Técnicas básicas

moleculares aplicadas
en la acuacultura
OPTATIVA III
Irma Patricia Juarez Cardenas ID 185552
Brenda Leticia Machi Gutiérrez 183944
Victor Hernan Ayala Zazueta 184823

Acidos Nucleicos
Biomoleculas portadoras de la
informacion genetica.
Clasificación
Ácidos Desoxirribonucleicos (ADN)
que se encuentran residiendo en el
núcleo celular y algunos organelos, y
en Ácidos Ribonucleicos (ARN) que
actúan en el citoplasma.
Diferencias
El azúcar (Pentosa) que llevan:
desoxirribosa y ribosa.
Bases nitrogenadas que contienen,
Adenina, Guanina, Citosina y Timina,
en el ADN; y Adenina, Guanina,
Citosina y Uracilo en el ARN.
 Extracción de ácidos nucleicos
Consiste en el aislamiento y
purificación de moléculas de ADN y
se basa en las características
fisicoquímicas de la molécula.
Protocolos tradicionales
Cinco etapas principales:
homogeneización del tejido, lisis
celular, separación de proteínas y
lípidos, precipitación y redisolución del
ADN.
ETAPAS DE LA TECNICA

1. Colecta de la muestra
Una colecta y manejo apropiado de la muestra permite obtener ADN integro y sin
contaminantes, los cuales afectan la acción de las enzimas durante la reacción de
PCR

2. Homogenizacion del tejido

Consiste en romper las uniones entre las células para facilitar la interacción con las
soluciones de lisis que ayudan a liberar el material genético
ETAPAS EN PROTOCOLO TRADICIONAL
3. Separacion de proteínas y lipidos
Se separa el ADN de las proteínas y lípidos mediante
solventes orgánicos y ciclos de centrifugación. Se utiliza
la fuerte tendencia hidrofílica de los grupos fosfato para
separarlos en medios acuosos, mientras que las
proteínas y los lípidos se separan en solventes
orgánicos. La fase acuosa y la orgánica se separan por
centrifugación lo que permite aislar al ADN.
4. Precipitación del ADN
Después de que son eliminados los lípidos y las proteínas,
se recupera el ADN. Un paso de centrifugación permite
que el ADN permanezca en el fondo del tubo mientras que
el etanol es desechado.
5. Redisolucion del ADN

Una vez que se ha eliminado el etanol, el paso siguiente

es hidratar el ADN para mantenerlo en solución.
Cuando se está disolviendo el ADN es importante evitar
el pipeteo y la agitación agresiva pues se pueden
fragmentar moléculas de alto peso molecular.
ETAPAS EN PROTOCOLO COMERCIAL
3. Unión del ADN a la matriz inorgánica
y lavado
En el caso del kit con membrana de sílice, en algunos casos a la
mezcla de lisis se le añade la solución de unión que tiene un pH
específico. Antes de pasar la solución de lisis a través de la
columna, se adiciona etanol a la solución, eliminando la capa
hidratante del ADN y exponiendo sus grupos fosfato, facilitando
con ello la adsorción de la molécula a la membrana cargada
positivamente. Los lípidos y proteínas no son afines a la membrana
y se eliminan con ayuda de la solución de lavado y un ciclo de
centrifugación, mientras que el material genético permanece unido
a la matriz
 4. Recuperación del ADN de la matriz.
En los kits es necesario liberar al ADN de la matriz,.
La membrana y el ADN se deshidratan con
soluciones de lavado y ciclos de centrifugación,
después se recomienda centrifugar nuevamente la
columna para evaporar el etanol y eliminar el
exceso de las soluciones. Posteriormente, se
adiciona agua o solución amortiguadora al centro
de la membrana, se espera a que el ADN se
hidrate, se centrifuga para recuperarlo de la matriz
y resuspenderlo
 6. Cuantificacion del ADN
Una vez obtenido el material genético, es importante
determinar el rendimiento mediante espectrofotometría. La
ley de Beer-Lambert indica que la concentración de una
molécula en solución depende de la cantidad de luz absorbida
de las moléculas disueltas. Una característica del ADN es que
absorbe la luz ultravioleta (UV) a 260 nm y permite estimar su
concentración mediante espectrofotometría.
7. Comprobacion de la integridad del ADN por
electroforesis
Además de conocer la cantidad y calidad del ADN por
espectrofotometría, es importante conocer si el ADN
obtenido está integro. La integridad del ADN se puede
observar mediante electroforesis en gel de agarosa. Si
el ADN está integro, se debe observar una banda
estrecha cercana al pozo en que se colocó la mezcla
de ADN.
7. Almacenamiento del ADN
una parte de la muestra se puede almacenar a 4 °C
para los análisis inmediatos y el material restante a
-20 °C o -80 °C, para una preservación por varios
meses. En este último caso es conveniente que el
ADN se conserve en soluciones con baja
concentración de sales (low TE) para inhibir la acción
de DNasas contaminantes.
Cuantificación de
ácidos nucleicos.
Cuantificación de ácidos nucleicos.

forma de estimar la cantidad
Una vez extraído el ADN, una presente en el extracto, es
mediante la cuantificación. Según el método que se utilice, se puede apreciar la cantidad de
ácidos nucleicos totales, proteínas presentes, pureza del extracto, ADN humano solamente,
etc.
El determinar cuanto ADN hay y su pureza en un extracto, es muy importante en muchos de
los ensayos basados en PCR.
En casos donde hay mucho ADN, podría inhibirse la
PCR o los resultados podrían presentar picos que se
salen de la escala los cuales imposibilitan el análisis.

Donde hay muy poco ADN se pueden presentar falsos

negativos por una falla en la amplificación (Butler, 2001); se
puede tratar de corregir si se sabe que hay poco ADN al
agregar mayor cantidad de muestra a la reacción de PCR.

 Cuantificación
Espectrofotométrica
Una característica del ADN es la de presentar un pico de absorción en presencia de radiación
a 260nm. Este pico de absorción se debe la presencia de las bases púricas y pirimídicas. El
ADN bicatenario presenta una absorción menor que el monocatenario, debido a que el
emparejamiento de las bases (por enlaces de puentes de hidrógeno) reduce la absorción de
la luz ultravioleta

La cuantificación espectrofotométrica también permite estimar la cantidad de ARN presente

en un extracto. La absorbancia del ARN se puede analizar en términos de proporciones, lo
que genera información útil de pureza.
 Cuantificación por Hibridación con una sonda
Este tipo de técnica se puede obtener en diferentes presentaciones según la casa comercial y
el objetivo que se persigue. Por ejemplo la cuantificación por Slot blot más conocida en el
mercado es el Quantiblot.

La cuantificación por Slot Blot es tal vez el método más utilizado en el ámbito forense (Butler,
2001). Su objetivo específico es el medir la cantidad de “ADN humano”, por comparación con
un patrón.

La técnica consiste en la 19 5 La proporción debe estar entre 1.7 y 2.1 hibridación de una
sonda específica de 40 pb (pares de bases) complementaria a la secuencia D17Z1, localizada
en el cromosoma 17. Este ensayo requiere de varias horas, pero es muy certero ya que puede
detectar ADN humano de cadena simple y doble. Además permite la cuantificación de varias
muestras al mismo tiempo
 PURIFICACIÓN DE
ÁCIDOS NUCLEICOS

El proceso de purificación consiste en separar

los ácidos nucleicos de los demas
componentes
PROTCOLO EXTRACCIÓN CON FENOL-
CLOROFORMO
Consiste en tratar las soluciones
acuosas de las muestras con fenol,
que desnaturaliza las proteínas y
enzimas
Después de la separación de las
fases mediante la centrifugación, la
fase acuosa flotante que contiene el
ácido nucleico es recogida
Las trazas de fenol deben ser
eliminados mediante un nuevo
tratamiento con cloroformo
 PROTOCOLO MODIFICADO DE EXTRACCIÓN
CON SAL COMÚN
Este proceso de extracción de ADN (purificación) consiste en tratar las soluciones acuosas de las
muestras en una solución de NaCl 5M
Por medio de la densidad separa proteínas y enzimas ya que el ADN presente en soluciones con
alta concentración de NaCl puede precipitarse mediante adición de alcohol etílico
Después de la separación de las fases mediante la centrifugación, la fase acuosa flotante que
contiene el ácido nucleico es recogida
Las trazas de NaCl no reportan alguna interferencia en la técnica de PCR. por lo que este
protcolo se considera menos contaminante
 BIBLIOGRAFÍAS

Aras S., A. Duran y G. Yenilmez. 2003. Isolation of DNA for RAPD analysis from dry Leaf
material of some Hesperis L. Specimens. Plant Molecular Biology 21:461a–461f.
Avise J. C. 2004. Molecular markers, natural histori and evolution. Sinauer Associates, Inc.
Publishers. Massachusetts, EE.UU.
Blin N. y D. W. Stafford. 1976. A general method for isolation of high molecular weight
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Valero, T. (2010). "Comparación de métodos de extracción de ADN con muestras de aleta
de Oreochromis sp. y Atractosteus tropicus: extracción con fenol-cloroformo y extracción
modificada con cloruro de sodio". Universidad de San Carlos Guatemala.