Métodos para la extracción y purificación

de ADN bacteriano.

Lic. Anel Ledesma Rodríguez

Introducción Métodos para la extracción y purificación de ADN bacteriano.

• La aplicación de técnicas moleculares se inicia con la extracción de ADN y de este

1 proceso depende la obtención exitosa de datos confiables y reproducibles.

• Pueden ser aislados de cualquier material biológico, tales como tejidos vivos o
2 conservados, células, saliva,…

• En el pasado el proceso de extracción y purificación consumía tiempo, mano de

3 obra y su rendimiento era ilimitado.

• Actualmente existen muchos métodos especializados que pueden ser empleados

4 para extraer biomoléculas puras.

• Estos métodos permiten un alto rendimiento de la muestra y maximiza la

5 velocidad, exactitud y fiabilidad de la prueba.
Introducción Métodos para la extracción y purificación de ADN bacteriano.

Dr. Friedrich Miescher (1869)

Introducción Métodos para la extracción y purificación de ADN bacteriano.

Clasificación no filogenética de las bacterias

Etapas Métodos para la extracción y purificación de ADN bacteriano.
Lisis celular Métodos para la extracción y purificación de ADN bacteriano.

Métodos de lisis celular

Destrucción Tratamiento Digestión

mecánica químico enzimática
 Lisis celular Métodos para la extracción y purificación de ADN bacteriano.

Compuestos presentes en una solución de lisis:

Buffer: Tris-HCl pH=8 Agentes quelantes

Detergentes
Lisis celular Métodos para la extracción y purificación de ADN bacteriano.

Agentes reductores Agentes caotrópicos

• Sales
• Proteinasa K
• ARNasa
• Lisozima
• Lisostafina
 Purificación de ácidos nucleicos Métodos para la extracción y purificación de ADN bacteriano.

Mediante sales y alcoholes

(salting out)

Métodos
Con solventes orgánicos
convencionales

Gradiente de densidad de
CsCl-EtBr
Métodos de
extracción de ADN
Cromatografía de
Intercambio anionico
Matrices de síllice
Extracción en fase Cromatografía de
Partículas de vidrio
sólida adsorción
Tierra de diatomeas
Purificación por perlas
magnéticas
Métodos convencionales Métodos para la extracción y purificación de ADN bacteriano.

• Acetato de sodio pH=5,2

• NaCl
• Acetato de amonio
• Cloruro de Litio
• KCl

• Etanol (2 veces el
volumen)
• Isopropanol (2 o 3 veces
el volumen)
Métodos convencionales Métodos para la extracción y purificación de ADN bacteriano.
Método de extracción con solventes orgánicos
Métodos convencionales Métodos para la extracción y purificación de ADN bacteriano.

Método de gradiente de densidad de CsCl-EtBr

 Extracción en fase sólida Métodos para la extracción y purificación de ADN bacteriano.

Método de intercambio anionico

• Principio
La cromatografía de intercambio
anionico en fase sólida se basa
en la interacción entre los
grupos fosfatos del ADN
(cargados negativamente) y las
moléculas del sustrato (DEAE)
(cargadas positivamente).
Extracción en fase sólida Métodos para la extracción y purificación de ADN bacteriano.

Cromatografía de adsorción

Capacidad de adsorción de los ácidos nucleicos

en una columna de sílice o de vidrio ante
Extracción en fase sólida Métodos para la extracción y purificación de ADN bacteriano.

Matrices de sílice
• Alta afinidad del ADN por las partículas de sílice cargadas +
• Sodio desempeña un papel importante
• El ADN puede eluirse mediante un tampón TE o agua destilada

Partículas de vidrio
• Implica el uso de sales caotrópicas
• Principio similar al de la cromatografía de absorción

Tierra de diatomeas
• Contenido de sílice de hasta 94%
• Útil para la purificación de plásmidos y otros ADN
• Inmovilización del ADN en presencia de un agente caotrópico
 Extracción en fase sólida Métodos para la extracción y purificación de ADN bacteriano.

Método de purificación por unión a microesferas magnéticas

• Principio.
Utiliza esferas magnéticas
cuya superficie está
recubierta con polímeros
naturales o sintéticos que
presentan una alta afinidad
por los ácidos nucleicos.
 Calidad del ADN extraido Métodos para la extracción y purificación de ADN bacteriano.

• Pureza:
ADN de calidad relación 260/280 > de 1.8

• A260/280 > 2.1 presencia considerable de ARN en la muestra.

• A260/280 < 1.6 muestra está contaminada por proteínas o fenoles

• Funcionalidad:

El hecho de que ADN polimerasa pueda

actuar sobre una muestra de ADN como
molde de la reacción de PCR es indicativo
de que la pureza de la muestra es óptima
 Calidad del ADN extraido Métodos para la extracción y purificación de ADN bacteriano.

• Integridad:
 Ejemplos de protocolos de extracción Métodos para la extracción y purificación de ADN bacteriano.

500 ul de buffer de lisis Soluciones necesarias: Buffer de lisis (50 mM de Tris HCl, 50 mM EDTA ph 8, 1
10 ul de proteinasa K % de SDS y 50 mM de NaCl), Proteinasa K (10 mg/ml), NaCl ( 5 M), TE 1X ph.
8, Etanol o isopropanol absolutos a -20 ºC y opcionalmente RNasa A(10 mg/ml).

15.000 rpm
15 min.
5 ul RNAsa
2ml Incubar a 55ºC Pipetear 500 ul
2 horas o toda la noche sobrenadante a un tubo
limpio

Agregar igual volumen de Pipetear 500-600 ul 300 ul de cloruro de sodio

Vortex isopropanol o el doble de del sobrenadante a agitar brevemente
volumen de etanol a -20ºC un tubo limpio centrifugar por 15 min

Descartar sobrenadante con Descartar alcohol. Secar a 37ºC (2h).

cuidado de no tirar el pellet. Lavar Resuspender en 100 ul 1xTE.
con unos 750 ul de etanol 70º Agitar e incubar a 55ºC por 2 horas
Protocolo 2: Método de extracción con solventes orgánicos.

1-Centrifugar un ml de cultivo por 10 min a

6000 rpm (Gram +) y 3000 rpm (Gram –).

2-Lavar con tampón TE 1X.

3- Lisis celular resuspender el pellet en 200µl

de tampón TE 1X, con 2mg/ml de lisozima e
incubar durante 30 s a 37°C.

4-Para eliminar proteínas añadir 300µl de TE

1X, 1% de SDS y proteinasa K a una
concentración final de 100µg/ml. Incubar a
65°C por 2 h.
Métodos para la extracción y purificación
de ADN.

MUCHAS GRACIAS!