bibliotecas NGS
Método relativamente económico Método preciso y sensible que usa Método muy preciso y muy sensible. Método muy preciso y muy
para ac. nucleicos ya amplificados muy poca cantidad de muestra Utiliza poca cantidad de muestra sensible. Poca cantidad de muestra

Permite evaluar integridad de Permite evaluar contaminación Permite cuantificar en forma Permite evaluar la integridad de
los ac. nucleicos amplificados con proteínas (rel . 260/280 nm) específica ADN o ARN los ac. nucleicos

Método poco preciso y poco No requiere de ningún tipo de Requiere reactivos y consumibles Requiere reactivos y consumibles
sensible para evaluar ADN reactivos ni consumibles costosos costosos.

No es útil para cuantificar ADN NO permite evaluar integridad ni NO evalúa integridad de los ac. nuc. No permite evaluar contaminación
genómico o ARN purificados. diferenciar ADN de ARN ni contaminación con proteínas del los ac. nucleicos con proteínas
Purificación de ácidos nucleicos

Cuantificación del ácido nucleico purificado

Ley de Lambert-Beer
Cuantificación de ADN
•Concentración (µg/ml) = Abs 260 x factor dilución x 50 µg/ml
Rango lineal •Relación Abs a 260 nm /Abs a 280nm entre 1,8 y 2,0
1,0 - •Relación Abs a 260 nm / Abs a 230 nm ≥ 1,5

Cuantificación de ARN
Absorbancia

•Concentración (µg/ml) = Abs 260 x factor dilución x 40 µg/ml

•Relación 260/280 entre 1,8 y 2,0
•Relación 260/230 ≥ 1,5

Concentración Abs 260 nm: ácidos nucleicos

Abs 280 nm: proteínas
Con concentración de ácidos nucleicos puedo calcular
el volumen de solución a utilizar:
Abs 230 nm: fenoles y otros contaminantes
100-500 ng ADN para PCR o qPCR Factor corrección ADN: La abs. a 260 nm de una solución 50 µg/ml de ADN es 1.0
1-2 µg ARN para retro-transcripción Factor corrección ARN: La abs. a 260 nm de una solución 40 µg/ml de ADN es 1.0
Purificación de ácidos nucleicos

Técnicas de biología molecular subsecuentes a la extracción de Ác. nucleicos

ARN ADN

Micro arreglos de Secuenciación de Amplif. Amplif. Secuenciación de Micro arreglos de

ARN en soporte nueva generación Retro transcripción PCR qPCR nueva generación ADN en soporte
sólido (NGS) (RT) del ARN (NGS) sólido
Detección Detección
Generación de ADN copia (ADNc) cualitativa cuantitativa Secuenciación masiva de ADN
de ADN de ADN • Genoma Completo (WGS)
RNA chip • Exoma completo (WES) DNA chip
RNAseq Amplif. Amplif. • Panel exoma clínico
microarray microarray
RT-qPCR RT-PCR Secuenciación • Paneles específicos
Detección y Secuenciación masiva Sanger Detección de gran
cuantificación relativa de ARN total, Detección Detección cantidad de targets de
de la expresión de gran mensajero o cuantitativa cualitativa Secuenciación capilar del ADN de manera
cantidad de targets de micro-ARN de ADNc de ADNc ADN previamente simultanea
ARN de manera amplificado
simultanea
Secuenciación
Sanger Hibridación in situ
Secuenciación capilar del
de ARN o ADN
ADNc previamente (ISH o FISH)
amplificado
Técnica histológica que se realiza sobre una
sección de tejido FFIP, sin realizar una
extracción de ácidos nucleicos
Purificación de ácidos nucleicos

Laboratorio de Biología
Molecular, División Patología
(IMIPP), CONICET-GCBA