Extracción y purificación

Etapas básicas de un procedimiento general

para Extracción y Purificación de ADN
Disgregación o fragmentación del tejido, medio
de cultivo.
Estas etapas
deben ir
Lisis celular
acompañadas de Durante todo el
medidas o
agentes que procedimiento se deben usar
inactiven Clarificación soluciones y material
nucleasas
celulares estéril, además
de guantes.
Purificación

Cuantitativo:
Cualitativo: Análisis espectrofotometría UV
electroforesis
 1. Métodos de fragmentación y lisis celular
para la extracción de ADN.
El procedimiento ideal de lisis debe tener la fuerza necesaria para romper el
material de inicio (células o tejido) y la delicadeza requerida para preservar las
moléculas de interés (ADN o ARN).

 Métodos físicos
 Homogenización mecánica. •Métodos químicos
 Homogenización en solución. ❖ Detergentes:
 Molienda manual en mortero. ❑ SDS: Desestabiliza membranas
 Bolitas de vidrio. celulares.
 Sonicación.

•Métodos enzimáticos
✓ Lisozima: Rompe enlaces -1,4- entre N-acetil murámico y N-acetil
glucosamina de peptidoglicano de la pared celular de bacterias
✓ Liticasa: rompe enlaces -1,3 de glucano de levaduras.
✓ Proteasas: rompe enlaces peptídicos de proteínas de pared
(proteinasa K) y membrana plasmática e interacciones célula-
célula.
 Componentes de una solución de lisis
Debe Incluir
❖Etilen diamino tetracético (EDTA).

✓ Quelante de iones Mg2+, baja la concentación efectiva de

este ión.

✓ Por lo tanto, EDTA inhibe nucleasas y minimiza la

degradacion de ADN durante la extración/purificación.

❖Amortiguador de pH (7-8).

SDS Triton
2. Clarificación. Eliminación de restos celulares.

➢Centifugación.

➢Filtración.

➢Método mixto: enzimas + centrifugación.

3. Purificación.
❖Fenol: Desnaturaliza proteínas precipitándolas.
❖Precipitación de proteínas con sales (“salting out”).

❖Cloroformo. Se utilizan para precipitar el ADN que es soluble

en agua pero, cuando se encuentra en alcohol se
desenrolla y precipita en la interfase entre el
❖Etanol. alcohol y el agua.

❖Extracción de DNA desde un gel de agarosa.*

❖Purificación mediante columnas de afinidad.

Factores que afectan el rendimiento, calidad y
pureza de la purificación de ADN
 Cantidad de material de partida:
 Número de copias de las moléculas de ADN.
 Cantidad de tejido.
 Condiciones en las que se encuentra el material de
inicio (fresco, congelado, fijado).
 Contaminantes e interferentes en el material
biológico.
 Hay un compromiso entre:
rendimiento/calidad/pureza.
Extracción y Purificación de RNA
✎ RNA total o Sub-celular (citosólico y nuclear).

✓ Lo primero es minimizar la actividad de RNAsa liberadas desde las células

lisadas durante el proceso de extracción.
✓ La cantidad de RNAsa depende del tipo de células.

✎ Las RNAsas son muy resistentes (resisten Tº de ebullición, autoclavado,

desnaturalización con denaturalizantes fuertes). Por lo tanto, en lo posible
deben ser eliminadas, no sólo inhibidas.

✓ Tratamiento del material de vidrio y de la soluciones, uso de guantes, y

mantención de un ambiente libre de RNAsas.
✓ Uso de inhibidores de RNAsa.
✓ Desnaturalizantes fuertes (HCl Guanidina o tiocianato de guanidinina
con agentes reductores).
 Extracción de RNA total
 Lisis en presencia de agentes desnaturalizantes fuertes de proteínas
(Tiocianato de guanidina, fenol ácido, trizol y agua DEPC) para
INACTIVACION DE RNAsas.

 Extracción con fenol ácido (pH 4.5).

 Precipitación con isopropanol.

 Se obtiene mezcla de mRNA, rRNA y tRNA.

 Purificación de mRNA mediante cromatografía de afinidad a poli-dT.

 PURIFICACIÓN DEL RNAm

➢Columna de oligo dT

RNA total

TTTTTTTTT
AAAAAAGUACCUAG

TTTTTTTTT

TTTTTTTTT

RNAm
 FUNDAMENTO DE
ELECTROFORESIS
➢ Es una técnica que se emplea para separar el ADN, el ARN o proteínas en base a su
tamaño y carga eléctrica.

➢ Se utiliza una corriente eléctrica para mover las moléculas y que se separen a través
de un gel.

➢ Los poros del gel actúan como un colador, permitiendo que las moléculas más
pequeñas se muevan más rápido que las grandes.

➢ Las condiciones utilizadas durante la electroforesis se pueden ajustar para separar

moléculas en el rango de tamaño que se desee.
 Electroforesis:
Marcadores de peso molecular
de concentración conocida,
comparar la intensidad de la
señal tras la tinción con
bromuro de etidio, sybr green.

 Espectrofotometría:
260 nm (máxima absorbancia de
ácidos nucléicos)
280 nm (máxima absorbancia de
proteínas)
 Método de Sanger
Basado en el uso de la ADN polimerasa para sintetizar cadenas de
ADN con una terminación específica. Se generan fragmentos de
ADN de todos los tamaños posibles que se distinguen entre sí por
el marcaje o por un terminador específico.

*Premio Nobel de química 1958 y 1980.

Componentes:
Templado
ADN polimerasa I de E. coli (5´- 3’) INCUBACIÓN

Primer
ddNTPs y dNTPs

✓ Fraccionamiento por electroforesis

✓ Revelación radiografía
Uso de una máquina automatizada que usa un detector óptico para obtener
la información de la secuencia y pasarla directamente a una computadora.

4 fluorocromos diferentes para

cada uno de los
dideoxinucleótidos

Los datos se
recogen durante
la electroforesis

Capilar o en
gel
 EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS
Metodología básica NUCLEICOS
Procesamiento de la muestra:
Lisis
Disociación de complejos DNA-
proteína
separación

COMPROBACIÓN DE LA
PREPARACIÓN DE LA EXTRACCIÓN
MEZCLA DE PCR
Primers
Taq polimerasa DNA
dNTPs diana
Buffer de amplificación

AMPLIFICACIÓN DE LOS
ÁCIDOS NUCLEICOS
Desnaturalización
Alineamiento
Extensión

DETECCIÓN E
INTERPRETACIÓN
Análisis electroforético
 3 pasos
1. DESNATURALIZACIÓN →
90-95 °C/ 30 s

2. ALINEAMIENTO → composición,
tamaño y concentración de primers (Tm- 1 CICLO
50-60 °C)/1 min

3. EXTENSIÓN → 72 °C / 60 s
Identificación de los productos de PCR
 Aplicaciones
✓ Ingeniería genética.
✓ Estudios de expresión génica.
✓ Secuenciación directa de
secuencias amplificadas.
✓ Detección de mutaciones.
✓ Diagnóstico de enfermedades
genéticas e infecciosas.
✓ Identificación de restos
biológicos, determinación de
paternidad, pruebas periciales.
✓ Arqueología y paleontología.
 Otras técnicas

✓ Microarreglos.

✓ qRT-PCR.

✓ CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly

Interspaced Short Palindromic Repeats).
 ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

DEFINICIÓN:
Proteínas de origen bacteriano que tiene actividad de endonucleasa capaces
de cortar la cadena de DNA en secuencias específicas.
 TIPOS DE CORTE DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

AAGCTT HindIII A AGCTT

TTCGAA TTCGA
+ A

Enzimas que dejan extremos cohesivos o disparejos

ApoI
BamHI
BglI
BglII
EcoRI
HindIII
KpnI
SacI
XbaI
XhoI
XmaI
 TIPOS DE CORTE DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

GATATC EcoRV GAT ATC

+
CTATAG CTA TAG
Enzimas que dejan extremos romos o parejos

AcuI
AfeI
AleI
AluI
AlwI
BbsI
EcoRV Corte de tipo simétrico con extremos romos

SmaI
 VECTORES
Plásmidos

2850 SspI NaeI 134

SELECCIÓN DE 2645 XmnI SELECCIÓN DE RECOMBINANTES

f1
TRANSFORMANTES 2526 ScaI
2417 PvuI SspI 445
PvuI 503
PvuII 532
lacZ
IPTG + XGAL
Resistencia a amp
r
Bluescript T7

antibióticos (2.96 Kb) Sitio de

Policlonación
2135 CsuI
2130 Cfr10I
T3
lacI
PvuII 977
ori
AflIII 1157
Galactosidasa + Galactosidasa -
Transformación Sitio de policlonación
KpnI XhoI ClaI EcoRV PstI BamHI XbaI EagI SacII

ApaI SalI HindIII EcoRI SmaI SpeI NotI BstXI SacI

DraII AccI
HincII -Fáciles de manejar
-Aceptan insertos de 6-8 kpb (hasta 15 kpb)
-Fáciles de almacenar
 VECTORES
Bacteriófagos

Genoma del fago l

LIGACIÓN

Inserto

Genoma del fago l

✓ Fáciles de manejar
✓ Ideales para almacenar
Inserto
✓ Aceptan insertos de hasta
12-25 kpb
✓ Se pueden usar muchos EMPACAMIENTO
para un escrutinio

INFECCIÓN
 CLONACIÓN
ORGANISMO

Purificación

Ácidos Nucleicos (DNA o RNA)

Selección, purificación, amplificación

Clonación

VECTORES
 CLONACIÓN

DNA Ligasa
ATP

VECTOR
VECTOR
INSERTO

Replicación
Conservación
Expresión

SISTEMA BIOLÓGICO
 TRANSFORMACIÓN Y TRANSFECCIÓN

Técnicas que consisten en la introducción de DNA/RNA

dentro de células procariotas o eucariotas para su
replicación y/o expresión.
 TRANSFORMACIÓN Y TRANSFECCIÓN

Requisitos:

▪Gen de interés clonado en un vector (plásmido)

▪Gen de interés bajo el control del promotor adecuado
▪El plásmido debe poseer un marcador selectivo (gen de resistencia)
 TRANSFORMACIÓN

Técnica que consiste en la introducción de DNA en células procariotas.

Ampicilina
Gen de resistencia Kanamicina
Tetraciclina

Plásmido
Inserto
Ori

Bacteria
 TÉCNICA DE TRANSFORMACIÓN
1 2
PREPARAR CÉLULAS INCUBACIÓN EN 3
COMPETENTES HIELO TRANSFORMACIÓN

Bacteria

HANAHAN DMSO-DTT HANAHAN Choque térmico 42oC

INOUE CaCl2 + MnCl2 INOUE Choque térmico 42oC

CLORURO DE CALCIO CaCl2 + MgCl2 CLORURO DE CALCIO Choque térmico 42oC

ELECTROPORACIÓN H2O + Glicerol ELECTROPORACIÓN Descarga eléctrica

 TÉCNICA DE TRANSFORMACIÓN

4 5
RECUPERACIÓN SELECCIÓN

Ampicilina
o
HANAHAN En hielo
Kanamicina
INOUE En hielo
CLORURO DE CALCIO En hielo
o

ELECTROPORACIÓN A temperatura ambiente Tetraciclina

 TRANSFECCIÓN

Técnica que consiste en la introducción de DNA en células eucariotas.

Gen de resistencia

Plásmido
Inserto
Ori
TIPOS DE TRANSFECCIÓN

Transfección temporal o transitoria

Transfección estable
➢Uso de antibióticos
 TÉCNICAS DE TRANSFECCIÓN
❖Electroporación
200-350 V

Estable Temporal
24-96 h 48-72 h

G418
Aminopterina
Metotrexate ANÁLISIS
Higromicina
Puromicina
Ácido micofenólico
 OPERÓN LAC

✓ En presencia de lactosa: La lactosa es el inductor del operón. Es capaz de unirse a la

proteína represora Lac I y generar un cambio conformacional que disminuye su afinidad
por la región operadora. De esta forma, la región operadora queda libre, la RNA
polimerasa puede transcribir libremente los genes estructurales y la β-galactosidasa
puede degradar la lactosa a glucosa más galactosa.
✓ En ausencia de lactosa: En ausencia de inductor, la proteína represora Lac I mantiene
su elevada afinidad por la región operadora, impidiendo que la RNA polimerasa
transcriba los genes estructurales. De esta forma, el sistema permanece cerrado con el
consecuente ahorro energético para la bacteria.
 Función del IPTG
 IPTG (isopropil-β-D-tiogalactósido): Suele utilizarse
como inductor artificial del operón lac, ya que es capaz
de unirse al represor LacI, pero no es un sustrato para
la β-galactosidasa y no puede ser metabolizado por la
bacteria.

 La molécula de IPTG es absorbida por la bacteria a

través de la acción de la enzima permeasa de lactosa.
Una vez dentro de la célula, induce la transcripción del
gen de interés.