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Biología molecular. Fundamentos y aplicaciones en las ciencias de la salud

Capítulo 11: Extracción de ácidos nucleicos

Extracción de ADN
Las técnicas comunes de extracción de ácidos nucleicos son muy diversas e incluyen procesamientos químicos y físicos que las diferencian; cada una
presenta ventajas y desventajas, que se agrupan en el cuadro 11­2.

Cuadro 11­2.

Ventajas y desventajas de diversos métodos de extracción de ácidos nucleicos. De las diversas técnicas disponibles para la extracción de
ácidos nucleicos, algunas como la extracción por cloruro de cesio se consideran ideales para ADN plasmídico. Algunas otras, como la
extracción fenol­cloroformo, se emplean para cualquiera de los ácidos nucleicos (se realizan ligeras modificaciones para la extracción de
ARN).

Método Ventajas Desventajas

Fenol/cloroformo (ADN) e isotiacianato Buen rendimiento. El producto purificado requiere ser

de guanidina/fenol­cloroformo (ADN) Permite el aislamiento de todo tipo de ácido nucleico. precipitado con alcaloides.
El fenol es tóxico y caústico.

Cloruro de cesio ADN plasmídico Excelente método para obtención de ADN plasmídico. Laborioso y prolongado.

Alta pureza de los ácidos nucleicos. BrEf es cancerígeno.
Requiere muy pocas manipulaciones, lo que elimina Requiere eliminación de CsCl.
el riesgo de contaminaciones esporádicas con rinasas. Indispensable el uso de material
especializado.

Cromatografía por exclusión de tamaño Tiempos de separación cortos y bien definidos. La recuperación del ácido nucleico

(ADN o ARN) Alta sensibilidad. purificado es ineficiente (pérdida de
Reproducible. muestra).

Salting­out (ADN) Reactivos inocuos. Requiere una cantidad grande de muestra

Material barato. para obtener cantidades adecuadas de
ADN.

Chelex (ADN) Previene la degradación del ADN por sus agentes Se obtiene ADNes, el cual no puede usarse

quelantes. para RFLPs.
No hay pérdidas considerables de ADN.

Extracción de ADN por la técnica fenol­cloroformo
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Esta técnica se fundamenta en la lisis total de las células y sus estructuras subcelulares mediante el empleo de detergentes con la posterior
Extracción de ADN, Ana Soledad Sandoval Rodríguez; Abril Bernardette Martínez Rizo; David Alejandro López de la Mora Page 1 / 5
eliminación de las proteínas mediante su extracción y la de componentes lipídicos con solventes orgánicos. Esto deja al 
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separación por precipitación en soluciones alcohólicas. Es la técnica más empleada, por la cantidad y la calidad del ADN obtenido. A continuación se
describen los pasos que implica esta metodología, esquematizados en la figura 11­1.
 No hay pérdidas considerables de ADN.
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Extracción de ADN por la técnica fenol­cloroformo

Esta técnica se fundamenta en la lisis total de las células y sus estructuras subcelulares mediante el empleo de detergentes con la posterior
eliminación de las proteínas mediante su extracción y la de componentes lipídicos con solventes orgánicos. Esto deja al ADN puro listo para su
separación por precipitación en soluciones alcohólicas. Es la técnica más empleada, por la cantidad y la calidad del ADN obtenido. A continuación se
describen los pasos que implica esta metodología, esquematizados en la figura 11­1.

Figura 11­1.

Extracción de ADN por la técnica fenol­cloroformo. Esta técnica es ampliamente usada por su economía y facilidad, lo que permite el
aislamiento de ADN de buena calidad para su uso en diversas técnicas moleculares. Es importante considerar que el procedimiento se debe realizar en
frío (4°C) después de la digestión enzimática. Una vez extraído se almacena a temperatura de ­80°C para su preservación adecuada por varios años.

Lisis de las células y liberación del ADN

El primer paso en la extracción es la homogeneización del tejido y la lisis con detergentes (Triton o docedil sulfato sódico, SDS) capaces de romper las
membranas celular y nuclear, y liberar el ácido nucleico de las células de donde se extraerá el ADN. El procedimiento de lisis celular es crítico y debe ser
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lo suficientemente agresivo como para lograr la fragmentación del tejido y la rotura de la membrana celular, sin dañar el ácido nucleico. La
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disgregación del tejido y su homogeneización se llevan a cabo en un buffer de lisis, que contiene sales, un detergente y proteinasa K, que libera el ADN
de las histonas con las que se encuentra empaquetado y proteoliza proteínas celulares. La incubación con la enzima se realiza por 2 horas a 65°C. En el
caso del ADN, la homogeneización se lleva a cabo con un homogeneizador manual para evitar la rotura mecánica de la molécula; para el ARN se
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Lisis de las células y liberación del ADN

El primer paso en la extracción es la homogeneización del tejido y la lisis con detergentes (Triton o docedil sulfato sódico, SDS) capaces de romper las
membranas celular y nuclear, y liberar el ácido nucleico de las células de donde se extraerá el ADN. El procedimiento de lisis celular es crítico y debe ser
lo suficientemente agresivo como para lograr la fragmentación del tejido y la rotura de la membrana celular, sin dañar el ácido nucleico. La
disgregación del tejido y su homogeneización se llevan a cabo en un buffer de lisis, que contiene sales, un detergente y proteinasa K, que libera el ADN
de las histonas con las que se encuentra empaquetado y proteoliza proteínas celulares. La incubación con la enzima se realiza por 2 horas a 65°C. En el
caso del ADN, la homogeneización se lleva a cabo con un homogeneizador manual para evitar la rotura mecánica de la molécula; para el ARN se
emplea un homogeneizador eléctrico que gira a unas 200 a 1000 rpm. En el caso de células con pared celular, como las células vegetales, se prefiere el
empleo de sonicadores, los cuales, mediante ondas de sonido, rompen la pared celular y la membrana celular y nuclear, para liberar el ADN. Cuando la
extracción se lleva a cabo a partir de células de sangre periférica, se recomienda el empleo de tubos con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) como
anticoagulante (EDTA 0.1 M al 0.02% V/V), ya que la heparina interfiere con enzimas como las polimerasas o las enzimas de restricción, que se
emplearán en pasos subsiguientes. También es necesario retirar los eritrocitos, ya que por su alto contenido de hemoglobina y carencia de núcleo
contaminan la muestra. La lisis de eritrocitos suele realizarse por adición de una solución hipotónica a base de cloruro de amonio. Los
procedimientos comunes de lisis celular y su fundamento se incluyen en el cuadro 11­3.

Cuadro 11­3.

Procedimientos de lisis celular. La finalidad de la lisis celular es romper las membranas para liberar los ácidos nucleicos para su
solubilización en solventes adecuados. En el caso de células con pared celular (ciertas bacterias y células vegetales), se requieren métodos
más agresivos que destruyan también la pared celular.

Técnica/ejemplo Mecanismo Fuente

Homogenización Utiliza la fuerza física para romper las membranas. Tejido

Procedimientos mecánicos Ruptura de las membranas por ultrasonido. animal y
suaves/mortero vegetal
Sonicación/aplicación de Cultivo
ondas ultrasónicas celular
Biopsias
Bacterias
Cultivo
celular

Detergentes/SDS Solubiliza las membranas celular y nuclear. El SDS también participa en la desnaturalización de Bacterias

nucleadas y la disociación de complejos nucleoproteicos.

Soluciones/soluciones Producen un ambiente hipotónico, lo cual rompe la membrana celular. Bacterias

hipotónicas Tejido
animal y
vegetal
Cultivo
celular
Biopsias

Disrupción Debilita la pared celular al romper los enlaces que hay entre las moléculas del ácido N­ Bacterias

enzimática/lisozimas acetilmurámico y la N­acetil glucosamina.

La inactivación de nucleasas intracelulares previene la digestión enzimática de los ácidos nucleicos, lo que permite lograr la obtención de fragmentos
relativamente largos de ADN y ARN. La lisis celular y la inactivación de las nucleasas intracelulares en general se llevan a cabo en el mismo paso, ya que
la solución de lisis está compuesta por sales caotrópicas, como el EDTA, que secuestra cationes divalentes y, por lo tanto, inactiva las ADNasas.
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Extracción de proteínas y lípidos con solventes orgánicos
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Al concluir la lisis celular y la inactivación de nucleasas, se retiran los restos celulares, proceso conocido como purificación. Los métodos de
 enzimática/lisozimas acetilmurámico y la N­acetil glucosamina.
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La inactivación de nucleasas intracelulares previene la digestión enzimática de los ácidos nucleicos, lo que permite lograr la obtención de fragmentos
relativamente largos de ADN y ARN. La lisis celular y la inactivación de las nucleasas intracelulares en general se llevan a cabo en el mismo paso, ya que
la solución de lisis está compuesta por sales caotrópicas, como el EDTA, que secuestra cationes divalentes y, por lo tanto, inactiva las ADNasas.

Extracción de proteínas y lípidos con solventes orgánicos

Al concluir la lisis celular y la inactivación de nucleasas, se retiran los restos celulares, proceso conocido como purificación. Los métodos de
purificación de ácidos nucleicos combinan estrategias tan diversas como la extracción/precipitación, la cromatografía, la centrifugación, la
electroforesis y la separación por afinidad. Para la extracción por la técnica del fenol­cloroformo, se utiliza una solución que tiene una relación 25:24:1
v/v para el fenol:cloroformo:alcohol isoamílico; generalmente se añade hidroxiquinolina al 0.1%, que funciona como antioxidante del fenol, un
inhibidor parcial de ARNsas, quelante débil de iones metálicos, y que ayuda a identificar la fase orgánica por el color amarillo que le confiere. El
alcohol isoamílico se emplea para reducir la espuma que puede generarse al agitar esta solución. Esta solución desnaturaliza las proteínas (entre ellas
las nucleasas) y mantiene la separación de la fase orgánica y acuosa tras la centrifugación de la muestra. La eliminación de las proteínas y
componentes no hidrosolubles del homogenado celular se efectúa con la formación de dos fases con propiedades de solubilidad particulares a) una
fase orgánica (fenólica) en la parte inferior del tubo de precipitado que contiene lípidos, proteínas y debris celulares, y b) una fase acuosa en la parte
superior (menos densa), que contiene los ácidos nucleicos y otras pequeñas moléculas hidrosolubles. En la interfase se ubican la mayor parte de las
proteínas debido a su contenido en aminoácidos hidrofóbicos e hidrofílicos, como se aprecia en la figura 11­2.

Figura 11­2.

Fases en la purificación de ácidos nucleicos. En la extracción de ácidos nucleicos que involucra solventes orgánicos, una vez que estos últimos
son añadidos se forman dos fases: la fase fenólica, ubicada en la parte inferior de tubo, la cual contiene proteínas y lípidos. A su vez, la fase superior es
la acuosa, donde se ubica el ADN o ARN, según sea el caso. En la interfase entre ambas se localiza un acúmulo sólido de proteínas. La separación de la
fase acuosa sin tocar la fase fenólica o la capa de proteínas es un paso crítico en el proceso de extracción del ácido nucleico que determina la pureza
con que se aísla, y por lo tanto es determinante del índice 260/280 que se obtenga.

El ADN es poco soluble en fenol, por lo que previamente suele estabilizarse con una solución amortiguadora de Tris que lo mantiene en un pH de 8.0 a
8.5, lo que hace que el ADN permanezca en la fase acuosa. La modificación del pH de 8.5 a 5.2 en esta solución puede favorecer la extracción de ARN
frente a la de ADN.

Precipitación de ADN

El ADN disuelto en la solución acuosa se precipita añadiendo alcohol absoluto (isopropanol o etílico), ya que los ácidos nucleicos son insolubles en
soluciones alcohólicas. Cuando se emplea etanol (EtOH), la cantidad que se requiere para la precipitación es dos veces el volumen de la fase acuosa,
mientras que con isopropanol (IprOH) se demanda solamente 0.7 veces el volumen de fase acuosa. Por otro lado, al emplear IprOH puede acelerarse el
proceso, con un tiempo de incubación menor, y la precipitación puede realizarse a temperatura ambiente. Sin embargo, se ha reportado una mayor
dificultad para disolver ácidos nucleicos precipitados con IprOH que con EtOH.

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Para facilitar la precipitación también suelen añadirse cationes monovalentes (K+, Na+, NH4+) a la solución de ácidos nucleicos cargados
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negativamente, con el fin de generar sales insolubles en alcohol de fácil precipitación. Si la cantidad del ácido nucleico en la muestra es baja, es
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posible incrementar sus agregados utilizando algún compuesto inerte que se asocie a los ácidos nucleicos y aumente su precipitación, sin interferir en
futuras reacciones, como por ejemplo el glucógeno, que por su gran tamaño molecular forma una red que arrastra al ADN y facilita su precipitación. La
El ADN disuelto en la solución acuosa se precipita añadiendo alcohol absoluto (isopropanol o etílico), ya que los ácidos nucleicos son insolubles en
soluciones alcohólicas. Cuando se emplea etanol (EtOH), la cantidad que se requiere para la precipitación es dos veces el volumen de la fase acuosa,
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mientras que con isopropanol (IprOH) se demanda solamente 0.7 veces el volumen de fase acuosa. Por otro lado, al emplear IprOH puede acelerarse el
proceso, con un tiempo de incubación menor, y la precipitación puede realizarse a temperatura ambiente. Sin embargo, se ha reportado una mayor
dificultad para disolver ácidos nucleicos precipitados con IprOH que con EtOH.

Para facilitar la precipitación también suelen añadirse cationes monovalentes (K+, Na+, NH4+) a la solución de ácidos nucleicos cargados
negativamente, con el fin de generar sales insolubles en alcohol de fácil precipitación. Si la cantidad del ácido nucleico en la muestra es baja, es
posible incrementar sus agregados utilizando algún compuesto inerte que se asocie a los ácidos nucleicos y aumente su precipitación, sin interferir en
futuras reacciones, como por ejemplo el glucógeno, que por su gran tamaño molecular forma una red que arrastra al ADN y facilita su precipitación. La
precipitación se favorece incubando a bajas temperaturas (–20°C); una centrifugación posterior permite la obtención de una pastilla o botón del ácido
nucleico en el fondo del tubo, al decantar el alcohol.

Lavado del ADN

El botón de ADN obtenido en la precipitación se lava con etanol al 70% por, al menos, dos ocasiones. El contenido de alcohol de esta solución (70%)
mantiene al ADN precipitado, y el H2O (30%) permite la disolución de las sales presentes. Después de los lavados, se seca el botón, lo que permite la
evaporación del alcohol (espontánea o acelerada en un desecador).

Disolución del ADN y adición de ARNsa

Inmediatamente después de la evaporación del alcohol, el botón de ADN se disuelve en soluciones que aseguren su preservación, como agua estéril y
libre de ADNsas, o bien soluciones amortiguadoras, como el buffer Tris EDTA (TE). La cantidad de solución para disolver el ADN debe ser mínima para
mantener una concentración adecuada del ácido nucleico que permita su empleo en técnicas posteriores, pero suficiente para lograr una disolución
total del ADN. El ADN se disuelve por pipeteo constante del botón hasta lograr una solución homogénea. Los estudios indican que la disolución del
ADN en buffer TE preserva por mayor tiempo y en mejores condiciones que cuando se disuelve en agua estéril; sin embargo, se prefiere disolver el ARN
en agua­dietil pirocarbonato (DEPC) al 0.1%, lo que evita cualquier interferencia de las sales de las soluciones amortiguadoras y lo preserva de las
ARNsas. Para eliminar el ARN contaminante proveniente de la extracción, la solución de ADN se incuba por una hora a 37°C con ARNsas para, así, evitar
que el ARN interfiera en la cuantificación y en posteriores técnicas.

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