TEMA 7: LAS ENZIMAS.

CINÉTICA DE LAS REACCIONES MONOSUSTRATO

Las enzimas son catalizadores biológicos (generalmente proteínas) que incrementan la velocidad de las
reacciones en las que participan, sin que ellos sufran cambios y sin modificar la posición de equilibrio del
proceso (la cinética es distinta a la termodinámica, se puede modificar la velocidad sin modificar la
constante de equilibrio). Los reactivos de reacciones catalizadas por enzimas reciben el nombre de
sustratos.

NATURALEZA DE LOS ENZIMAS

Existen enzimas capaces de acelerar la reacción per sé, éstos son proteínas activas y RNAs catalíticos. Sin
embargo, muchas enzimas, las proteínas inactivas, necesitan de un cofactor para la catálisis. A la
proteína inactiva sin el cofactor se la llama apoenzima. Al conjunto de apoenzima y cofactor se le llama
holoenzima, y es la forma activa del enzima.

Los cofactores pueden ser moléculas orgánicas o iones metálicos. Cuando se trata de moléculas
orgánicas reciben el nombre de coenzimas. Cuando los cofactores están siempre unidos a la enzima y no
se separan, se les llama grupo prostéticos (unidos fuertemente). La mayoría de los cofactores pueden
considerarse como sustrato de la reacción, la denominación de cofactores en vez de sustratos se debe a
que son comunes a muchas enzimas diferentes y a que vuelven a ser regenerados (no necesariamente
por la misma proteína) tras la unión a la enzima.

El que muchos enzimas necesiten de cofactores se debe a que los enzimas, por ejemplo, no son capeces
de aceptar los electrones mientras que los iones sí. Se explica así la toxicidad de algunos metales, pues
inhiben a la enzima al sustituir al cofactor, de forma que la inactivan. Las cargas ayudan a posicionar al
sustrato en la posición adecuada, el Fe de por sí es un catalizador, pero funciones mejor con el enzima.

Muchos de los coenzimas no los podemos sintetizar (algunos cofactores inorgánicos tampoco), de forma
que debemos ingerirlos con la dieta. Vamos a ver algunos ejemplos de coenzimas:

- NAD+, vitamina B3 o niacina. La carencia produce la enfermedad de pelagra que se caracteriza

por la aparición de manchas en la piel y perturbaciones digestivas y nerviosas. La niacina se
puede sintetizar a partir de Trp. Estrictamente hablando, la vitamina B3 es una parte del NAD+,
concretamente la nicotinamida. En la nicotinamida es donde se va a producir la oxidoreducción.
La incorporación de H al NAD+ para dar NADH puede tener lugar por una cara o por la otra, esto
se debe a la especificidad enzimática.

- FAD, vitamina B2 o riboflavina. La oxidoreducción tiene lugar en los N del anillo de isoaloxazina.
PROPIEDADES DE LOS ENZIMAS (ventajas frente a catalizadores inorgánicos)

Los enzimas tienen un alto poder catalítico. Ejemplo: caso del Fe. La descomposición del H2O2 en H2O y
O2 la puede llevar a cabo el Fe2+, pero si añadimos la catalasa (enzima), la velocidad de la reacción (a
una misma temperatura) es seis órdenes de magnitud mayor. Ejemplo: disolución de CO2 para formar
bicarbonato. Reacción catalizada por a anhidrasa carbónica, que aumenta la velocidad de reacción seis
órdenes.

Los enzimas son muy específicos por sus sustratos y productos. Hay enzimas muy específicos y otros
menos específicos. Dentro de los poco específicos aparecen los enzima cuya especificidad se basa en
una especificidad de enlace (identifican un tipo de enlace), son enzimas que participan típicamente en
procesos degradativos (proteasas, fosfatasas…). Dentro de los enzimas más específicos se encuentran
los que tienen especificidad de grupo, como la hexoquinasa, que actúa sobre hexosas. Los enzimas más
específicos son los que tienen especificidad absoluta, como la aconitasa, que es un enzima asimétrico
que reconoce a una molécula proquiral que tiene que incorporarse en la posición adecuada para que
tenga lugar la reacción.

Los enzimas tienen la capacidad de ser regulados (por producto, modificación covalente, control
hormonal…)

CENTRO ACTIVO

El centro activo es la región del enzima a la cual se une el sustrato (o sustratos), y en ocasiones, otras
moléculas.

- Son regiones relativamente pequeñas del enzima.

- Hoyos y hendiduras de naturaleza hidrofóbica con algún residuo polar.
- Son entidades tridimensionales que implican a restos alejados en la estructura primaria
(estructura terciaria).
- Los sutratos se unen débilmente (puentes de H, interacciones hidrofóbicas…). En muy pocas
ocasiones se produce una interacción covalente.

La especificidad de los enzimas requiere una forma de unión del sustrato (contacto con al menos tres
zonas). Existen dos hipótesis de la interacción enzima-sustrato:

- Llave-cerradura (Fischer). La forma del centro activo es igual a la forma del sustrato desde el
comienzo.

- Ajuste inducido (Koshland). La complementariedad no existe en el enzima libre, sino en el

complejo enzima-sustrato. Esta hipótesis es más aceptada.
NOMENCLATURA Y CLASIFICACIÓN ENZIMÁTICA

Muchos enzimas se han bautizado añadiendo el sufijo –asa al nombre de su sustrato o a una palabra o
frase que describe su actividad. Otros enzimas recibieron nombres muy generales antes de que se
supiese cuál era su reacción específica. A veces el mismo enzima tiene dos o más nombres, o dos
enzimas diferentes tienen el mismo nombre. Debido a tales ambigüedades y al creciente número de
enzimas descubiertos se ha optado por acuerdo internacional un sistema de nomenclatura y
clasificación de los enzimas. Este sistema distribuye los enzimas en seis clases, cada una de ellas con
diferentes subclases, en función de la reacción que catalizan. Por tanto, si no se conoce la reacción que
cataliza una enzima no se la puede clasificar, y todos los enzimas que catalizan la misma reacción
tendrán el mismo nombre. Así mismo el nombre no debe darse más que a una entidad, por ejemplo, la
piruvato deshidrogenasa son varias entidades y debiera llamarse sistema piruvato deshidrogenasa.

1. OXIDOREDUCTASAS Procesos redox (tranferencia de electrones, hidruros e hidrógenos)

2. TRANSFERASAS Transferencia de grupos a excepción de electrones, hidruros e hidrógenos
3. HIDROLASAS Rotura de enlaces por adicción de agua
4. LIASAS Eliminación de grupos para formar enlaces dobles y viceversa

5. ISOMERASAS Reordenaciones intramoleculares

6. LIGASAS Unión de dos moléculas con consumo de enlaces ricos en energía

A cada enzima se le asigna un número clasificatorio que consta de cuatro partes, el código numérico EC
(ejemplo: EC 1.1.1.1). El primer número indica una de las seis clases de la clasificación. El cuarto número
es un número asignado a todos los enzimas que comparten los tres primeros números, es un número
asignado por la comisión de enzimas.

Dentro de una misma célula puede haber formas de una enzima que difieren en algún aspecto y aun así
catalizan la misma reacción. Por ejemplo la glucógeno fosforilasa una es a y otra es b, una está
fosforilada y otra no. Esto es lo que se conoce como formas múltiples de un enzima, la diferencia no
tiene un origen genético.

Los isoenzimas son enzimas que catalizan la misma reacción pero tienen diferente origen genético. Un
ejemplo son los isoenzimas de la lactato deshidrogenasa. A las isoenzimas se les dan números para
diferenciarlas y se diferencias por sus movilidades electroforéticas, de forma que la más cercana al polo
positivo recibe el número 1. Si se tiene un patrón de bandas complejo, teniendo bandas muy próximas,
los subgrupos se identifican con letras.

Los distintos isoenzimas y formas múltiples de una misma enzima tienen el mismo código enzimático.

Cuando se hace referencia a una enzima, lo correcto es que la primera vez que se escribe se use el
nombre sistemático seguido del código numérico. En menciones posteriores se puede usar el nombre
recomendado o trivial.
OXIDOREDUCTASAS

- Catalizan reacciones de oxidación-reducción (transferencia de hidrógeno, oxígeno o electrones).

- Las reacciones deben escribirse en el sentido de la oxidación del substrato principal.
- El nombre sistemático está compuesto por el nombre del dador y del aceptor separados por dos
puntos (:), seguido de la palabra oxidorreductasa.

El primer dígito del código numérico es 1. El segundo y el tercero se deciden según la naturaleza del
dador y el aceptor, respectivamente.

En el nombre recomendado, en el ejemplo mencionado se usa deshidrogenasa, pero hay otros casos en
los que se habla de reductasa, oxidasa, peroxidasa, monoxigenasa…

TRANSFERASAS

Catalizan reacciones de transferencia de grupos (que no sean hidrógeno, oxígeno o electrones) entre
sustratos distintos del agua.

El nombre sistemático se elabora así: dador : aceptor sufijo-transferasa, donde el sufijo indica el grupo
que se transfiere.

El segundo número indica el tipo general de grupo transferido, y el tercero el grupo transferido
concreto, excepto en el caso de grupos fosfato (EC2.7.x.y), en cuyo caso el tercer número depende del
tipo de aceptor.

Como nombres recomendados se suele utilizar metiltransferasa, carboxitransferasa… es decir, el

nombre sistemático sin la primera parte. A excepción de cuando se transfiere un fosfato, que se usa
quinasa.
HIDROLASAS

El segundo dígito indica el tipo general de enlace atacado, y el tercero, en general, el tipo de sustrato,
excepto cuando se trata de peptidasas, en cuyo caso el tercer número depende, excepcionalmente, del
mecanismo de reacción o del tipo de centro activo.

Normalmente a los enzimas de esta clase se les llama por el nombre trivial. Ejemplos de estos nombres
son: lisozima, peptidasa, tripsina…

Las ATPasas son hidrolasas. Los enzimas de restricción también son hidrolasas, además, todos ellos
tienen como segundo número del código enzimático el 1, y su tercer número es igual para todos ellos.
Además el cuarto número tan solo presenta tres variantes.

LIASAS

- Catalizan reacciones de ruptura no hidrolítica de enlaces C–C, C–O, C–N (u otros) con formación
de un doble enlace o de anillos. También las de adición de un grupo a un doble enlace.
- A efectos clasificatorios las reacciones se escriben siempre en el sentido de la ruptura o
remoción, de forma que sea una reacción monosustrato.

El segundo número indica el tipo general de enlace atacado, y el tercero el grupo eliminado.

El nombre sistemático se construye así: sustrato grupo eliminado-liasa. Se puede utilizar en el nombre
recomendado la palabra sintasa cuando el sentido biológico de la reacción es el de añadir un grupo.

ISOMERASAS

- Catalizan reacciones de reordenación intramolecular.

- Las oxido reducciones y las transferencias de grupos intramoleculares están incluidas en esta
clase y no en las clase 1 o 2, ya que la molécula completa no sufre oxidación ni reducción netas,
ni se modifica su composición elementa.
El segundo dígito indica el tipo de isomerización y el tercero el tipo de substrato. En esta clase el nombre
recomendado y el nombre sistemático suelen coincidir.

LIGASAS

Catalizan reacciones de formación de enlaces con ruptura de un NTP, siguiendo una de las ecuaciones
generales siguientes, que se diferencian en cuál de los dos enlaces ricos en energía se rompe. Nótese
que el fosfato no se incorpora a la molécula, aparece como producto.

El segundo número EC indica el tipo de enlace formado, al igual que el tercero que sólo resulta útil en el
caso de enlaces C–N (EC 6.3.x.y).

El nombre sistemático se construye así: reactantes que se unen separados por :, seguidos de la palabra
ligasa y entre paréntesis formadora de ADP o de AMP.

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

- Medir la variación en la concentración de sustrato o producto (velocidad inicial).

- Sustratos o productos deben poseer una cualidad diferencial medible (no debe ser común para
el sustrato y para el producto).

Métodos convencionales: ya sean continuos o discontinuos. Los métodos discontinuos hacen referencia
a un muestreo: cuando se saca la muestra es importante detener la reacción; hay que tomar varias
muestras, un mínimo de tres, para establecer una relación; como hay una tendencia a curvarse, interesa
el principio, cuando haya ocurrido menos del 20% de la reacción; y nos da un rango de segundo-décimas
de segundo.

Cinética rápida: flujo continuo o detenido (rango de milisegundos). Una técnica es el mezclado rápido,
donde el flujo es proporcional al flujo y al capilar y el tiempo se mide entre el punto de mezclado y el
punto de detección.

Técnicas de relajación (rango de picosegundos).

CINÉTICA DE LAS REACCIONES QUÍMICAS

La cinética se ocupa del estudio de la velocidad de las reacciones y de los factores que la afectan. En una
reacción sencilla A  B: la velocidad (v) en un momento dado, en el sentido de la flecha, se define como
el cambio de concentración de un reactante o producto por unidad de tiempo:

[ ] [ ]

La velocidad en un punto viene dada por la pendiente en dicho punto. Por tanto, la velocidad cambia en
función del tiempo. Nosotros siempre nos vamos a referir a velocidades iniciales.

VELOCIDAD Y ORDEN DE REACCIÓN

Reacción de primer orden: Una reacción del tipo A  B tiene una constante de velocidad (de izq a dcha)
k, y se dice que es de primer orden porque v=k[A]. Las dimensiones de k en reacciones de primer orden
son de s-1.

[ ]

[ ] [ ]
[ ] [ ]
[ ] [ ]

[ ] [ ]

De estas expresiones podemos calcular el tiempo mitad,

es decir, la vida media: . Tal y como se
observa, la vida media en reacciones de primer orden es
independiente de [A]0.

Gráficamente se puede saber si una reacción es de

primer orden si al representar Ln [A] frente al tiempo se
obtiene una recta, en la cual la pendiente es –k.

Reacción de segundo orden: Una reacción del tipo 2A  P, con una k constante de velocidad (izq a
dcha), es de segundo orden. Se tiene que v=k[A]2. Las dimensiones de k en reacciones de segundo orden
son M-1s-1.

[ ] [ ]
En este tipo de reacciones el tiempo de vida media si
depende de la concentración inicial de sustrato, se tiene
[ ] .

En este tipo de reacciones si representamos [ ]

frente a
t, tenemos la ecuación de una recta.

Una reacción del tipo A+B  C+D también es de segundo orden, v=k[A][B]. Sin embargo, se puede
convertir en pseudoprimer orden, por ejemplo, en el caso de que uno de los reactivos sea agua, ésta no
va a ser nunca un reactivo limitante.

¿CÓMO ACTUAN LOS ENZIMAS?

Para una reacción simple: S  P, tenemos que v=k[S]. Sabemos que los enzimas aumentan la velocidad
de la reacción, por tanto, han de actuar o sobre [S] o sobre k. Los enzimas no producen un aumento de
[S], afectan a la k, aumentando su valor. Los enzimas disminuyen el valor de la energía de activación.

Ecuación de Arrhenius
cte=constante preexponencial (factores espaciales y frecuencia de colisión)
R=constante universal de los gases
T=temperatura de la reacción en kelvin
Ea=energía de activación (también se representa como G++
k=constante de velocidad

La energía libre total liberada (o absorbida)

( durante la reacción afecta al sentido de la
reacción, pero no a su velocidad. no cambia por
la acción del enzima.

Como la enzima disminuye Ea, al disminuir Ea,

aumenta k, y por tanto, aumenta la velocidad de la
reacción.

Consideremos una reacción imaginaria, la rotura de una vara metálica magnética. En primer lugar (a),
imaginemos la reacción sin catalizar, para que se rompa la vara es preciso doblarla en primer lugar
(estado de transición).
Imaginemos ahora dos enzimas imaginarios (varasas) que pudieran catalizar esta reacción, utilizando en
ambos casos fuerzas magnéticas, equivalentes a las interacciones débiles entre enzima y sustrato. La
varasa b tiene una bolsa forrada de imanes complementaria en su estructura con la vara (el sustrato),
de forma que se estabiliza el sustrato y el doblamiento está impedido por la atracción magnética entre
la vara y la varasa. En un diagrama de la coordenada de reacción, este tipo de complejo ES
correspondería a un pozo energético del que le sería muy difícil salir al sustrato. Cuando el enzima es
complementario al sustrato, el complejo ES es más estable y tiene menos energía libre en el estado
basal que el sustrato solo, de forma que el resultado es un incremento de la energía de activación. La
varasa c tiene una bolsa de imanes complementaria al estado de transición, de forma que esto ayuda a
desestabilizar el sustrato y a la formación del estado de transición, dando lugar a la catálisis de la
reacción. Las interacciones entre el enzima y partes del sustrato proporcionan una cierta cantidad de la
energía necesaria para catalizar su rotura, esto se traduce en una menor energía de activación y un
mayor velocidad de reacción.

Abzimas (o anticuerpos catalíticos): Si se desarrolla un anticuerpo contra una molécula estable que es
semejante a un intermediario inestable de otra reacción (que potencialmente no está relacionada), el
anticuerpo desarrollado se unirá enzimáticamente a él y estabilizará el estado intermediario, catalizando
de ese modo la reacción. De este modo se produce un tipo nuevo de enzimas.

¿Cómo se consigue disminuir la energía de activación? El enzima estabiliza (menor energía) al estado
de transición, debido a la unión del sustrato al centro activo del enzima para formar el complejo ES.
Existen pruebas de la existencia de los complejos ES: observación directa al ME, cristalografía de rayos X,
técnicas espectroscópicas, datos cinéticos…
VALORACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Factores que alteran la velocidad de reacción: [E], [S], temperatura, pH, inhibidores y activadores. Una
unidad enzimática es una medida de la velocidad de reacción. La actividad de los enzimas se estima en
función de la velocidad de la reacción que catalizan en condiciones óptimas de:

- pH, se regula a un valor óptimo (vmáx y enzima estable a ese pH) para el funcionamiento del
enzima.
- Temperatura, en ocasiones es estable a 25ºC, otras veces a 30ºC o a 37ºC.
- [ST] saturante, es decir, que [ST]>>[ET]

Consideremos la reacción S  P, catalizada por un enzima E. Se tiene que v=k[E][S], una reacción de
segundo orden. Sin embargo, si hacemos que [ST] se encuentre en condiciones saturantes, tenemos un
procesos de pseudoprimer orden. Se observa una relación lineal entre v y E, donde la pendiente da el
valor de k, y a esta constante se la denomina constante catalítica (kcat) y tiene dimensiones de s-1. A
mayor kcat más velocidad de transformación de sustrato a producto. Se muestra en la gráfica de la
izquierda. Esto explica que las unidades de la actividad enzimática tengan dimensiones de velocidad.

Sin embargo hay ocasiones en las que se presentan problemas. En la gráfica del medio, inicialmente no
hay una relación lineal. Esta situación se puede dar en ejemplos como: el enzima está activo en forma
polimérica y los distintos monómeros del enzima se separan cuando hay mucha dilución, de forma que
al añadir enzima al medio, se va aumentando la polimerización y consiguiendo entonces la relación
lineal. Otro ejemplo es la presencia de un inhibidor, que a concentraciones pequeñas del enzima es
capaz de inhibirlo, pero cuando se añade mucho enzima, todo el inhibidor está neutralizado y se
consigue la relación lineal. Otro problema que se puede presentar es el de la gráfica de la derecha, se
produce una saturación del método que estamos utilizando.

En todas estas ocasiones hay que realizar siempre las medidas en el intervalo en el que hay linealidad.

UNIDADES DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Unidad Internacional (U): cantidad de enzima capaz de transformar 1 mol de sustrato/min en

condiciones óptimas de pH, temperatura y concentración de sustrato saturante.

Unidad del sistema internacional (katal): cantidad de enzima capaz de transformar 1 mol de sustrato/s
en condiciones óptimas de pH, temperatura y concentración de sustrato saturante.

1 katal = 6·107 U
La actividad específica relaciona las unidades de actividad enzimática con la cantidad de proteína total
de la muestra. Sus unidades se expresan como U/mg o katal/kg.

TERMINOLOGÍA

Antes de comenzar los siguientes apartados cabe dejar clara la terminología que vamos a emplear:

ST = S0 = sustrato total

S = sustrato libre (no combinado con el enzima)

ET = enzima total

E = enzima libre (no combinado con el sustrato ni con el producto)

DEPENDENCIA DE LA VELOCIDAD CON LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO

La gráfica de la izquierda se obtiene al representar v

frente a [ST] cuando [E] es constante.

A bajas concentraciones de sustrato se observa que la

curva se asemeja a una recta. La reacción es por
tanto, en esa zona, de primer orden. Sin embargo, a
altas concentraciones de sustrato, la curva tienen a
aproximarse a un valor máximo, de forma que los
consecutivos aumentos de la cantidad de sustrato no
producen un cambio en la velocidad. La reacción es
por tanto, en esa zona, de orden cero. En el trecho
intermedio hay un orden de reacción mixto.

La velocidad máxima (vmax) es el valor al que tiende la curva, la asíntota horizontal. Es la máxima de las
velocidades iniciales. Tiene dimensiones de velocidad. Tenemos entonces la ecuación de una hipérbola,
donde vmax = kcat [ET]. Es la ecuación de Michaelis-Menten, donde km es la constante de Michaelis y toma
dimensiones de concentración (molar).

[ ]
[ ]

Cuando v = vmax/2 se tiene que km = [ST]

La km es una constante para el enzima. Sin embargo, la vmax no es una constante característica del
enzima, es una constante para una concentración de enzima determinada (para otra concentración de
enzima toma otro valor).

La ecuación de Michaelis-Menten explica la curva:

- Cuando la cantidad de sustrato es muy grande, [ST]>>km y se tiene que v=vmax.

- Cuando la cantidad de sustrato es muy pequeña, km>>[ST] y se tiene que [ ], es decir,
v es directamente proporcional a [ST].
MODELO DEL EQUILIBRIO (HENRI Y BROWN)

El enzima y el sustrato se combinan para dar lugar a un complejo enzima-sustrato. Este proceso
(segundo orden) tiene una constante de velocidad k1, y la reacción inversa (primer orden), k-1. La
reacción de liberación de productos tiene un k2, aunque cabe la posibilidad de la reacción inversa, k-2.

Supuestos del modelo de equilibrio:

- Cuando la reacción se analiza de izquierda a derecha, suponemos que la cantidad de producto

inicial es 0. Esto implica que podemos despreciar la segunda reacción reversible, es decir,
podemos despreciar k-2.

- La unión de E y S es más rápida que la liberación de los productos. Es decir, la primera reacción
es más rápida que la segunda. Esto se debe a que el primer proceso es un equilibrio y solo una
pequeña parte transita a la producción de P. Por tanto, la etapa lenta, la limitante de la
velocidad, es la última, la k2. Se tiene pues que la velocidad es: v=k2[ES] (1).

Si añadimos una cantidad de sustrato muy grande: [ST]>>[ET], prácticamente todo ET será complejo ES
(condiciones de saturación): [ES]=[ET] y entonces vmax=k2[ET] (2), en las condiciones de saturación se
alcanza la velocidad máxima.

[ ][ ]
En el equilibrio se tiene: k1[E][S]=k-1[ES] (3) y por tanto: (4), donde Ks es la constante
[ ]
de disociación del sustrato.

Teniendo en cuenta que [ET]=[E]+[ES] (5):

Tomando el valor de [E] de (5), sustituyendo en (4) y despejando el valor de [ES] se tiene que
[ ][ ]
[ ] , sustituyendo en (1):
[ ]

[ ]
[ ]

Esta ecuación se diferencia de la ecuación de Michaelis-Mentes en que aquí tenemos [S] donde en
Michaelis-Menten tenemos [ST]. Sin embargo esta diferencia no es muy relevante, porque como
[ET]<<[ST], tenemos que el valor de [S] es muy próximo al de [ST], casi todo el sustrato está libre. Otra
diferencia con la ecuación de Michaelis-Menten es que en este caso la km es una constante de
disociación. km solo es Ks es condiciones de equilibrio.

Problema práctico: para expresar en concentración molar un enzima es necesario conocer los gramos
de enzima y la masa molecular (pues gramos entre masa molecular nos da moles y éstos los podemos
referir a un volumen determinado y tener la concentración molar). El problema es que hay que tener
purificado el enzima para poder conocer los gramos y la masa molecular.
MODELO DEL ESTADO ESTACIONARIO (BRIGGS Y HALDANE)

En los primeros momentos de la reacción, la concentración del producto es despreciable y se contempla

la simplificación de que puede ignorarse la reacción inversa P  S (descrita por k-2).

El cambio de [ES] respecto al tiempo será: d[ES]/dt=k1[E][S]-k2[ES]-k-1[ES].

La diferencia con el anterior modelo es que en este no se desprecia el segundo paso, es decir, se
considera más lento, pero aun así se tiene en cuenta.

Briggs y Haldane proponen la existencia de un estado estacionario en el que la concentración de

cualquiera de las formas en que se encuentre la enzima, prácticamente es constante, y por tanto:

d[E]/dt = 0 y d[ES]/dt = 0

La velocidad de aparición de productos será v=k2[ES] (1) y en condiciones de saturación se tiene que
[ES]=[ET] y entonces: vmax=k2[ET] (2).

[ ][ ]
En el estado estacionario se tiene que: k1[E]=k2[ES]+k-1[ES] (3) y se tiene que: [ ]

Sabiendo que [ET]=[E]+[ES] (4). Tomando el valor de [E] de (4), sustituyendo en (3) y despejando el valor
[ ][ ]
de [ES] se tiene que: [ ] , sustituyendo en (1):
[ ]

[ ]
[ ]

Cuando v=vmax/2, sustitiyendo en la ecuación tenemos que [S]+ =2[S], entonces [S]= y como

cuando v=vmax/2 la [S] es km, tenemos que

Por tanto la ecuación toma la forma:

[ ]
[ ]

Se observa un problema al analizar ambos modelos:

[ ][ ] Los términos coloreados parecen iguales, pero son cosas distintas. En

[ ] la ecuación superior hace referencia al estado de equilibrio, mientras
que en la de abajo, al estado estacionario.
[ ][ ]
[ ] Como son cosas distintas no es correcto decir que km=KS, ya que esto
solo se cumple en condiciones de equilibrio.
Por tanto, km se puede definir como:

- Concentración de sustrato para la cual se consigue la mitad de vmax

- Relación entre constantes de velocidad

MECANISMOS DE REACCIÓN COMPLEJOS

¿En que se traduce todo esto cuando hablamos de kcat y km?

En el caso simple kcat=k2 y km es una relación de constantes de velocidad (diferente relación en el

equilibrio que en el estado estacionario). La conclusión que debemos sacar es que la ecuación general es
válida para todos los casos, pero kcat y km cambian.

SIGNIFICADO DE Vmax y de kcat

Cuando [S] es saturante (al menos 50-100 veces la concentración de la km) entonces vmax=kcat[ET]. Si
conociéramos [ET] podríamos calcular kcat: [ ]
tiene como dimensiones s-1, como una constante
de primer orden. kcat coincide con k+2 en el caso más sencillo, en casos más complejos está compuesta
por varias constantes de velocidad, pero siempre tiene unidades de s-1.

kcat se llama número de recambio o actividad catalítica molar. kcat se define como el número de
moléculas de sustrato transformadas en producto por unidad de tiempo por una molécula de enzima,
en condiciones óptimas de pH, temperatura y cantidad saturante de sustrato.

Por tanto, mayor capacidad catalítica a mayor número de recambio. Si conseguimos aumentar kcat
aumenta la actividad de la enzima. kcat no depende de la concentración del enzima (tampoco de la
concentración de sustrato porque trabajamos en condiciones saturantes, de forma que el sustrato no es
un factor limitante), es una constante universal para cada enzima, mejor dicho, para cada pareja
enzima-sustrato (recordar que vmax no es una constante, depende de la concentración del enzima).
Así mismo indica la duración de un ciclo catalítico, es decir, cuanto tiempo tarda el enzima en
transformar una molécula de sustrato en producto.

SIGNIFICADO DE km

Es una constante para cada pareja enzima-sustrato, no depende de la concentración de enzima. Sus
valores oscilan entre 10nM y 0.1M (normalmente entre 1µM y 10mM). A valor más pequeño, mayor es
la afinidad del enzima por el sustrato.

Tiene unidades de concentración (M), es de forma aparente una constante de disociación. Solamente en
condiciones de equilibrio, coincide con la constante de disociación Ks de complejo ES.

La km es una relación de constantes de velocidad, así se definiría. Puede considerarse como una
constante de disociación aparente del enzima respecto a su sustrato o productos. Es indicativo de la
afinidad por sustratos y/o productos. También podría definirse como la concentración de sustrato a la
cual la velocidad que se obtiene es la mitad de la velocidad máxima.

SIGNIFICADO DE

[ ][ ] [ ] [ ] [ ]
[ ] [ ] [ ]
[ ] [ ]

[ ][ ]
[ ]
[ ]
[ ][ ]
([ ] )[ ]
v [ ]
[ ]

[ ]
[ ]( )[ ]
[ ][ ]
[ ]
( )

Por tanto, es una constante aparente de velocidad de segundo orden. Esta relación nos sirve para
saber si la reacción sigue el estado de equilibrio o el estado estacionario, mirando el rango de valores.

y entonces se tiene que: este cociente refleja la eficacia

catalítica de una enzima. Enzima eficaz: molécula de S que une, molécula de S que transforma en P. Es
decir, que S no tiende a liberarse del complejo ES.

Cuando k+2 >>k-1  , es decir, es una constante de asociación de dos ligandos. Este es un valor

máximo de tomando un rango de valores entre 107-109 M-1s-1.

Esto sirve para discriminar entre los modelos de reacción simples (equilibrio y estado estacionario):
 - Si M-1s-1 el enzima tiene alta eficacia catalítica, se corresponde con el modelo del
estado estacionario.
- Si M-1s-1 el enzima tiene baja eficacia catalítica, se corresponde con el modelo del
estado de equilibrio.

La relación también es indicadora de la especificidad (o preferencia) de un enzima por distintos

sustratos:

[ ][ ] [ ][ ]

[ ] [ ]

[ ]

[ ]

[ ] [ ]

de esta forma, determinando una sola velocidad de reacción para cada sustrato, si utilizo la misma
concentración de sustrato y de enzima, como se cumple la relación calculada, puede saber que sustrato
es preferente.

RELACIÓN DE HALDANE

Para una reacción catalizada en el equilibrio:

Teniendo en cuenta que la velocidad hacia la derecha viene dada por v+ y hacia la izquierda por v-:

[ ]

[ ]

[ ]
[ ]
Los enzimas acelaran la velocidad de las reacciones, pero no modifican la constante de equilibrio, que es
una función de estado. Por tanto, la relación entre esos parámetros tiene que ajustarse siempre a la
constante de equilibrio.

CÁLCULO DE km y Vmax

Tenemos que calcular valores de velocidad inicial para distintas concentraciones de sustrato, como
mínimo para 6 concentraciones de sustrato diferentes. Si tuviésemos algún indicio del valor de km, tres
valores menores que ésta y tres valores mayores que ésta. Además los valores han de cubrir un rango de
al menos un orden de magnitud. Hay que tener en cuenta el error experimental, por tanto para cada
uno de los puntos será necesario hacer 2-3 medidas, conociendo así la desviación típica. En abscisas se
representa la concentración de sustrato libre y en ordenadas la velocidad. Siempre que [ST]>>[ET] (no
confundir con condiciones saturantes) se va a cumplir que [ST]=[S].

Al representar v frente a [S] se obtiene una gráfica como la de la izquierda. Sin embargo, si al
representar v frente a [S] se obtiene una curva sigmoidal como la de la derecha, no podemos aplicar lo
que vamos a explicar ahora porque no sigue una cinética de Michaelis. Nosotros no centraremos en
gráficas tipo a la de la izquierda.

Cuando la cantidad de sustrato es muy grande, [ST]>>km y se tiene que v=vmax. Se tiene por tanto una
reacción de orden 0, ya que la velocidad no depende de [S]

Cuando la cantidad de sustrato es muy pequeña, km>>[ST] y se tiene que [ ], es decir, v es

directamente proporcional a [ST]. Se tiene por tanto una reacción de primer orden.

Para conocer el valor de estos parámetros se llevan a cabo diferentes tipos de transformaciones,
nosotros vamos a estudiar tres: Lineweaver-Burk, Eadie-Hofstee y Hanes-Wolf.

ECUACIÓN DE LINEWEAVER-BURK
En la imagen que muestra la ecuación v0 es lo mismo que v. Se obtiene una recta con una pendiente
positiva. Los puntos obtenidos experimentalmente nunca llegan a cortar al eje de ordenadas, porque
para ellos sería necesaria una [S] infinita. Nuestra estrategia consiste en extrapolar. La transformación
de L-B es la más utilizada pese a que es la menos precisa.

ECUACIÓN DE EADIE-HOFSTEE

La ecuación se obtiene multiplicando los dos términos de la ecuación L-B por vvmax. Se obtiene una recta
del tipo y=-ax+b, se espera pues una recta de pendiente negativa. Al igual que en la transformación L-B
nos encontramos limitaciones experimentales, y debemos extrapolar para conocer los cortes con los
ejes.

ECUACIÓN DE HANES-WOLF

La ecuación se obtiene multiplicando los dos

términos de la ecuación L-B por [S].

LIMITACIONES DE LAS LINEALIZACIONES

Las transformaciones vistas anteriormente

presentan una serie de limitaciones. En el
modelo original, en la ecuación de Michaelis-
Menten las barras de error son uniformes, sin
embargo en las tres transformaciones no lo son,
tal y como se puede observar en la imagen. Así
mismo se observa que la transformación H-W
aunque no tiene unas barras de error uniformes,
es más uniforme que las otras dos.
¿QUÉ PASA CUANDO [S] NO ES IGUAL A [ST]?

Todo este tiempo hemos estado suponiendo que [S]=[ST], cosa que se cumple cuando [ET]<<[ST]. Pero
hay circunstancias en que esto no se cumple. Por ejemplo: cuando la km está en el rango de nM; cuando
un enzima tiene una kcat muy pequeña, de forma que hay que echar mucha enzima; cuando el
instrumento utilizado para la medida tiene baja sensibilidad y hay que añadir mayores cantidades de
enzima.

Existe un sistema para saber si [S]=[ST] o no, o lo que es lo mismo si [ET]<<[ST], o no. Este sistema se
denomina método de Dixon.

Se representa v frente a [ST] y se traza la curva. A continuación se realiza un análisis sobre la curva. Los
puntos gordos son puntos de la curva que corresponden a puntos definidos de velocidad: ½ vmax, 2/3
vmax, ¾ vmax… es decir puntos de la forma: . Al unir el origen de coordenadas con cada uno
de los puntos gordos se obtienen rectas que cortan en un valor Sn a la asíntota que representa vmax. Los
Sn están equidistantes y la distancia que los separa es justo el valor de km. Si los segmentos no son
iguales, es decir, si los Sn no están equidistantes, quiere decir que hemos trazado mal la asíntota de v max.
La distancia entre S1 y el eje de ordenadas es mayor que km, es km+[ET]. Por tanto, si trazamos una recta
imaginaria que deje un segmento de valor km, podemos conocer [ET]. Si ese trozo que da [ET] es grande,
significa que es significativa. Si al trazar hacia atrás cae el segmento cerca del eje de ordenadas, [ET] es
despreciable respecto a [ST].

¿Por qué el segmento equidistante entre Sn y Sn+1 es la km? Nosotros no vamos a hacer una demostración
muy estricta. Sustituyendo vmax por kcat[ET] tenemos que [ ] (1). Teniendo en cuenta que
[ ] (2). Igualando (1) y (2) tenemos que:

[ ] [ ]
Así mismo, se pude establecer una relación entre “triángulos”, tal y como se observa en la gráfica. A
partir de esta relación se obtiene la siguiente ecuación:

[ ]
[ ]

A partir de esta última ecuación y de la del final de la página anterior se demuestra porque el segmento
equidistante entre Sn y Sn+1 es la km. Se obtiene a partir de estas dos ecuaciones que:

[ ]

RESUMEN

- La vmax no es una constante, es la máxima velocidad inicial para una concentración dada de
enzima.

- La k2 (kcat), número de recambio (s-1), es una constante característica de cada enzima y su

sustrato. Puede calcularse a partir de vmax y [ET].

- La km tiene unidades de [S] y es un indicio de la afinidad del enzima por sus sustratos.

- La relación permite evaluar la eficiencia de los enzimas. Los enzimas muy eficientes tienen
valores del orden de 107-109 M-1s-1.