Guia TP Micro 2012

Microbiología de
Alimentos
Dpto. Química Orgánica
GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS

CURSO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS
GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS
Tema Página
Enterococos 3
Estafilococos 4
Enterobacterias 5
Bacterias esporuladas 11
Bacillus 11
Clostridium 12
Clasificación e identificación de hongos y levaduras 14
Análisis de micotoxinas en alimentos 16
Análisis de leche fluida 19
Análisis de leche en polvo 24
Análisis de mantecas y margarinas 31
Análisis de helados 38
Análisis de conservas 43
Recuento de filamentos de hongos en conservas. Cámara de Howard 48
Análisis de azúcar 50
Análisis de carnes y productos cárnicos 53
Análisis de alimentos deshidratados 68
Análisis de agua 72
Tablas de NMP 76
Bibliografía 79
Anexo - Bioseguridad 80
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ENTEROCOCOS
-Objetivos:
-Introducción de los medios de cultivo y pruebas bioquímicas características de Enterococcus

faecalis. Pruebas bioquímicas diferenciales de otras bacterias relacionadas.
- Análisis de las cepas
1) Realizar la tinción de Gram.
2) Prueba de la Catalasa: Se emulsiona un ansa de cultivo en una gota de H2O2 10% sobre
portaobjetos. La efervescencia causada por la liberación de O2 indica la presencia de catalasa.
3) Sembrar en caldo infusión cerebro corazón o caldo glucosa e incubar a 10, 37, y 45ºC
durante 48 h.
4) Sembrar en caldo infusión cerebro corazón o caldo glucosa a pH 9,6 e incubar a 37°C
durante 48 h.
5) Sembrar en caldo infusión cerebro corazón o caldo glucosa al 6.5 % de NaCl e incubar a
37°C durante 48 h.
6) Sembrar en KF Streptococcus agar. Para observar la selectividad del medio estriar sobre
una mitad de la placa una cepa conocida no Enterococcus y en la otra mitad la cepa de
Enterococcus a investigar. Incubar a 37°C, 48 h. Las colonias típicas son pequeñas de color
rojo y el medio alrededor de las mismas vira al amarillo.
7) Sembrar en agar bilis-esculina. Incubar a 37ºC, 48 h. Las colonias típicas son pequeñas y
oscuras y el medio alrededor queda oscurecido.
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ESTAFILOCOCOS
-Objetivos:
-Introducción de los medios de cultivo y pruebas bioquímicas características de

Staphylococcus aureus. Pruebas bioquímicas diferenciales de otras bacterias relacionadas.
1) Realizar la tinción de Gram.
2) Prueba de la Catalasa: Se emulsiona un ansa de cultivo en una gota de H2O2 10% sobre
portaobjetos. La efervescencia causada por la liberación de O2 indica la presencia de catalasa.
3) Sembrar por estría en agar manita (Medio110 para estafilococos) dos cepas de
Staphylococcus sp. con distintas propiedades bioquímicas. Incubar a 37ºC, 48 h. Revelar con
solución saturada de sulfato de amonio o con HCl diluido para evidenciar la gelatinólisis.
Revelar con púrpura de bromocresol para la fermentación del manitol.
4) Sembrar en el medio Baird-Parker por estría dos cepas de Staphylococcus sp. Incubar a
37ºC, 48 h. Las colonias típicas de S. aureus son circulares, suaves, convexas, de 2 a 3 mm de
diámetro en placas poco crecidas, de grises a negras, rodeadas de un halo opaco y,
frecuentemente de un halo claro más externo. Ocasionalmente se encuentran cepas no
lipolíticas que no presentan halos. La apariencia puede ser seca y el color menos intenso si
proviene de un alimento congelado o desecado.
5) Prueba de la Coagulasa: Colocar 0,5 ml de plasma, de conejo o humano, citratado, diluido

en solución fisiológica, en un tubo de ensayo pequeño. Agregar un ansa de cultivo e incubar a
37°C. La aparición de grumos o coágulos en el término de 1 a 4 horas indica que la cepa es
coagulasa (+). Paralelamente hacer un blanco sin sembrar y un testigo con cepa de
estafilococo coagulasa (+).
6) Prueba de la Termonucleasa: Las placas de Baird-Parker en las que se observan colonias

típicas se colocan en estufa de 60°C durante 2 hs para inactivar las nucleasas termosensibles.
Luego de la inactivación verter en cada placa 10 ml de TDA (agar con ADN y azul de
toluidina) fundido. Incubar a 37°C durante 2 a 4 horas. La hidrólisis del DNA se evidencia
por la aparición de halos claros alrededor de las colonias.
7) Fermentación de manitol en anaerobiosis

Sembrar en caldo para fermentación con manitol. Cubrir con vaselina. Incubar a 37ºC, 48 h.
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ENTEROBACTERIAS
- Objetivos
-Reconocimiento de los grupos de microorganismos marcadores y patógenos más importantes

dentro de los miembros de esta familia.
-Introducción de los medios de cultivo y pruebas bioquímicas características de estos
microorganismos.
-Aplicación de técnicas serológicas para la identificación de Salmonella.
MARCADORES
1) Familia Enterobacteriaceae
Se trabajará con una cepa de enterobacteria y otra no enterobacteria.
a) Siembra en agar de aislamiento por la técnica de vertido en placa. Observación de

colonias típicas.
- Con cada una de las cepas 1), a partir de una suspensión bacteriana sembrar 1 ml en una
placa de Petri y volcar agar Bilis Rojo Violeta Glucosa (ABRV-G), fundido y mantenido a
44-46ºC. Homogeneizar rotando la placa. Confeccionar una sobrecapa de aproximadamente
10 ml del mismo medio fundido, mantenido a 44-46°C. Dejar solidificar. Incubar las placas
en posición invertida a 35-37°C durante 21+3 h. Observar las colonias. Se consideran
presuntas unidades formadoras de colonias de enterobacterias las colonias de color
púrpura con halo de precipitación.
b) Confirmación de colonias típicas. Características morfológicas y pruebas bioquímicas.
- Transferir una colonia típica de cada una de las placas a tubos de caldo glucosa y agar
nutritivo. Incubar a 35-37 °C durante 21+3 h.
- A partir del cultivo, realizar tinción de Gram. Observar al microscopio.
- A partir del agar inclinado realizar la prueba de la oxidasa.
- Observar la fermentación de glucosa por viraje del indicador ácido base.
Las colonias presuntivas que resulten bacilo-cocos Gram negativos no esporulados,
oxidasa negativas y fermentadoras de glucosa confirman la presencia de
Enterobacteriaceae.
2) Coliformes totales
Se trabajará con una cepa de coliformes y otra no coliforme.
a) Siembra en medio líquido (caldo de fermentación). Observación de reacción característica.

Confirmación en medio sólido EMB, colonias típicas de coliformes totales.
- Con cada cepa 2) sembrar 1 tubo de fermentación de caldo Lactosa-Verde Brillante-2%

sales biliares, con campanitas Durham. Incubar 35-37°C durante 48 h. Se considera reacción
positiva la producción de gas en la campanita de Durham.
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- Confirmación.
A partir de los tubos positivos, estriar una placa de agar EMB (Eosina Azul de Metileno)
según Levine. Incubar 24 h a 35-37°C.
Colonias metálicas, rosadas/rojas o de apariencia mucosa confirman la presencia de
coliformes totales.
b) Siembra en medio sólido ABRV-L (agar Bilis-Rojo-Violeta-Lactosa). Observación de

colonias típicas. Confirmación en medio líquido (caldo de fermentación), reacción positiva
característica de coliformes totales.
- Con cada una de las cepas 2), a partir de una suspensión bacteriana, sembrar por vertido en
placa 1 ml en una placa de Petri y volcar agar ABRV-L fundido y mantenido a 44-46°C.
Dejar solidificar y cubrir con sobrecapa de aproximadamente 10 ml del mismo medio fundido
y mantenido a 44-46°C. Dejar solidificar. Incubar las placas invertidas 24 h a 35-37°C.
Colonias de color rojo oscuro con halo de precipitación de sales biliares no menor de 0,5
mm se consideran presuntas unidades formadoras de colonias de coliformes.
- Confirmación.
Sembrar colonias típicas del ABRV-L en tubos de fermentación de caldo Lactosa-Verde
Brillante-2% sales biliares, con campanitas de Durham. Incubar uno a 35-37°C. La
producción de gas en la campanita de Durham confirma coliformes totales.
3) Coliformes a 45°C (coliformes fecales)

A partir de los tubos positivos 2) a), inocular un tubo de fermentación de caldo EC. Incubar
24 h a 45°C. La producción de gas en la campanita de Durham confirma coliformes a
45°C.
4) Escherichia coli
Se trabajará con una cepa pura de Escherichia coli y de otra bacteria coliforme.
a) Agar de aislamiento: EMB (agar eosina azul de metileno según Levine).

Sembrar ambas cepas por estría una placa de EMB según Levine. Incubar 24 h a 37°C.
Colonias con centro negro con o sin brillo metálico verde son características de
Escherichia coli.
b) Características morfológicas y pruebas bioquímicas

A partir de cada cepa
b.1) Realizar tinción de Gram.
b.2) Prueba de oxidasa.
b.3) Inocular un tubo de caldo triptona. Incubar 24 h a 37°C.
b.4) Inocular un tubo de caldo Clark y Lubs (RMVP). Incubar 24 h a 37°C.
b.5) Inocular por estría un tubo de agar Citrato Simons. Incubar 24 h a 37°C.
Investigación de Indol -Técnica de Kovacs:

Agregar al cultivo de b.3) 0,2-0,3 ml de reactivo y agitar. Esperar unos minutos.
Coloración roja en al parte superior del tubo indica formación de Indol (+).
Investigación de acidez - Prueba del Rojo de Metilo: Partir el cultivo de b.4) en dos alícuotas,
en una de ellas agregar 5 gotas de reactivo, observar inmediatamente.
Color rojo indica acidez (+).
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Características del indicador Rojo de Metilo:
pH < 4,4 rojo
4,4 < pH < 6 rango de viraje del indicador
pH > 6 amarillo
Investigación de acetil metil carbinol - Técnica de Voges-Proskauer modificada por Barrit.

Sobre la otra alícuota del cultivo de b.5) agregar respetando el orden:
- 0,6ml de α- naftol al 5% y
- 0,2ml de KOH al 40%
Agitar el tubo suavemente para exponer el medio al oxígeno atmosférico y oxidar la acetoína
(acetil metil carbinol) y permitir el desarrollo de color. Dejar descansar por lo menos 10-15
minutos.
El máximo desarrollo de color se observa luego de una hora.
Color rosado en la superficie: producción de acetoína (+), VP (+).
Color amarillo o cobrizo: no producción de acetoína, VP (-).
Investigación de utilización de citrato (b.5): Los microorganismos que son capaces de utilizar
el citrato producen cambio de color en el medio (de verde a azul). Se considera citrato (+) el
desarrollo de color azul.
Resultados típicos de Escherichia coli:

b.1) Bacilo coco Gram negativo sin esporas
b.2) Oxidasa (-)
b.3) Indol (+) (algunas cepas (-))
b.4) Rojo de Metilo (+)
b.4´) Voges Proskauer (-)
b.5) Citrato (-)
PATÓGENOS
Salmonella spp.
Se trabajará con una cepa pura de Salmonella spp. y de otra enterobacteria.
a) Medios sólidos (agar) de aislamiento. Observación de colonias típicas.

a) Sembrar por estría en agar Verde Brillante.
b) Sembrar por estría en agar Bismuto-Sulfito.
c) Sembrar por estría en agar Desoxicolato-Citrato (Leifson)
d) Sembrar por estría en agar Salmonella-Shigella.
Incubar las placas invertidas a 37°C durante 24 h. Observar las colonias resultantes.
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Colonias típicas de Salmonella spp.
- Agar VB: colonias pequeñas, traslúcidas e incoloras u opacas de un color intermedio entre
rosa y fucsia. El medio vira al rojo brillante.
- Agar Bismuto-Sulfito: colonias con centro negro, borde claro, precipitado negro con brillo
metálico alrededor (“ojo de conejo” u “ojo de pez “).
- Agar Leifson: colonias rosa pálido hasta incoloras, de 1mm de diámetro.
- Agar Salmonella-Shigella: colonias pequeñas, entre incoloras y rosa pálido, opacas y
traslúcidas. Algunas cepas dan colonias con centro negro (SFe). El medio vira al amarillo.
b) Características morfológicas, pruebas bioquímicas, confirmación serológica.

b.1) Realizar tinción de Gram.
b.2) Prueba de oxidasa.
b.3) TSI. Sembrar por punción y en superficie. Incubar a 37ºC, 24 h.
b.4) LIA. Sembrar por punción y en superficie. Incubar a 37ºC, 24 h.
b.5) BAM. Sembrar por punción con ansa recta. Incubar a 37ºC, 24 h. Alternativamente se
puede utilizar caldo urea.
b.6) Prueba de la β-galactosidasa: a partir de un cultivo en agar inclinado, tomar un ansa bien
cargada y emulsionarla en 0,2 ml de solución salina fisiológica hasta conseguir una
suspensión densa. Colocar un disco de ONPG. Incubar a 37ºC por 20 minutos. Observar hasta
las 4 horas de incubación para dar un informe negativo. El color amarillo indica que la
reacción es positiva.
b.7) Inocular un tubo de caldo triptona. Incubar 24 h a 37°C.
b.8) Inocular un tubo de caldo Clark y Lubs (RMVP). Incubar 24 h a 37°C.
Resultados típicos de Salmonella sp.

b.1) Bacilo coco Gram negativo sin esporas
b.2) Oxidasa (-)
b.3) TSI: profundidad: amarillo o negro, con o sin ruptura del agar por formación de gas/
superficie inclinada: rojo o sin variación.
Salmonella es lactosa (-), la mayoría de las cepas y sacarosa (-), la mayoría de las cepas.
b.4) LIA: profundidad: violeta o negro (negro en la mayoría de los casos)/superficie
inclinada: violeta Salmonella es lisina decarboxilasa (+)
Excepción: Salmonella paratyphi A: profundidad: amarillo
superficie inclinada: violeta
b.5) BAM:
- medio sin cambio de color. Salmonella es siempre ureasa (-), lac (-), la mayoría de las cepas
- móvil en la mayoría de los casos
- indol (-)
- H2S (+) en la mayoría de los casos
- sin formación de gas
b.6) β-galactosidasa: (-), sin cambio de color.
b.7) Indol (-)
b.8) Voges Proskauer (-)
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Identificación serológica de Salmonella sp.
Toda cepa sospechosa de Salmonella debe identificarse bioquímicamente antes de efectuar el

análisis serológico. De lo contrario aglutinaciones positivas podrán ser originadas por otros
gérmenes que poseen estrecha relación antigénica (Arizona, Citrobacter).
Las cepas sujetas a examen serológico deberán hallarse en su forma lisa (S), ya que en forma
rugosa (R), pueden perder sus caracteres específicos dando aglutinaciones falsas.
Sueros polivalentes somáticos de Salmonella

Los sueros polivalentes somáticos son 6: OS-A, OS-B, OS-C, OS-D, OS-E, OS-F.
Composición:
Los sueros OS-A y OS-B tienen las siguientes aglutininas correspondientes a los grupos
antigénicos Kauffman-White que se detallan:
OS-A: OS-B:
Grupo Aglutinina___ Grupo Aglutinina___
A 1,2 y 12 B 1, 4, 5 y 12
C1 6y7 D1 1, 9 y 12
C2 6y8 D2 9 y 46
F 11 E1 3 y 10
G1 1, 13 y 22 E4 1, 3 y 19
G2 13 y 23 L 21
H 6, 14 y 24
C3 8 y 20
Cabe señalar que los sueros OS-A y OS-B permiten identificar alrededor del 98% de los
serotipos más frecuentes de Salmonella.
Cuando una cepa de Salmonella (identificada previamente por sus características
bioquímicas), no dé aglutinación con ninguno de los sueros polivalentes somáticos, es
necesario tener en cuenta que la cepa puede:
a) presentar antígenos de envoltura V (Salmonella typhi), que inhibe la aglutinación O.
b) ser un secretorio no incluido en la lista (caso muy excepcional).
Técnica:
Aglutinación somática:
-Preparación del antígeno: utilizar un cultivo de estrías de 24 h de incubación a 37°C.
Suspender el crecimiento de la estría con 1ml de solución fisiológica.
-Reacción: sobre lámina de vidrio depositar una gota de c/u de los 2 sueros polivalentes
somáticos y los monovalentes. Colocar al lado de cada suero, una gota de suspensión
antigénica. Mezclar con un ansa previamente flameada y enfriada.
-Lectura: debe ser inmediata y no después de 5 minutos. Las reacciones tardías o dudosas no
deben considerarse.
Aglutinación flagelar:
-Preparación del antígeno: a partir de una colonia de Salmonella, hacer un cultivo de 24 h en
caldo. Luego agregar igual volumen de solución formolada al 5%.
-Reacción: en distintos tubos de ensayos colocar una gota de cada uno de los sueros
polivalentes y monovalentes ciliares. Agregar en cada uno 0,5 ml de la suspensión antigénica.
Incubar en baño maría a 50°C.
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-Lectura: se efectuará al cabo de una hora de incubación. Debe considerarse únicamente la
aglutinación de tipo ciliar (flóculos esponjosos, fácilmente disociables)
Si una cepa de Salmonella (previamente confirmada por su aglutinación somática), no
reacciona con ninguno de los sueros ciliares polivalentes hay que tener en cuenta que puede:
a) Tratarse de una variante inmóvil
b) Presentar otro tipo de antígeno ciliar no incluido en la lista.
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BACTERIAS ESPORULADAS
Género Bacillus
- Objetivo
Observar la morfología típica de colonias de Bacillus cereus en medios usados para su

aislamiento y recuento en alimentos; diferenciarlo de otras especies de Bacillus, y realizar las
pruebas bioquímicas útiles para su identificación.
1) Coloración de Gram: realizar la coloración según la técnica descripta en la guía de medios

de cultivo. Observar forma y tinción de las células vegetativas, forma y disposición de las
esporas.
2) Utilización de azúcares: sembrar una ansada del cultivo en cada uno de los tubos de caldo
con azúcares (glucosa-xilosa-arabinosa-manitol). Incubar 24-48 h a 37°C. Observar la
producción de ácido y/o gas.
3) Reducción de nitratos: sembrar una ansada del cultivo en caldo nitrato. Incubar 24 h a
37°C. Agregar los reactivos y observar.
4) Producción de acetoina: (VP) sembrar una ansada del cultivo en el medio VP modificado.
Incubar 48 h a 37°C. Agregar los reactivos A y B y agitar. Agregar unos cristales de creatina.
Leer el resultado luego de 1 h a temperatura ambiente.
5) Movilidad: inocular por punción el medio de movilidad. Incubar 24 h a 37°C. Observar

crecimiento.
6) Catalasa: sembrar por estría un tubo con agar nutritivo inclinado. Incubar 24 h a 37ºC
Colocar una ansada del cultivo sobre un portaobjeto y agregar unas gotas de H2O2 al 30%.
Observar.
7) Hidrólisis de gelatina: inocular el medio por punción. Incubar 24 h a 37°C. Enfriar en

heladera y observar el resultado.
8) Hidrólisis de almidón: sembrar una sola estría en agar almidón. Incubar 24 h a 37ºC.
Agregar solución de lugol y observar.
9) Hidrólisis de caseína: sembrar una estría o cuatro puntos en agar leche descremada o agar
caseína. Incubar 24 h a 37°C.
10) Lecitinasa: sembrar cuatro puntos en una placa de agar MYP (agar manitol-yema de
huevo-polimixina). Incubar 24 h a 37ºC .Observar morfología de las colonias.
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Género Clostridium
- Objetivo
Observar la morfología típica de colonias de C. perfringens en medios usados para su

aislamiento y recuento en alimentos; diferenciarlo de otras especies del mismo género;
familiarizarse con los distintos métodos de anaerobiosis.
1) Coloración de Gram: realizar la técnica descripta en la guía de reactivos y medios de

cultivo. Observar forma y tinción de las células vegetativas, forma y disposición de las
esporas.
2) Coloración de esporas: realizar la coloración de verde de malaquita. Observar las esporas.
3) Utilización de azúcares: sembrar 0,2 ml del cultivo en cada uno de los tubos de caldo con
azúcares (glucosa- maltosa-salicina-rafinosa-etc.), sin burbujear. Incubar 48 h a 37°C.
Agregar unas gotas de indicador. Observar acidez y/o gas.
4) Reducción de nitrato/movilidad: sembrar una ansada por punción en un tubo de agar

semisólido de nitrato. Incubar 24 h a 37°C. Agregar unas gotas de los reactivos. Observar los
resultados.
5) Hidrólisis de la gelatina: sembrar 0,2 ml del cultivo en el fondo de un tubo con agar
gelatina-lactosa, sin burbujear. Incubar 24 h a 37°C. Enfriar en heladera y observar el
resultado.
6) Hidrólisis de almidón: sembrar por estría en agar almidón. Incubar en anaerobiosis 24 h a

37 °C. Agregar solución de lugol y observar los resultados.
7) Leche: sembrar 0,2-0,5 ml del cultivo en un tubo con leche. Incubar 24 h a 37°C. Observar
coagulación y degradación del coágulo, por digestión de caseína. Observar formación de gas.
8) Hidrólisis de caseína: sembrar por estría en agar caseína. Incubar en anaerobiosis 24 h a

37°C. Observar resultados.
9) Esporulación: sembrar 0,2 ml del cultivo en caldo Duncan-Strong al fondo y sin burbujear.
Incubar 24 h a 37 °C. Realizar tinción de esporas.
10) Prueba de reducción de sulfito: inocular 0,2 ml del cultivo en agar hierro-sulfito
(SPS/TSN/TSC) fundido y mantenido a 45°C. Dejar solidificar e incubar 24 h a 37°C.
Observar la formación de colonias negras en el agar.
11) Lecitinasa: sembrar por estría en agar yema de huevo o similar. Incubar 24 h a 37°C.
Observar precipitado alrededor de las colonias.
12) Caldo de hígado con hígado: inocular 0,2 ml del cultivo en el caldo hígado + hígado.
Sellar con vaselina-parafina. Incubar 24 h a 37°C. Observar ennegrecimiento y digestión de la
carne (proteólisis) o enrojecimiento (sacarólisis) y/o producción de gas.
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Observaciones: los tubos con medios líquidos se cubren con vaselina o con vas-par (vaselina-
parafina)
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CLASIFICACION E IDENTIFICACION DE MOHOS Y LEVADURAS
I. MOHOS
El estudio de los hongos se basa en las siguientes características:

a) Si las hifas son tabicadas o no.
b) Si el micelio es claro u oscuro.
c) Si se producen o no esporas sexuales.
d) Tipos de esporas asexuales (esporangiosporas, conidios, artrosporas, blastosporas).
e) Aspecto de los esporangióforos y conidióforos: tipos de ramificación.
f) Presencia de estructuras y de esporas especiales, estolones, rizoides, clamidosporas, etc.
Plan de trabajo:
Se proveerá de distintos hongos que han crecido en un medio apropiado en tubo de ensayo y
con cada uno de ellos se harán microcultivos en la siguiente forma:
a) Se recortan cuadrados pequeños de agar Czapek con una espátula estéril.
b) Se colocan sobre un portaobjetos.
c) Se hacen toques en el centro de cada lado con un ansa contaminada con el hongo en
estudio.
d) Se coloca encima un cubreobjetos de mayor tamaño que el trozo de agar.
e) Se coloca el conjunto en una caja de Petri estéril que contiene algodón húmedo.
f) Se incuba a temperatura ambiente y se hacen observaciones periódicas a partir de las 48 h
para estudiar las distintas fases de crecimiento.
II. LEVADURAS
Para identificar las levaduras deben conocerse sus características morfológicas y bioquímicas.
Entre los datos morfológicos figuran aspecto del cultivo en agar extracto de malta, o en el
medio de Sabouraud, tamaño y forma de las células vegetativas, formación del micelio y
pseudomicelio, producción de ascosporas, tamaño y número de las mismas. Como datos
bioquímicos interesa:
- habilidad para fermentar azúcares.
- utilización de fuentes de C y N para su crecimiento (método auxonográfico).
Observaciones microscópicas
Las células provenientes de medios líquidos pueden observarse directamente entre porta y
cubreobjetos. Las levaduras provenientes de medios sólidos pueden observarse mejor si se
las mezcla sobre el portaobjetos con una gota de nigrosina al 5% en solución acuosa. La
observación al microscopio se hace por inmersión.
Coloración de esporas
Se usa el mismo método que para las bacterias.
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Aislamiento de mohos y levaduras
En el caso de los mohos o las levaduras que se encuentran en un producto mezclados con las
bacterias, para separarlos de éstas deben usarse medios de cultivo que favorezcan el
desarrollo de los primeros. En general se obtienen buenos resultados empleando:
- medios a base de infusión de vegetales, con el agregado de azúcares, por ej. agar-papa-
glucosa-ácido tartárico. El ácido tartárico se emplea para llevar el pH a 3,5 pues así se inhibe
el crecimiento de casi todas las bacterias.
- agar papa-dextrosa con agregado de 40 µg/g de cloranfenicol.
Los medios deben incubarse a temperatura comprendida entre 20 y 25 °C.
15
ANALISIS DE AFLATOXINAS EN ALIMENTOS
Existen dos tipos básicos de métodos para el análisis de aflatoxinas en alimentos:
a) métodos biológicos: realizados sobre animales de prueba sensibles al efecto tóxico (en
este caso generalmente se utilizan patos de un día pero también pueden emplearse embriones
de pollo, larvas de peces, etc.).
Son de utilidad para los estudios confirmatorios, particularmente cuando surgen dificultades
analíticas en el caso de ciertos alimentos. Pero estos métodos insumen demasiado tiempo para
el análisis de rutina como el que se precisa en un programa de control de calidad y para este
fin se requieren métodos químicos.
b) métodos químicos: el procedimiento para la determinación de aflatoxinas en un dado

producto consta en rasgos generales de las siguientes etapas:
1) muestreo y preparación de muestra para el análisis.
2) desgrasado (es necesario cuando el material contiene más del 5% de aceite).
3) extracción de la toxina utilizando un solvente adecuado.
4) purificación del extracto para eliminar material fluorescente interferente.
5) determinación de la concentración, generalmente por cromatografía en placa delgada,
en la cual se observa la fluorescencia característica de estas sustancias con luz
ultravioleta.
Según el producto que se deba analizar, algunas de estas etapas pueden omitirse.
En algunos productos, especialmente en el caso de granos y semillas, la etapa de muestreo
presenta dificultades. Esto se debe a la falta de homogeneidad de los lotes respecto a la
contaminación con aflatoxinas, ya que estas se encuentran, por lo general, en una proporción
muy pequeña en los granos y es difícil obtener una muestra representativa en condiciones
prácticas.
La selección del método a utilizar depende fundamentalmente del producto y del número de
muestras a analizar. Por ejemplo, en algunos casos la etapa de desgrasado puede omitirse y la
eliminación del aceite se realiza junto con la extracción, como veremos para el caso del maní.
En los casos en que hay interferencia fluorescente es necesario incluir una etapa de
purificación en columna cromatográfica.
AFLATOXINAS. REGLAMENTO TÉCNICO SOBRE LÍMITES MÁXIMOS DE

MERCOSUR. GMC RES No 056/94 (RES MS y AS No 110 del 4.04.95)
ALIMENTO AFLATOXINA LIMITE

Leche
Leche fluida M1 0,5 µg/l
Leche en polvo M1 5,0 µg/kg
Maíz
Maíz en grano (entero, partido, aplastado, mondado) B1+ B2+ G1+ G2 20 µg/kg
Harinas o sémolas de maíz B1+ B2+ G1+ G2 20 µg/kg
Maní
Maní (sin descascarar, descascarado, crudo o tostado) B1+ B2+ G1+ G2 20 µg/kg
Maní en ( pasta de maní o manteca de maní B1+ B2+ G1+ G2 20 µg/kg
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METODO PARA ANALIZAR AFLATOXINAS EN MUESTRAS DE MANI
(AOAC 970.45 1995)
1) Extracción
1 - Tomar 100 g de muestra molida y colocar en una licuadora junto con 4 g de NaCl, 500 ml
de metanol-agua (55+45) y 200 ml de hexano.
2 - Licuar 1 minuto a alta velocidad.
3 - Filtrar por papel de filtro.
4 - Tomar 25 ml de la solución metanol-agua (capa inferior) y colocarla en una ampolla de
decantación con 25 ml de cloroformo.
5 - Tapar la ampolla de decantación y agitar 1 minuto.
6 - Recoger la capa clorofórmica (inferior) y llevar a sequedad en baño maría bajo corriente
de nitrógeno o en un evaporador rotatorio.
7- Determinar la presencia de aflatoxinas por cromatografía en capa delgada.
2) Determinación de aflatoxinas por cromatografía en capa fina
Utilizar placas de sílica gel G o GF 254 según Sthal, de 250 micrones de espesor, activadas a
80°C durante dos horas. Los sistemas de solventes que se utilizan son: acetona-cloroformo
(1+9) y benceno-acetona-ácido acético (80+9+10) a temperatura ambiente.
Se utilizan cubas sin saturar y sin papel.
1 - Tomar el extracto seco con 250 microlitros de cloroformo.

2 - Sembrar en la placa 10 microlitros de la muestra a analizar, 10 microlitros de la muestra
con 10 microlitros de estándar interno y 10 microlitros de estándar.
3 - Correr la muestra durante 45 min (hasta que el solvente esté a 5 mm del borde superior de
la placa).
4 - Secar la placa boca arriba y en posición horizontal preferentemente en la oscuridad.
5 - Observar a la luz ultravioleta.
La ausencia de fluorescencia en los 10 microlitros de muestra sembrada indica menos de 25
microgramos/kg de aflatoxina.
3) Cuantificación por el método de comparación visual
1- Sembrar 2, 5 y 10 microlitros de aflatoxina B1 (estándar) y desarrollar el cromatograma.

2- Comparar la intensidad de fluorescencia de las manchas del extracto con la intensidad de
fluorescencia de las manchas del estándar.
3- Aplicar la siguiente ecuación:
Vs . Cs . Md
Concentración de aflatoxina (microgramos/kg) = ---------------------
Vx . P
Vs: volumen de estándar (microlitros) cuya intensidad de fluorescencia es igual a la que

presenta un determinado volumen de muestra.
Cs: concentración del estándar de aflatoxina B1 en microgramos/ml.
17
Md: volumen (microlitros) de la dilución final del extracto de muestra (para este caso 250
microlitros).
Vx: volumen de muestra (microlitros) cuya intensidad de fluorescencia es igual a la de Vs.
P: masa (g) de la muestra original en el extracto final (en este caso 5 g).
18
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE LECHE FLUIDA
1) Toma de muestra
Cuando el muestreo de leche fluida se realiza a partir de los tanques o tarros de las granjas
utilizados para el transporte a granel, los tanques de almacenamiento de las centrales lecheras
o los tanques móviles de almacenamiento hay que asegurarse de que se haya mezclado el
contenido hasta hacerlo homogéneo. Se vierte entonces una cantidad adecuada de leche en
condiciones asépticas en los recipientes de muestreo, utilizando para ello un cucharón o tubo
de muestreo esterilizado para cada muestra (ICMSF recomienda tomar por lo menos 30 ml de
muestra). Estas muestras se enfrían inmediatamente manteniéndolas a una temperatura de 0-
4ºC, y se envían al laboratorio.
Cuando se trata de un producto final envasado (como la leche pasteurizada), es preferible
llevar la muestra al laboratorio sin abrir. Se enfrían y se llevan al laboratorio lo más
rápidamente posible para que puedan comenzar los ensayos antes de que transcurran 36 h.
Previamente al análisis se mezcla la muestra cuidadosamente agitando o invirtiendo el
recipiente con el fin de lograr una distribución uniforme de los microorganismos en la
muestra.
2) Preparación de la muestra
Colocar 1 ml de leche en un tubo de dilución que contiene 9 ml de agua peptona al 0,1%.
Mezclar bien y realizar las diluciones siguientes tomando siempre 1 ml y transfiriendo este
volumen a 9 ml del medio de dilución. Se hacen tantas diluciones como sean necesarias.
3) Metodología de análisis
a) Recuento microscópico directo (recuento de bacterias totales en leche)

b) Recuento de bacterias aerobias mesófilas
c) Recuento de bacterias psicrotróficas
d) Recuento de coliformes totales
e) Determinación de coliformes totales
f) Recuento de coliformes a 45°C
g) Determinación de Escherichia coli

Método de Breed-Newman (APHA, 1976)
El método consiste en contar los microorganismos vivos y muertos de la muestra. La validez
de este método se limita a las muestras con recuentos elevados, mientras que aporta escasa
información respecto a las muestras que contienen un número reducido de microorganismos
Preparación de la película
1- Mezclar bien la muestra por agitación.
2- Transferir 0,01 ml al recuadro de un portaobjeto especial limpio. El recuadro marcado tiene
1 cm de lado.
3- Distribuir el material sobre el recuadro mediante un ansa cuyo extremo forme un pequeño
ángulo recto.
4- Secar el extendido al aire o bien colocándolo sobre una chapa caliente, cuidando que no
sobrepase los 45ºC.
5- Los extendidos de los alimentos ricos en grasa deben ser desengrasados sumergiéndolos en
xileno durante 5 minutos.
6- Luego de secar al aire se lo fija sumergiéndolo en alcohol absoluto durante 2-3 minutos.
19
7- Sin secarlo se lo tiñe con la solución colorante sumergiéndolo durante 30 segundos. El
exceso de colorante es eliminado colocando el borde del portaobjeto sobre un papel
absorbente.
8- Secar cuidadosamente al aire y, una vez seco, sumergir en una cubeta con agua lo
necesario como para que ésta no tome color. Secar al aire.
Solución colorante
Solución madre al 2% de Azul de Metileno en alcohol absoluto 96º. Se toman 30 ml de la
solución madre y se diluyen con agua destilada hasta 1 litro.
Examen microscópico
La película se examina primero con un objetivo seco de gran apertura y después con el
objetivo de inmersión.
Se calculan los microorganismos presentes en 1 ml de la porción de muestra de la siguiente
manera: cuando las células de un mismo tipo morfológico se presentan en racimos, éstos se
cuentan como unidades individuales, sólo si la distancia entre las células es igual o mayor al
doble del diámetro menor de las dos células que estén más próximas entre sí; las células de
morfología diferente o con tinción diferente se cuentan como unidades también diferentes
independientemente de su proximidad a las demás células.
Para examinar una parte representativa de la película, se escoge un campo de partida situado a
la misma distancia de cualquiera de los dos lados (punto medio del preparado sobre uno de
los lados) y dos o tres campos adentro a partir del borde (superior o inferior). Se cuentan los
campos de una serie a través de la película en forma horizontal, y después se empieza a contar
desde el centro que habíamos tomado como punto de partida una serie de campos separados
en un sentido perpendicular a la primera serie.
Si fuese necesario examinar un número mayor de campos, se repite la selección de campos
según la explicación anterior, partiendo de un punto situado a 2 mm de distancia de la primera
serie elegida. Se contarán entre 30 y 60 campos. Si el número de microorganismos es menor
de 30000 bacterias/ml ó g, se efectuará el recuento de 60 campos. Si es de 30000 bacterias/ml
ó g a 300000 bacterias/ml ó g basta el recuento de 20 a 30 campos. Si es mayor a 300000
bacterias/ml ó g se recuentan tantos campos como fuesen necesarios para obtener 150 a 200
gérmenes en la suma de todos ellos.
Cálculo
Se calcula el valor promedio de gérmenes por campo y se multiplica este valor por el factor
microscópico (FM) y por (la inversa de la alícuota tomada) el número recíproco de la
dilución:
RECUENTO Promedio de Recíproca de la

MICROSCÓPICO = microorganismos por campo * FM * dilución
DIRECTO/ml ó g
Donde FM = 100/A. A es el área del campo microscópico (la mayoría de los microscopios
para alumnos tienen un diámetro de campo de 0,16 mm). FM = 4970/cm
b) Recuento de bacterias aerobias mesófilas (FIL 100B: 1991)

1- Se vierte 1 ml de cada dilución por duplicado en placas de Petri y se agrega el agar para
recuento (APC) con 0,1 % de leche en polvo descremada ya fundido y mantenido a aprox. 44-
20
46ºC. Se mezcla para lograr una distribución homogénea. Siguiendo las mismas indicaciones,
sembrar tres diluciones sucesivas.
2- Cuando las placas estén frías se invierten y se incuban a 30ºC ± 1°C durante 72h ± 3h.
3- Se cuentan las colonias y se calcula el valor de recuento total siguiendo las pautas dadas en
el capítulo de muestreo. Se seleccionan las placas con recuento entre 25 y 250 colonias, se
multiplica el número promedio de colonias contadas en las placas por el factor de dilución
correspondiente y se informa como “UFC de bacterias aerobias mesófilas/ml ó g”.
c) Recuento de bacterias psicrotróficas (APHA, 1992)

Este recuento puede realizase bajo diferentes combinaciones de temperatura/tiempo.
1- Se procede de la misma forma que para el recuento de aerobios (b) pero incubando a 7ºC
por 10 días (ó, 21°C por 25 horas ó, 18°C por 45 horas). Se informa “UFC de bacterias
psicrótrofas /ml ó g”
d) Recuento de coliformes totales (FIL 73 A: 1985)

El recuento de coliformes totales puede realizarse por recuento en placa con medio sólido o
en medio líquido (por la técnica de NMP: número más probable).
d.1) Recuento en placa. Agar Bilis Rojo Violeta- lactosa (ABRV-lactosa)

Sembrar 1 ml de dos diluciones sucesivas por duplicado en placas de Petri. Agregar aprox.
12 ml de agar ABRV fundido a aprox. 44-46ºC. Mezclar. Dejar solidificar completamente y
agregar entonces 4 ml más de medio fundido. Dejar enfriar e incubar las placas invertidas a
30ºC por 22-26 h.
Seleccionar las diluciones que presenten entre 10 y 150 colonias. Contar las colonias rojas
oscuras con diámetro de por lo menos 0,5 mm, características de bacterias coliformes.
Confirmación: Tomar entre 5 y 10 colonias del ABRV y transferirlas a tubos de fermentación
con caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares (cada colonia a un tubo distinto).
Incubar a 30ºC por 22-26 h. Se consideran positivas aquellas colonias que den producción de
gas.
El resultado se calcula en base al número de colonias confirmadas. Se expresa como “UFC de
coliformes totales /ml ó g”.
La confirmación de las colonias es especialmente recomendable para el caso de alimentos que
contengan otros azúcares distintos de lactosa.
d.2) Técnica del número más probable (NMP)

Prueba presuntiva
Inocular por triplicado 1ml de muestra y de las diluciones sucesivas en tubos de fermentación
con caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares. Incubar a 30ºC por 48 h. Se
consideran positivos aquellos tubos que presenten formación de gas en la campanita de
Durham.
De ser necesario, inocular 10 ml de muestra en vez de 1 ml. En este caso se utilizarán tubos
doble concentración de caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares.
21
Prueba de confirmación
Estriar cada tubo presuntamente positivo en agar EMB (agar eosina azul de metileno).
Incubar a 30ºC por 22-26 h. Se consideran colonias de coliformes las de aspecto oscuro
rojo/rosado y/o mucoso, con o sin brillo metálico.
Registrar el número de tubos positivos de cada dilución. Con la ayuda de una tabla de
Número Más Probable (NMP), calcular el NMP de coliformes totales/ml ó g de muestra,
teniendo en cuenta los tubos positivos y las diluciones empleadas.
e) Determinación de coliformes totales (Basado en Mossel, 1985)

Inocular 1 ml de muestra en 10 ml de caldo triptona peptona de soja (CTS).
Incubar a 20-25ºC por 5-6 h. Agitar bien y volcar en un tubo que contenga 10 ml de caldo
Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares doble concentrado (con campanita de Durham).
Incubar a 30ºC ±1°C durante 18-24 h.
Los tubos en los que no se verifique formación de gas se consideran negativos. En este caso
se informa “ausencia de coliformes totales en 1 ml¨.
Agitar bien el contenido de los tubos positivos, resembrar por estría en agar EMB. Incubar a
37±1°C por 24 horas. Las colonias típicas de coliformes son oscuras, rojas-rosadas o
mucosas. Si se verifica crecimiento de estas características, se informa ¨presencia de
coliformes en 1 ml¨.
f) Recuento de coliformes a 45°C (APHA, 1992)

A partir de los tubos positivos en d.2 (coliformes totales a 30°C, por NMP), inocular un tubo
de fermentación de caldo EC. Incubar 24 h a 45°C. La producción de gas en la campanita de
Durham confirma coliformes a 45°C (coliformes fecales).
Número Más Probable (NMP), calcular el NMP de coliformes a 45°C/ml ó g de muestra,
g) Determinación de Escherichia coli (Mossel y Moreno García, "Microbiología de los

alimentos. Fundamentos ecológicos para garantizar y comprobar la inocuidad y calidad de los
alimentos."; Ed. Acribia, 1985).
Inocular 1 ml de muestra en 10 ml de caldo triptona peptona de soja (CTS).
Incubar a 30ºC ± 1°C durante 18-24 h.
se informa “ausencia de E. coli “
Agitar bien el contenido de los tubos positivos, resembrar por estría en agar Mac Conkey.
Incubar a 44ºC±0,1°C (preferentemente en baño de agua) durante 30 h. Si existiese
crecimiento típico (colonias rojas), tomar colonias aisladas y realizarles:
1- Gram
2- Siembra en tubo de fermentación caldo verde brillante 2% sales biliares con
lactosa. Incubar a 44°C por 48 horas.
3- Siembra en caldo triptona. Incubar a 44°C por 48 horas
4- Siembra en agar citrato. Incubar a 30°C por 48 horas.
Resultados característicos:
1- Cocobacilo Gram negativo no formador de esporas.
2- Fermentación de lactosa a 44°C con formación de gas.
22
3- Producción de indol a 44°C
4- No utiliza citrato
Alternativamente se pueden utilizar las pruebas del IMViC para la identificación.

De ser posible ensayar el cultivo sospechoso con un sistema de pruebas múltiples (API,
MICRO-ID, o semejantes).
En caso de confirmarse, informar “presencia de E. coli” en 1 ml de muestra. Indicar las
pruebas de identificación realizadas.
4) Antibióticos en leche
Durante el tratamiento de la mastitis, se usan antibióticos que pueden aparecer eventualmente
en la leche de los animales bajo tratamiento. Los antibióticos residuales, pueden producir
interferencias en el proceso de fermentación láctica, que se lleva a cabo para la fabricación de
quesos y otros productos lácteos.
Investigación de antibióticos
Un ensayo práctico consiste en calentar 100 ml de leche en un erlenmeyer por 2-5 minutos a
83ºC (para evitar falsos positivos debido a sustancias inhibidoras naturales en la leche cruda
que la pasteurización reduce pero no elimina completamente). Enfriar a 45ºC y agregar una
cucharadita de yogurt (Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus thermophilus). Incubar a
45ºC y examinar a las 2-3 h. Si la leche no ha coagulado es probable la presencia de
antibióticos.
23
ANÁLISIS DE LECHE EN POLVO
1) Toma de muestra
Para el muestreo, es preferible tomar como muestra los recipientes o paquetes originales, sin
abrir. Cuando haya que muestrear productos a granel, la muestra se tomará en un punto cerca
del centro del recipiente que la contiene, si es posible, quitando la capa superficial de polvo
con un instrumento esterilizado, y extrayendo después la muestra con una cuchara o varilla
esterilizada. ICMSF recomienda para cada producto a granel tomar no menos de 30 g.
Con una cuchara estéril mezclar el contenido del frasco de leche en polvo. Pesar
asépticamente 10 g de muestra en un erlenmeyer que contenga 90 ml de agua peptona 0,1%
previamente calentada a no más de 45ºC. Agitar hasta disolución de grumos.
Preparar las siguientes diluciones transfiriendo 1 ml a un tubo con 9 ml de agua peptona al
0,1%.
La mayoría de las leches en polvo pueden ser disueltas en agua peptona al 0,1% o en solución
salina de fosfatos tamponada. Las muestras más insolubles (por ejemplo leches de alta acidez)
se disuelven bien agregando 1,25 % de citrato de sodio a la solución de fosfatos.

b) Recuento de bacterias aerobias mesófilas
c) Recuento de coliformes totales
d) Recuento de coliformes a 45°C
e) Recuento de Staphylococcus aureus
f) Determinación de Salmonella

Método de Breed-Newman (APHA, 1976)
El método consiste en contar los microorganismos vivos y muertos de la muestra. La validez
de este método se limita a las muestras con recuentos elevados, mientras que aporta escasa
información respecto a las muestras que contienen un número reducido de microorganismos.
Preparación de la película
1- Mezclar bien la muestra por agitación.
2- Transferir 0,01 ml al recuadro de un portaobjeto especial limpio. El recuadro marcado tiene
1 cm de lado.
3- Distribuir el material sobre el recuadro mediante un ansa cuyo extremo forme un pequeño
ángulo recto.
4- Secar el extendido al aire o bien colocándolo sobre una chapa caliente, cuidando que no
sobrepase los 45ºC.
5- Los extendidos de los alimentos ricos en grasa deben ser desengrasados sumergiéndolos en
xileno durante 5 minutos.
6- Luego de secar al aire se lo fija sumergiéndolo en alcohol absoluto durante 2-3 minutos.
7- Sin secarlo se lo tiñe con la solución colorante sumergiéndolo durante 30 segundos. El
exceso de colorante es eliminado colocando el borde del portaobjeto sobre un papel
absorbente.
24
8- Secar cuidadosamente al aire y, una vez seco, sumergir en una cubeta con agua común lo
necesario como para que ésta no tome color. Secar al aire.
Solución colorante
Solución madre al 2% de Azul de Metileno en alcohol absoluto 96º. Se toman 30 ml de la
solución madre y se diluyen con agua destilada hasta 1 litro.
La película se examina primero con un objetivo seco de gran apertura y después con el
objetivo de inmersión.
Se calculan los microorganismos presentes en 1 ml de la porción de muestra de la siguiente
manera: cuando las células de un mismo tipo morfológico se presentan en racimos, éstos se
cuentan como unidades individuales, sólo si la distancia entre las células es igual o mayor al
doble del diámetro menor de las dos células que estén más próximas entre sí; las células de
morfología diferente o con tinción diferente se cuentan como unidades también diferentes
independientemente de su proximidad a las demás células.
Para examinar una parte representativa de la película, se escoge un campo de partida situado a
la misma distancia de cualquiera de los dos lados (punto medio del preparado sobre uno de
los lados) y dos o tres campos adentro a partir del borde (superior o inferior). Se cuentan los
campos de una serie a través de la película en forma horizontal., y después se empieza a
contar desde el centro que habíamos tomado como punto de partida una serie de campos
separados en un sentido perpendicular a la primera serie.
Si fuese necesario examinar un número mayor de campos, se repite la selección de campos
según la explicación anterior, partiendo de un punto situado a 2 mm de distancia de la primera
serie elegida. Se contarán entre 30 y 60 campos. Si el número de microorganismos es menor
de 30000 bacterias/ml ó g, se efectuará el recuento de 60 campos. Si es de 30000 a 300000
gérmenes /ml ó g basta el recuento de 20 a 30 campos. Si es mayor a 300000 gérmenes /ml ó
g se recuentan tantos campos como fuesen necesarios para obtener 150 a 200 gérmenes en la
suma de todos ellos.
Cálculo
Se calcula el valor promedio de gérmenes por campo y se multiplica este valor por el factor
microscópico (FM) y por (la inversa de la alícuota tomada) el número recíproco de la dilución
RECUENTO Promedio de Recíproca de la

MICROSCÓPICO = microorganismos por campo * FM * dilución
DIRECTO/ml ó g
Donde FM = 100/A. A es el área del campo microscópico (la mayoría de los microscopios
para alumnos tienen un diámetro de campo de 0,16 mm). FM = 4970/cm
b) Recuento de bacterias aerobias mesófilas (FIL 100B: 1991)

46ºC. Se mezcla para lograr una distribución homogénea.
Siguiendo las mismas indicaciones, sembrar tres diluciones sucesivas.
2- Cuando las placas estén frías se invierten y se incuban a 30ºC ± 1°C durante 72h ± 3 h.
25
correspondiente y se informa como “UFC de bacterias aerobias mesófilas/g”.
c) Recuento de coliformes totales (FIL 73 A:1985)

c.1) Recuento en placa. Agar Bilis Rojo Violeta- lactosa (ABRV-lactosa)

Sembrar 1 ml de dos diluciones sucesivas por duplicado en placas de Petri.
Agregar aprox. 12 ml de agar ABRV fundido a aprox. 44-46ºC. Mezclar. Dejar solidificar
completamente y agregar entonces 4 ml más de medio fundido. Dejar enfriar e incubar las
placas invertidas a 30ºC por 22-26 h.
gas.
coliformes totales/g”.
c.2) Técnica del número más probable (NMP)

Prueba presuntiva
Durham.
De ser necesario, inocular 10 ml de muestra en vez de 1 ml. Se utilizarán tubos doble
concentrado de caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares.
Incubar a 30ºC por 22-26 h. Se consideran colonias de coliformes las de aspecto oscuro/
Número Más Probable (NMP), calcular el NMP de coliformes totales/g de muestra, teniendo
en cuenta los tubos positivos y las diluciones empleadas.
d) Recuento de coliformes a 45°C (APHA, 1992)

A partir de los tubos positivos c.2 (coliformes totales a 30°C, por NMP), inocular un tubo de
fermentación de caldo EC. Incubar 24 h a 45°C. La producción de gas en la campanita de
Número Más Probable (NMP), calcular el NMP de coliformes a 45°C/g de muestra, teniendo
26
e) Recuento de Staphylococcus aureus (FIL 145:1990)
Se recomienda realizar el recuento sembrando por duplicado cada dilución.
En caso de requerir un inóculo más grande por un valor bajo del requisito microbiológico de
aceptación, puede hacerse una siembra combinada de la siguiente forma:
Distribuir 1 ml de dilución 1/10 equitativamente en la superficie de tres placas de agar Baird
Parker perfectamente secas. Distribuir con una espátula de Drigalsky cuidadosamente (tener
la precaución de enfriar bien la espátula para no matar los microorganismos). Dejar secar las
placas tapadas sin invertir a temperatura ambiente por aproximadamente 15 minutos. Una vez
secas, incubarlas invertidas a 37± 1ºC durante 24-48 h.
Tomar para enumerar placas con no más de 150 colonias. Seleccionar un número
representativo de colonias típicas y atípicas; y transferirlas a tubos de caldo infusión cerebro-
corazón. Incubar a 37°C ó 35ºC por 20 a 24 h.
Las colonias típicas son negras, brillantes y convexas rodeadas de una zona clara,
generalmente un halo opaco rodea a la colonia por dentro de la zona clara.
Identificación y confirmación
Sobre los cultivos puros de 20-24 horas, realizar:
- Tinción de Gram
- Catalasa
- Coagulasa (comparar con cepa patrón): Agregar 0,1 ml del cultivo a aprox. 0,3 ml de plasma
de conejo reconstituido en un tubo estéril. Incubar a 35-37°C. Examinar después de 4 a 6
horas. El coágulo formado debe ser firme y organizado (3+) o que no se cae al invertir el tubo
(4+).
Realizar un control empleando 0,1 ml de caldo BHI estéril en lugar del cultivo. Para que el
ensayo sea válido, no debe observarse ningún signo de coagulación.
Complementariamente puede realizarse la prueba de la termonucleasa sobre la misma placa
de Baird Parker.
S. aureus coagulasa positiva son cocos Gram positivos, catalasa positivo, coagulasa positivo
(3 o 4+) y termonucleasa positivo.
Informar “UFC de S. aureus coagulasa positivo/ g de muestra”. Para realizar el cálculo contar
el número total de colonias confirmadas en las tres placas.
f) Determinación de Salmonella (FIL 93 A: 1985)

Preenriquecimiento en medio líquido
Preparar un erlenmeyer con 225 ml de agua destilada con 1 ml de solución de Verde Brillante
(0,5% en agua, agregar verde brillante al agua; dejar la solución en la oscuridad por lo menos
un día para autoesterilizar).
Pesar asépticamente 25g de muestra en dicho erlenmeyer. Dejar a temperatura ambiente
durante aproximadamente 1 h sin agitar. Incubar a 37ºC durante 16-20 h.
Si al cabo de 3 h de incubación todavía no se ha disuelto la leche en polvo, agitar el frasco
para mezclar su contenido.
Enriquecimiento en medio líquido.

Transferir 10 ml de preenriquecimiento a 100 ml de caldo tetrationato (Müller Kauffmann).
Incubar a 43 ± 0,5ºC durante 18-24 h.
Transferir 10 ml del preenriquecimiento a 100 ml de caldo selenito-cistina. Incubar a 37± 1ºC
durante 18-24 h.
27
Aislamiento en medio sólido
A partir de cada uno de los enriquecimientos estriar una placa de agar Verde Brillante-Rojo
Fenol (agar BPLS) y una de agar Bismuto Sulfito (son cuatro placas en total). Incubar las
placas invertidas a 37 ± 1ºC durante 20-24 h.
De ser necesario, seguir incubando los caldos de enriquecimiento 18-24 h más y volver a
estriar en los medios de aislamiento.
Si al cabo del período de incubación el crecimiento en las placas fuera escaso, reincubar por
18-24 h adicionales a la misma temperatura.
Examinar las placas para investigar la presencia de colonias típicas de Salmonella. En agar
BPLS, las colonias son rosadas y el medio circundante rojo brillante. En agar Bismuto Sulfito,
las colonias típicas son marrones a negras con brillo metálico. Algunas cepas forman colonias
verdosas.
De cada placa seleccionar cinco colonias sospechosas. Estriar en una placa de agar nutritivo
para que desarrollen colonias aisladas. Incubar a 37± 1ºC durante 18-24 h. Al cabo de la
incubación, seleccionar colonias aisladas para proseguir con las pruebas de confirmación
bioquímica y serológica.
Sobre el cultivo puro realizar

- tinción de Gram
- oxidasa
Inocular los cultivos que resulten coco-bacilos Gram negativos y oxidasa negativos en los
siguientes medios.
- TSI: en superficie y en profundidad
- Medio LIA
- Medio para ureasa (puede ser BAM)
- β-galactosidasa
- Reacción de Voges Proskauer
- Reacción de indol
Consultar TP N°2 - Salmonella, para desarrollar los ensayos y consultar los resultados
característicos.
De ser posible confirmar el resultado con un sistema de pruebas múltiples.
Confirmación serológica
Seguir la técnica explicada en TP Nº 2: Enterobacterias – Salmonella.
Emplear una cepa patrón de Salmonella para controlar los medios de cultivo y los medios
empleados en las pruebas de confirmación e identificación.
Informar ausencia o presencia de Salmonella en la cantidad de muestra empleada en el
análisis (25 g, en este caso).
Aclarar modificaciones y pruebas bioquímicas realizadas.
28
REQUISITOS MICROBIOLOGICOS DEL CODIGO ALIMENTARIO ARGENTINO
- MERCOSUR
• LECHE
Art. 558 (Res. MSyAS N°047 del 28.01.98):

...La leche entera pasteurizada, deberá responder a las siguientes exigencias:
a) Estar exenta de gérmenes patógenos. Esta exigencia no se dará por cumplida si presenta:
1- Recuento total en placa: mayor de 50.000 bacterias mesófilas/cm3 en los meses de abril a
septiembre inclusive y mayor de 100.000 bacterias /cm3 en los meses de octubre a marzo,
inclusive.
2- Bacterias coliformes (recuento en placa con medio agar-violeta-rojo-bilis): mayor de
50/cm3
3- Escherichia coli: presencia en 1cm3. Deberá ser confirmada por pruebas bioquímicas.
4- Prueba de la fosfatasa positiva.
Art. 559 (Res. MSyAS N°047 del 28.01.98):

Leche entera seleccionada pasteurizada.
Sin haber sido sometida a ningún tratamiento previo, debe presentar un contenido microbiano
no mayor de 500.000 bacterias mesófilas/cm3.
La leche entera seleccionada pasteurizada deberá estar exenta de gérmenes patógenos. Esta
exigencia no se dará por cumplida si presenta:
1- Recuento total en placa: mayor de 25.000 bacterias mesófilas/cm3 de abril a septiembre,
inclusive y mayor de 35.000 bacterias mesófilas/cm3 de octubre a marzo, inclusive.
2- Bacterias coliformes (recuento en placa con medio agar-violeta-rojo-bilis): mayor de
10/cm3
3- Escherichia coli: presencia en 1cm3. Deberá ser confirmada por pruebas bioquímicas.
Art. 559bis (Res. MSyAS N°047 del 28.01.98):

Leche entera certificada pasteurizada.
Sin haber sido sometida a ningún tratamiento previo, no debe presentar gérmenes patógenos y
su contenido microbiano no debe ser superior a 10.000 bacterias mesófilas/cm3.
La leche entera certificada pasteurizada deberá estar exenta de gérmenes patógenos. Esta
exigencia no se dará por cumplida si presenta:
1- Recuento total en placa: mayor de 5.000 bacterias mesófilas/cm3 en el momento de su
recepción por el consumidor.
2- Bacterias coliformes presencia en 1/cm3
Art. 559tris (Res. MSyAS N°328 del 21.05.97):

“Se entiende por leche ultrapasteurizada a la leche, homogeneizada o no, que haya sido
sometida durante por lo menos 2 segundos a una temperatura mínima de 138°C mediante un
proceso térmico de flujo continuo, inmediatamente enfriada a menos de 5°C y envasada en
forma no aséptica en envases estériles y herméticamente cerrados”.
29
Deberá responder a las siguientes exigencias:
CATEGORIA ICMSF VALORES

1- Recuento de mesófilos totales /cm3: 3 n=5 c=2 m=102 M=103
2- Recuento de coliformes a 30°C/cm3: 6 n=5 c=2 m<3 M=10
3- Recuento de coliformes a 45°C/cm3: 6 n=5 c=1 m<3 M=10
4- Prueba de la fosfatasa Negativa
5- Prueba de la peroxidasa Negativa
Leche UHT
Res MS y AS Nº 110 del 4.04.95
GMC Res. N° 78/94
MICROORGANISMOS CRITERIO DE ACEPTACION CATEGORIA METODO DE
I.C.M.S.F. ENSAYO
Microorganismos n=5 c=0 m= 100 2 FIL1008: 1991
aerobios mesófilos
viables/ml
Resoluciones MS y AS: N°003 del 11.01.95 y N° 433 del 25.06.97

Leche en polvo
Criterios microbiológicos y tolerancias
(Codex, Vol. H CAC/RCP 31-83) I.C.M.S.F. ENSAYO
Microorganismos n=5 c=2 m= 30000 M=100000 2 FIL100:A
aerobios mesófilos 1987
viables/g
Coliformes (a 30°C)/g n=5 c=2 m= 10 M=100 5 FIL 73A: 1985
Coliformes (a 45°C)/g n=5 c=2 m< 3 M=10 5 APHA 1992
Cáp. 24
S. aureus coag. pos./g n=5 c=1 m= 10 M=100 8 FIL 60A: 1978
Salmonella spp./25 g n=10 c=0 m= 0 11 FIL 93A: 1985
30
ANÁLISIS DE MANTECAS Y MARGARINAS
1) Preparación de la muestra y diluciones: (FIL 73 A:1985)

Colocar en un tubo estéril con capacidad para 50 ml, la muestra de manteca o margarina, de
forma de no superar el 50% de la capacidad del tubo.
Fundir la muestra en baño de agua a 45ºC durante 15 minutos agitando para evitar la
separación del suero de la grasa.
Transferir con una pipeta precalentada 10 ml de material del material fundido a un erlenmeyer
con 90 ml de agua de dilución estéril a 45ºC (dilución 1/10). Homogeneizar por agitación
evitando la separación de las fases. Las diluciones sucesivas se efectúan transfiriendo 1 ml a
tubos conteniendo 9 ml de agua de dilución estéril a 45ºC.
Alternativamente se puede trabajar solamente con la fase acuosa y sus diluciones. Permitir la
separación de las fases (dejar reposar a 45°C por no más de 15 minutos) y tomar de la fase
inferior: 1 ml equivale a 1 gramo de manteca.
a) Recuento de bacterias psicrotróficas

b) Recuento de bacterias proteolíticas
c) Recuento de bacterias lipolíticas
e) Recuento de coliformes a 45°C
f) Determinación de Escherichia coli
g) Recuento de hongos y levaduras
h) Recuento de Staphylococcus aureus
i) Determinación de Salmonella
a) Recuento de bacterias psicrotróficas (APHA, 1992)

Este recuento puede realizase bajo diferentes combinaciones de temperatura/tiempo.
Se procede de la misma forma que para el recuento de aerobios empleando agar para recuento
en placa (APC) con 0,1 % de leche en polvo descremada ya fundido y mantenido a aprox. 44-
sembrar tres diluciones sucesivas. Se incuba a 7ºC por 10 días (ó, 21°C por 25 horas ó, 18°C
por 45 horas). Se informa “UFC de bacterias psicrótrofas /ml ó g”.
b) Recuento de bacterias proteolíticas (APHA, 1992)

Medio de cultivo: agar para recuento en placa (APC) con leche al 10%.
Sembrar por duplicado 1 ml de por lo menos dos diluciones sucesivas en placas de Petri.
Agregar el agar fundido a 44-46ºC y mezclar para homogeneizar el inóculo en el agar.
Si el recuento esperado es bajo, puede realizarse un recuento combinado distribuyendo 10 ml
de la dilución 1/10 en tres placas de Petri y agregando luego agar de la misma forma que
antes.
Dejar solidificar. Incubar invertidas a 21± 2ºC durante 72 horas.
Para revelar, si no se observaran directamente los halos de clarificación, inundar las placas
con HCl 1% o ácido acético 10% durante 1 minuto, volcando luego el ácido.
Si el recuento se realizó en duplicado, emplear las placas que contengan entre 25 y 250
colonias. Tener en cuenta la dilución empleada.
31
Si se hizo el recuento combinado, contar el número de colonias en las tres placas.
Corresponden al número de bacterias proteolíticas en 1 g de muestra.
Informar como “UFC de bacterias proteolíticas /g”.
c) Recuento de bacterias lipolíticas (APHA, 1992)

Medio de cultivo: agar tributirina
Agregar el agar fundido a 44-46ºC y mezclar para homogeneizar el inóculo en el agar.
de la dilución 1/10 en tres placas de Petri y agregando luego agar de la misma forma que
antes.
Dejar solidificar. Incubar invertidas a temperaturas entre 20 a 30ºC durante 72 horas.
La hidrólisis de la tributirina se evidencia como una zona clara alrededor de las colonias.
Si el recuento se realizó en duplicado, emplear las placas que contengan entre 25 y 250
colonias. Tener en cuenta la dilución empleada.
Corresponden al número de bacterias lipolíticas en 1 g de muestra.
Informar como “UFC de bacterias lipolíticas /g”
d) Recuento de coliformes totales (FIL 73 A: 1985)

d.1) Recuento en placa. Agar Bilis Rojo Violeta- lactosa (ABRV-lactosa)

gas.
d.2) Técnica del número más probable (NMP)

Prueba presuntiva
Durham.
concentración de caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares.
32
Número Más Probable (NMP), calcular el NMP de coliformes totales/ml ó g de muestra,
e) Recuento de coliformes a 45°C (APHA, 1992)

A partir de los tubos positivos en d.2 (coliformes totales a 30°C, por NMP), inocular un tubo
de fermentación de caldo EC. Incubar 24 h a 45°C. La producción de gas en la campanita de
Número Más Probable (NMP), calcular el NMP de coliformes a 45°C/ml ó g de muestra,
f) Determinación de Escherichia coli (Mossel y Moreno García, "Microbiología de los

alimentos. Fundamentos ecológicos para garantizar y comprobar la inocuidad y calidad de los
alimentos."; Ed. Acribia, 1985)
Inocular 1 g de muestra en 10 ml de caldo triptona peptona de soja (CTS).
se informa “ausencia de E. coli en 1 gramo”.
Incubar a 44ºC± 0,1°C (preferentemente en baño de agua) durante 30 h. Si existiese
crecimiento típico (colonias rojas), tomar colonias aisladas y realizarles
1- Gram
2- Siembra en tubo de fermentación caldo verde brillante 2% sales biliares con
lactosa. Incubar a 44°C por 48 horas.
3- Siembra en caldo triptona. Incubar a 44°C por 48 horas
1- Cocobacilo Gram negativo no formador de esporas.
3- Producción de indol a 44°C
4- No utiliza citrato
Alternativamente se pueden utilizar las pruebas del IMViC para la identificación

33
g) Recuento de mohos y levaduras (FIL 94 B: 1990)
Agregar agar YGC (cloranfenicol-glucosa-extracto de levadura) fundido a 44-46ºC y mezclar
para homogeneizar el inóculo en el agar.
de la dilución 1/10 en tres placas de Petri y agregando luego agar YGC de la misma forma
que antes.
Dejar solidificar. Incubar sin invertir a 25± 1ºC durante 5 días.
Si se hizo el recuento por duplicado, contar las placas que contengan entre 10 y 150 colonias.
Si hay excesivo crecimiento contar la placa de mayor dilución aún cuando contenga menos de
10 colonias.
Corresponden al número de mohos y levaduras en 1 g de muestra.
Las colonias sospechosas o dudosas deben confirmarse por observación microscópica.
Informar el resultado como “UFC de mohos y levaduras /g de muestra”.
h) Recuento de Staphylococcus aureus (FIL 145:1990)

secas, incubarlas invertidas a 37±1ºC durante 24-48h.
corazón. Incubar a 37°C ó 35ºC por 20 a 24 h
Sobre los cultivos puros de 20-24 horas, realizar
- Tinción de Gram
- Catalasa
(4+).
Realizar un control empleando 0,1 ml de caldo BHI estéril en lugar del cultivo. Para que el
ensayo sea válido, no debe observarse ningún signo de coagulación.
de Baird Parker.
34
i) Determinación de Salmonella (FIL 93 A: 1985)
Pesar asépticamente 25g de muestra en dicho erlenmeyer. Dejar a temperatura ambiente
durante aproximadamente 1 h sin agitar. Incubar a 37±1ºC durante 16-20 h.

Transferir 10 ml del preenriquecimiento a 100 ml de caldo tetrationato (Müller Kauffmann).
Transferir 10 ml del preenriquecimiento a 100 ml de caldo selenito-cistina. Incubar a 37±1ºC
durante 18-24 h.

placas invertidas a 37±1ºC durante 20-24 h.
verdosas.
para que desarrollen colonias aisladas. Incubar a 37±1ºC durante 18-24 h. Al cabo de la

- tinción de Gram
- oxidasa
siguientes medios.
- Medio LIA
- β-galactosidasa
Consultar TP N°2-Salmonella, para desarrollar los ensayos y consultar los resultados

característicos.
35
Seguir la técnica explicada en TP Nº 2: Enterobacterias-Salmonella
análisis (25 g, en este caso).
36
- MERCOSUR
• Manteca
Art. 596
Res MS y AS Nº 003 del 11.01.95
Criterios microbiológicos y tolerancias

(Codex, Vol. H CAC/RCP 31-83) I.C.M.S.F. ENSAYO
Coliformes totales /g n=5 c=2 m= 10 M=100 5 FIL 73ª 1985
Coliformes (a 45°C)/g n=5 c=2 m< 3 M=10 5 APHA 1992
Cáp. 24
S. aureus coag. pos./g n=5 c=1 m= 10 M=100 8 FIL 145 1990
Salmonella spp./25 g n=5 c=0 m= 0 10 FIL 93ª 1985
• Margarina
Art. 551. (Res. 511. 9.4.86)
Deberá responder a las siguientes características microbiológicas:

Bacterias coliformes: máximo 10/g
Escherichia coli: ausencia en 1 g
Bacterias proteolíticas: máximo 50/g
Bacterias lipolíticas: máximo 50/g
Hongos y levaduras: máximo 50/g
37
ANALISIS MICROBIOLOGICO DE PRODUCTOS LACTEOS
HELADOS
Los productos lácteos congelados son responsables de algunas intoxicaciones e infecciones

intestinales. Con la denominación genérica de helados se entiende los productos elaborados
por la congelación de mezclas líquidas constituidas por leche, leche en polvo, leche
condensada, leche evaporada, manteca, crema de leche, zumos o jarabes de frutas, huevos
frescos, conservados, yemas de huevo, café, frutas naturales o confitadas, chocolate,
colorantes y demás sustancias de uso permitido. Las mezclas deben ser pasteurizadas. El
origen de las bacterias y otros microorganismos en los helados son las distintas materias
primas con las que se las prepara, utensilios que se emplean en el manipuleo y cualquier
contaminación que pueda llegar a ellos durante las operaciones.
1) Preparación de la muestra y diluciones (FIL 73 A: 1985)

Colocar el helado en un baño de agua caliente a 37°C, impedir que la muestra exceda esta
temperatura. Agitar para favorecer que se derrita y tomar la muestra de análisis ni bien se
derrita totalmente.
Pesar 10 g de helado en un erlenmeyer que contiene 90 ml de agua peptona 0,1% estéril.
Homogeneizar completamente. A partir de esta dilución (1/10) preparar las siguientes en
transfiriendo 1 ml a tubos con 9 ml de agua peptona 0,1%. Homogeneizar en agitador.
a) Recuento de bacterias aerobias mesófilas

b) Recuento de coliformes totales
c) Recuento de coliformes a 45°C
d) Determinación de Salmonella
e) Recuento de Staphylococcus aureus coagulasa positiva
f) Recuento de mohos y levaduras
a) Recuento de bacterias aerobias mesófilas (FIL 100 B: 1991)

sembrar tres diluciones sucesivas.
2- Cuando las placas estén frías se invierten y se incuban a 30ºC ± 1°C durante 72h ± 3 h.
correspondiente y se informa como “UFC de bacterias aerobias mesófilas/ml ó g”.
b) Recuento de coliformes totales (FIL 73 A: 1985)

en medio líquido (por la técnica de NMP: número más probable)
b.1) Recuento en placa. Agar Bilis Rojo Violeta- lactosa (ABRV-lactosa)

38
gas.
b.2) Técnica del número más probable (NMP)

Prueba presuntiva
Durham.
concentración de caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares.
Número Más Probable (NMP), calcular el NMP de coliformes totales/g de muestra, teniendo
c) Recuento de coliformes a 45°C (APHA, 1992)

A partir de los tubos positivos b.2 (coliformes totales a 30°C, por NMP), inocular un tubo de
fermentación de caldo EC. Incubar 24 h a 45°C. La producción de gas en la campanita de
Número Más Probable (NMP), calcular el NMP de coliformes a 45°C/g de muestra, teniendo
Pesar asépticamente 50 g de muestra en dicho erlenmeyer. Dejar a temperatura ambiente
durante aproximadamente 1 h sin agitar. Incubar a 37±1ºC durante 16-20 h.
39
Transferir 10 ml del preenriquecimiento a 100 ml de caldo tetrationato (Müller Kauffmann).
Transferir 10 ml del preenriquecimiento a 100 ml de caldo selenito-cistina. Incubar a 37±1ºC
durante 18-24 h.

placas invertidas a 37±1ºC durante 20-24 h.
verdosas.
para que desarrollen colonias aisladas. Incubar a 37±1ºC durante 18-24 h. Al cabo de la

- tinción de Gram
- oxidasa
siguientes medios.
- Medio LIA
- β-galactosidasa
Consultar TP N°2-Salmonella, para desarrollar los ensayos y consultar los resultados

característicos.
Seguir la técnica explicada en TP Nº 2: Enterobacterias -Salmonella
análisis (25 g, en nuestro caso).
40
e) Recuento de S. aureus (FIL 145:1990)
secas, incubarlas invertidas a 37± 1ºC durante 24-48 h.
corazón. Incubar a 37°C ó 35ºC por 20 a 24 h
Sobre los cultivos puros de 20-24 horas, realizar
- Tinción de Gram
- Catalasa
(4+)
de Baird Parker.
f) Recuento de mohos y levaduras (FIL 94 B: 1990)

Agregar agar YGC (cloranfenicol-glucosa-extracto de levadura) fundido a 44-46ºC y mezclar
para homogeneizar el inóculo en el agar.
de la dilución 1/10 en tres placas de Petri y agregando luego agar YGC de la misma forma
que antes.
Dejar solidificar. Incubar sin invertir a 25± 1ºC durante 5 días.
Si se hizo el recuento por duplicado, contar las placas que contengan entre 10 y 150 colonias.
Si hay excesivo crecimiento contar la placa de mayor dilución aún cuando contenga menos de
10 colonias.
Corresponden al número de mohos y levaduras en 1 g de muestra.
Las colonias sospechosas o dudosas deben confirmarse por observación microscópica.
41
- MERCOSUR
• Helados
Art. 1078 (Res 2141, 5.9.83): Los distintos tipos de helados deberán responder a las
siguientes exigencias microbiológicas:
I. Helados de elaboración industrial:
a) Ausencia de gérmenes patógenos. Esta exigencia se dará por no cumplida si el
producto presenta:
1. Recuento de bacterias aerobias mesófilas (PCA, 30ºC, 72 h): mayor de 100000/g
2. Bacterias coliformes: más de 100/g
3. Bacterias coliformes fecales: más de 1/g
4. Staphylococcus aureus coagulasa positiva: más de 500/g
5. Salmonella: presencia en 50 g
6. (Res. 23, 30.01.95): “Cuando el recuento de hongos y levaduras supere 100/g sólo
podrá recomendarse verificar las prácticas de elaboración y la calidad de las materias
primas utilizadas, no siendo este indicador habilitante para declarar al producto No
Apto para el Consumo”.
b) Ausencia de toxinas microbianas.
II. Helados de elaboración artesanal:

a) Ausencia de gérmenes patógenos. Esta exigencia se dará por no cumplida si el
producto presenta:
1. Recuento de bacterias aerobias mesófilas (PCA, 30ºC, 72 h): mayor de 200000/g
2. Bacterias coliformes: más de 150/g
3. Bacterias coliformes fecales: más de 1/g
4. Staphylococcus aureus coagulasa positiva: más de 500/g
5. Salmonella: presencia en 50 g
6. (Res. 23, 30.01.95): “Cuando el recuento de hongos y levaduras supere 100/g sólo
podrá recomendarse verificar las prácticas de elaboración y la calidad de las materias
primas utilizadas, no siendo este indicador habilitante para declarar al producto No
Apto para el Consumo”.
b) Ausencia de toxinas microbianas.
42
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE CONSERVAS ALTERADAS (APHA 1992)
1) Preparación de las latas

- Sacar las etiquetas y guardarlas; numerar las latas del lado que no se va a abrir.
- Registrar los datos del envase; pesar la lata y comparar con lo indicado.
- Examinar el exterior en busca de fallas de suturas, fugas, abolladuras, corrosión, etc.
- Lavar con agua y jabón, enjuagar bien y secar.
2) Apertura de las latas

a) Latas abombadas: deben tomarse precauciones para evitar proyecciones del contenido al
perforar la lata. Se recomienda enfriarlas previamente durante unas horas.
- Desinfectar la tapa bañándola con una solución de hipoclorito 2% durante 15 minutos;
retirar el exceso y secar con toalla estéril o en flujo laminar. No flamear.
- Colocar la lata dentro de un recipiente con un poco de hipoclorito de sodio al 2% y cubrirla
con un embudo de vidrio cuyo vástago está cerrado con algodón, a través del cual pasa una
varilla puntiaguda o punzón (todo el conjunto esterilizado).
- Perforar el centro de la lata con un golpe seco del punzón, y de ser posible, recoger el gas
que emana con un tubo invertido.
- Retirar el embudo cuando las presiones se hayan igualado y abrir la lata en forma normal
con un abrelatas estéril. Cubrir la superficie con una placa de Petri estéril.
b) Latas no abombadas:
- Desinfectar con hipoclorito 2% durante 15 minutos; retirar el exceso y flamear hasta
sequedad.
- Abrir con abrelatas estéril y cubrir con una placa de Petri estéril.
3) Toma de material
La técnica utilizada para obtener material y el punto de donde hay que tomarlo varían según
la naturaleza del producto.
- Líquidos: con pipeta estéril, sembrando directamente en los medios de cultivo.

- Semilíquidos: con pipeta de boca ancha, sembrando directamente en los medios de cultivo
o diluyendo con agua estéril.
- Sólidos en líquidos: tomar de ambas partes; 10 ml del líquido con pipeta estéril y 10 g de
sólido con espátula estéril.
- Sólidos: con espátula estéril o con sacabocados estéril, descargándolo con ayuda de una
varilla de vidrio flameada.
Los líquidos y semilíquidos se siembran directamente en los medios, a razón de 1-2 ml cada
10 ml de medio.
Los sólidos se transfieren a un recipiente estéril de boca ancha de 100 ml, que contiene 50 ml
de agua destilada estéril. Se agita para homogeneizar.
Se recomienda guardar parte de la muestra para repetir análisis en caso necesario.
4) Examen del contenido

Registrar el olor y aspecto del alimento y compararlos con las características del producto
normal.
Medir el pH.
43
5) Examen microscópico
Tomar material con un ansa y hacer un extendido, secarlo, fijarlo y colorearlo con cristal
violeta. Si el alimento es graso, enjuagar con xilol luego de fijarlo.
Si se dispone de microscopio de contraste de fases, realizar un montaje húmedo, de una
ansada del material con agua, cubrir con cubre-objetos y observar.
6) Cultivo
a) alimentos de pH mayor que 4,6

(Todas las determinaciones se efectúan por duplicado)
a.1) Microorganismos aerobios

Sembrar 2 placas de agar triptona-glucosa (GTA) por estría, incubándolas 4 días a 30-35 °C y
a 55 °C respectivamente. También pueden utilizarse tubos con caldo triptona-glucosa (GTB),
sembrando 1 ml o 1 g del alimento.
a.2) Microorganismos anaerobios

Tomar 2 tubos de medio PE-2 o carne cocida (CMM), calentar en baño María 20 minutos,
enfriar y sembrar 1 g o 1 ml del alimento sin burbujear. Sellar uno de ellos con Vas-par
(vaselina-parafina 50-50%) e incubarlo hasta 10 días a 35°C .Sellar el otro con agar al 2,5 %
fundido. Dejar solidificar y llevar a baño de 55°C para preincubar. Luego incubar en estufa de
55 °C, 4 días.
La marcha continúa según se indica en el esquema de la página siguiente.
b) alimentos de pH menor que 4,6
b.1) Microorganismos aerobios

Sembrar 2 placas de agar termoacidurans (TAA), por estría e incubarlas a 35 y 55°C
respectivamente. O bien sembrar 2 tubos de caldo suero de naranja (OSB) con 1 g o 1 ml de
del alimento e incubarlos 4 días de dichas temperaturas.
b.2) Microorganismos anaerobios

Fundir el agar termoacidurans (TAD) en tubos, enfriar a 45°C y sembrar 1 ml del alimento al
fondo sin burbujear. Dejar solidificar, incubar 5 días a 30-35°C.
b.3) Hongos
Sembrar por estría una placa de agar para recuento de hongos. Incubar 5-7 días a 28 °C.
44
ANÁLISIS MICROBIOLOGICO DE CONSERVAS DE BAJA ACIDEZ
MARCHA AEROBIA
MUESTRA
GTA/GTB
Aerobiosis
30-35ºC 55ºC
(hasta 4 días) (hasta 4 días)
crecimiento + crecimiento +
Examen microscópico Bacilos con o sin
esporas
Cultivo mixto Solo bacilos

Bacilos, cocos, NAMn 55ºC
hongos y levaduras. (hasta 10 días)
Contaminación NAMn 30-35ºC
post-proceso. (hasta 10 días)
crecimiento +
Esporas + Esporas –
Contaminación
post-proceso.
Esporas – Esporas +
Contaminación
post-proceso.
Shock térmico
85ºC 10 min
NAMn NAMn
30-35ºC 55ºC
Bacillus sp mesófilo Bacillus sp termófilo
Proceso térmico Enfriado insuficiente o
insuficiente temperatura muy alta de
almacenamiento
Crecimiento +
a 30 y a 55ºC
Bacillus sp. termófilo
facultativo
45
ANALISIS MICROBIOLOGICO DE CONSERVAS DE BAJA ACIDEZ
MARCHA ANAEROBIA
MUESTRA
PE-2 o CMM
Anaerobiosis
30-35ºC 55ºC
Examen microscópico Examen microscópico
Cultivo mixto Bacilos con o Bacilos largos y delgados de Bacilos cortos

Bacilos, cocos, mohos sin esporas tinción débil.
y levaduras. Bacillus sp. facultativo
Contaminación post- Anaerobios termófilos Insuficiente
proceso. productores de SH2 enfriamiento o
Insuficiente enfriamiento o temperatura de
temperatura de almacenamiento
almacenamiento muy alta muy alta
LVA 30-35ºC LVA 30-35ºC

Aerobiosis Anaerobiosis
Crecimiento + Crecimiento +
Bacillus sp. mesófilo Clostridium sp. mesófilo*
Posible contaminación Posible inadecuado proceso
post-proceso térmico
Crecimiento +
Aerobiosis y anaerobiosis
Cultivo puro Cultivo mixto *

Anaerobio facultativo
* Buscar toxina botulínica en el cultivo
46
ANALISIS MICROBIOLOGICO DE CONSERVAS ACIDAS
MARCHA AEROBIA
MUESTRA
TAA o OSB
Aerobiosis
30-35ºC 55ºC
Crecimiento + Crecimiento +
Bacillus sp. mesófilo Bacillus sp. termófilo o
(flat sour) termófilo facultativo
Proceso térmico (flat sour)
insuficiente Enfriamiento insuficiente o
alta temperatura de
almacenamiento
MARCHA ANAEROBIA MOHOS Y LEVADURAS
MUESTRA MUESTRA
TAD PDA o YGC

Anaerobiosis
25ºC
35ºC (hasta 5 días)
(hasta 5 días)
Crecimiento +
Anaerobios mesófilos
butíricos
47
METODO DE CAMARA DE HOWARD PARA RECUENTO DE FILAMENTOS DE
HONGOS EN CONSERVAS (AOAC 984.29, 1990)
1) Recuentos de hongos en conservas de tomate

Por ser los tomates de naturaleza ácida, es más fácil preparar sus conservas que las de otros
alimentos.
Los tiempos y temperaturas de calentamiento son relativamente bajos.
Si el productor emplea tomates sanos, se obtiene un producto de alta calidad que llena los
requisitos estipulados por las reglamentaciones, pero si no lo son y hay crecimiento fúngico
en ellos, el producto no resulta de buena calidad.
El recuento de mohos en cámara de Howard es una forma de conocer la calidad de los
productos terminados. Por este método se determina microscópicamente el porcentaje de
campos que contienen filamentos de hongos en una muestra de conservas de tomates.
2) Materiales
Se emplea un portaobjetos especial en el centro consta de un rectángulo de 15 x 20 mm que
está limitado a cada lado por depresiones y soportes paralelos. Estos están 0,1 mm más altos
que el rectángulo el cubre objeto queda apoyado sobre estas barras. El rectángulo, los
soportes y el cubreobjetos tienen superficies planas. Para facilitar la calibración del
microscopio, el rectángulo tiene dos líneas paralelas separadas 1,382 mm.
Para el recuento de mohos el campo del microscopio debe tener 1,5 mm2 (una circunferencia
de 1,382 mm de diámetro) y debe utilizarse una magnificación comprendida entre 90 y 125
aumentos totales (fig. 1).
Tratándose de jugo de tomate o de salsa ketchup la muestra es examinada tal como viene en el
envase. Pesar 20 g de muestra y colocarlo en un vaso de precipitados. Agregar 50 ml de agua
estéril y mezclar. En el caso de puré o pasta de tomates se agrega agua para obtener 8,37%-
9,37% de sólidos totales, lo cual puede verificarse midiendo el índice de refracción a 20°C
(1,3447-1,3460). Para facilitar la observación microscópica se recomienda usar como
diluyente un colorante que se prepara en la forma siguiente: disolver 0,1 g de azul de algodón
en 100 ml de lactofenol (partes iguales de fenol, glicerina, ácido láctico y agua). No se
colorean los protoplasmas viejos, pero sí los elementos anatómicos del tomate. Debe
limpiarse la cámara de Howard de modo que se produzcan anillos concéntricos con los
colores del arco iris, los cuales se pueden observar sosteniendo el portaobjetos en un ángulo
tal que la luz se refleje sobre el cubreobjetos. Los anillos de Newton se deben a la
descomposición de la luz cuando se adosan perfectamente dos cristales de superficies pulidas.
Sobre el portaobjetos se coloca una porción de la muestra bien homogeneizada, de modo tal
que cubra exactamente el centro y cuyo espesor sea suficiente para llenar completamente el
espacio existente entre porta y cubreobjetos. Es necesario evitar derrames laterales y en el
preparado no deben quedar burbujas de aire.
La iluminación debe ser normal ya que demasiada luz impide una observación adecuada.
La preparación se lleva al microscopio y se observan 25 campos normalizados. Para tal fin
con el objetivo de 10 aumentos se regula el ocular adecuado (8x, 10x, 12x) de forma tal que
las dos líneas paralelas grabadas en el portaobjetos sean tangentes al campo. Dicho campo
normalizado tiene un diámetro de 1,382 mm y una superficie de 1,5 mm2. Los 25 campos
deben observarse de modo tal que el resultado obtenido sea representativo del total del
preparado (método oficial). La distribución de campos ideal corresponde a la figura 2. Se
deben examinar por lo menos dos preparados.
48
Cada campo se observa anotando la ausencia o presencia de filamentos fúngicos; cuando la
identificación es difícil se usa un aumento de 200x. Debe usarse el tornillo micrométrico para
observar filamentos en todos los planos del preparado.
En el caso de observarse filamentos cortos, se consideran positivos aquellos campos en los
cuales la longitud agregada de no más de tres filamentos exceda 1/6 del diámetro del campo.
4) Cálculo
Se suman los campos positivos de ambas determinaciones, se multiplica por dos y se obtiene
el porcentaje de campos positivos.
Reglamentación bromatológica
En las conservas de tomate se establecen las siguientes tolerancias en el recuento de
filamentos en cámara de Howard (EE.UU. y Canadá):
1- Los jugos de tomate examinados, no deben tener más del 25% de campos positivos.
2- Las latas de tomates, ketchup, los purés de tomates, no deben superar el 60% de campos
positivos.
Reglamentación Bromatológica Nacional (CAA)

Todas las muestras de conservas de tomates (jugos, salsas, puré, extracto, ketchup)
examinadas al microscopio por el método de Howard diluidas de tal manera que contengan
8,37%-9,37% de residuo sólido, no acusarán más del 50% de campos con filamentos de
hongos.
figura 1 figura 2
49
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE AZÚCAR
Tan pronto se estableció que el azúcar puede contener bacterias, levaduras y mohos, que al
proliferar pueden producir deterioro en los alimentos enlatados y en las bebidas sin alcohol en
que se usa, se desarrollaron métodos adecuados para su recuento.
ANÁLISIS DEL AZÚCAR PARA PRODUCTOS ENLATADOS
Los laboratorios de la National Canners Association de USA pusieron a punto una serie de
ensayos, que, junto con otros, nos permiten reconocer la calidad del azúcar que se examina.
1) Muestreo
Tomar muestras de 250 g de 5 bolsas de cada lote. Estas muestras deben enviarse al
laboratorio en envases limpios y cerrados.
2) Preparación de las muestras

Colocar 20 g del azúcar en un erlenmeyer estéril de 150 ml marcado al nivel de 100 ml.
Agregar agua estéril hasta la marca, llevar rápidamente a ebullición y mantenerla por 5
minutos. Reemplazar el agua evaporada por agua estéril.
a) Esporas del “flat sour” o fermentación simple

b) Recuento total
c) Termófilos anaerobios que no producen SH2
d) Termófilos anaerobios que producen SH2
a) Esporas del “flat sour” o fermentación simple

Utilizar 5 cajas de Petri y pipetear en cada una 2 ml de la solución hervida del azúcar. Cubrir
y mezclar el inóculo con agar triptona glucosa. Incubar las cajas a 55 °C durante 48 h.
El recuento combinado de las 5 cajas representa el número de esporas en 2 g de azúcar
original. Se multiplica esta cuenta por 5 para expresar los resultados como: nº de esporas / 10
g de azúcar.
Las esporas del “flat sour” son características: son circulares y miden de 2 a 5 mm de
diámetro. Tienen un centro típico opaco y debido a la producción de ácido, en presencia del
indicador, habitualmente están rodeadas de un halo amarillo. Este halo puede ser
insignificante y aún faltar en algunos tipos que producen muy poca acidez. Las colonias sub-
superficiales aparecen como colonias puntiformes. Cuando las cajas tienen un exceso de
colonias y no pueden contarse las colonias típicas del “flat sour” se hará una segunda caja
usando una dilución mayor. Para fines prácticos basta hacer notar que los recuentos de las
muestras están por encima del estándar exigido.
b) Recuento total
El recuento total de esporas termófilas se hace a partir de las mismas cajas de Petri. El cálculo
se hace en la misma forma que para las esporas del “flat sour” incluyendo todas las esporas
visibles.
50
c) Termófilos anaerobios que no producen SH2
Dividir 20 ml de la solución del azúcar en 6 porciones aproximadamente iguales y sembrarlas
en 6 tubos de caldo hígado. Estratificar el medio con agar triptona. Solidificar el medio
inmediatamente por inmersión parcial en agua fría. Cuando se ha solidificado el medio
precalentar a 55°C e incubar a esta temperatura por 48 h. En estas condiciones se produce
rotura del agar y formación de ácido. A veces se produce olor a queso.
Es un método cualitativo con una aproximación cuantitativa lejana. Los resultados se
expresan como + o - . Por ejemplo: +++---.
d) Termófilos anaerobios que producen SH2

Entre ellos predomina el Clostridium nigrificans. Se dividen otros 20 ml de la solución del
azúcar en 6 porciones aproximadamente iguales y se las siembra en agar sulfito. Los tubos
deben ser hervidos por 5 minutos antes de la siembra y enfriados a 55°C. Se incuban a esa
temperatura durante 48-72 h. El medio debe estar sólido antes de llevarlo a la estufa.
Los microorganismos característicos se ponen de manifiesto por formación de áreas negras
típicas. Se las cuenta en los 6 tubos y multiplica el dato por 2,5; expresando el resultado como
nº de esporas de bacterias productoras de SH2 en 10 g de azúcar.
Normas aceptadas por la National Canners Association para usar en productos

enlatados
1) Recuento total de esporas termófilas: De 5 muestras de un lote de azúcar ninguna debe

tener más de 150 esporas en 10 g y el promedio de las muestras no debe ser superior a 125
esporas en 10g.
2) Esporas del “flat sour”: De 5 muestras ninguna debe tener más de 75 esporas en 10 g y el
promedio para todas las muestras no debe ser superior a 50 esporas en 10 g.
3) Esporas termófilas anaerobias: No más de 3 de las 5 muestras contendrán de estas esporas

(60%) y de cada muestra no deberá haber más de 4 tubos + de cada 6 (65 %).
4) Esporas de alteración sulfhídrica: No deberá haber más de 2 muestras + sobre las 5

muestras y cada muestra no deberá dar más de 5 colonias en 10 g (equivalente a 2 colonias
por cada 6 tubos).
51
ANÁLISIS DEL AZÚCAR PARA BEBIDAS SIN ALCOHOL
Teniendo en cuenta la flora más corriente en el azúcar industrial, The American Bottlers of
Carbonated Beverages (1953) de USA estableció el siguiente procedimiento de análisis:
1) Preparación de las muestras:

Colocar 100 g del azúcar en un erlenmeyer de 250 ml, que contenga 102,5 ml de agua
destilada estéril. Se deja disolver el azúcar.
a) Bacterias mesófilas
b) Levaduras y mohos
a) Bacterias mesófilas
Pipetear 2,1 ml de la solución en cada una de dos cajas de Petri. Se cubren y se mezcla el
inóculo con aproximadamente 12-14 ml de agar nutritivo. Se incuban las cajas durante 48 h a
30°C. Finalizado ese lapso el recuento combinado en ambas cajas representa el número de
bacterias en aproximadamente 2,5 g del azúcar original. El resultado se expresa por 10 g de
azúcar.
b) Levaduras y mohos
Se pipetean 2,1 ml de la solución de azúcar antes preparada en cada una de 4 cajas de Petri.
Se cubren mezclando con 12-14 ml de agar para recuento de mohos ajustado a pH 4,5-4,8
con ácido láctico 10 % justo antes de su uso. Se incuban las cajas a 30°C durante 2 a 3 días.
Al final de ese lapso el recuento combinado de colonias desarrolladas en la placa representa el
número de levaduras y mohos en aproximadamente 5 g de azúcar original. Se expresan los
resultados por 10 g de azúcar.
Normas aceptadas por The American Bottlers of Carbonated Beverages.
1) Bacterias mesófilas ------------------------------------------------------------ 200/10g
2) Levaduras --------------------------------------------------------------------- 10/10g
3) Mohos -------------------------------------------------------------------------- 10/10g
52
ANALISIS DE CARNES Y PRODUCTOS CARNICOS
1) Preparación de la muestra y diluciones (APHA 1992)

Se pesan 10 g de la muestra, mezclada asépticamente, en una mezcladora esterilizada y se
añaden 90 ml de agua peptona 0,1%. Se agita a la velocidad 15000-20000 rpm durante 2,5
minutos como máximo.
Se mezcla el alimento homogeneizado, agitándolo; se toma 1 ml con una pipeta y se vierte en
un tubo que contenga 9 ml de agua peptona 0,1%. Homogeneizar cuidadosamente. Las
diluciones sucesivas se preparan transfiriendo 1 ml a tubos conteniendo 9 ml de agua de
dilución estéril.

b) Recuento de bacterias psicrotróficas
c) Recuento de Enterobacteriaceae
e) Determinación de coliformes totales, coliformes a 45°C y Escherichia coli
f) Determinación de Escherichia coli
g) Determinación de Salmonella
h) Recuento de Staphylococcus aureus coagulasa positiva
i) Recuento de anaerobios sulfito reductores
j) Recuento de Bacillus cereus
k) Recuento de enterococos
l) Recuento de hongos y levaduras
m)Determinación de Listeria monocytogenes
n) Determinación de Escherichia coli O157:H7
a) Recuento de bacterias aerobias mesófilas (ICMSF 1983)

recuento (APC) fundido y mantenido a aprox. 44-46ºC. Se mezcla para lograr una
distribución homogénea. Siguiendo las mismas indicaciones, sembrar tres diluciones
sucesivas.
2- Cuando las placas estén frías se invierten y se incuban a 35+ 1ºC durante 48 h.
correspondiente y se informa como “UFC de bacterias aerobias mesófilas/g de muestra”.
b) Recuento de bacterias psicrotróficas (APHA 1992)

Aplicar el mismo procedimiento que en a) con las diluciones correspondientes. Incubar a
7+1°C por 10 días ó 16 h a 17+ 1ºC seguido de 3 días a 7+1ºC.
c) Recuento de Enterobacteriaceae
Sembrar 1 ml de dos diluciones sucesivas por duplicado en placas de Petri y volcar sobre
ellas agar Bilis Rojo Violeta Glucosa (ABRV-G), fundido y mantenido a 44-46ºC.
Homogeneizar rotando la placa. Confeccionar una sobrecapa de aproximadamente 10 ml del
mismo medio fundido, mantenido a 44-46°C. Dejar solidificar. Incubar las placas en posición
invertida a 35-37°C durante 21+3 h. Observar las colonias. Se consideran presuntas
53
unidades formadoras de colonias de enterobacterias las colonias de color púrpura con
halo de precipitación.
Confirmación de colonias típicas. Características morfológicas y pruebas bioquímicas.

- Transferir una colonia típica de cada una de las placas a tubos de caldo glucosa y agar
nutritivo. Incubar a 35-37°C durante 21+3 h.
- A partir del cultivo, realizar tinción de Gram. Observar al microscopio.
- A partir del agar inclinado realizar la prueba de la oxidasa.
- Observar la fermentación de glucosa por viraje del indicador ácido base.
Las colonias presuntivas que resulten bacilo-cocos Gram negativos no esporulados,
oxidasa negativas y fermentadoras de glucosa confirman la presencia de
Enterobacteriaceae.
d) Recuento de coliformes totales (APHA 1992)

Agregar aprox. 12 ml de agar ABRV lactosa fundido a aprox. 44-46ºC. Mezclar. Dejar
solidificar completamente y agregar entonces 4 ml más de medio fundido. Dejar enfriar e
incubar las placas invertidas a 30ºC por 22-26 h.
gas.
e) Enumeración de coliformes totales, coliformes a 45°C y Escherichia coli (FAO 1992)

e.1) Enumeración de coliformes totales
Prueba presuntiva
Inocular por triplicado 1 ml de diluciones sucesivas de la muestra en tubos de fermentación
con caldo Lauril Sulfato. Incubar a 35ºC por 48 h. Se consideran positivos aquellos tubos que
presenten formación de gas en la campanita de Durham.
Confirmación de coliformes totales

Transferir una ansada de los tubos positivos del ensayo anterior a tubos con Caldo Verde
Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares.
Incubar 24 h a 35ºC. Considerar positivos los tubos con producción de gas.
Calcular el NMP de coliformes totales/g.
e.2) Confirmación de coliformes a 45°C

A partir de los tubos positivos de Caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares en e.1)
inocular un tubo de fermentación de caldo EC. Incubar 24 hs a 45,5+0,2°C. La producción de
gas en la campanita de Durham confirma coliformes a 45°C. En caso negativo reexaminar a
las 48 h.
Registrar el número de tubos positivos de cada dilución.
Calcular el NMP de coliformes a 45°C/g de muestra.
54
e.3) Confirmación de Escherichia coli
Estriar una ansada de los tubos positivos de EC en e.2) en una placa de EMB. Incubar 18-24 h
a 35ºC.
Transferir colonias típicas a AN y efectuar ensayos de confirmación (IMViC y producción de
gas de lactosa) o set de pruebas múltiples.
Calcular el NMP de Escherichia coli/g de muestra en base a los tubos de EC confirmados.
f) Determinación de Escherichia coli en 0,1 g (Mossel 1985)

Inocular 1 ml de la dilución 1/10 en 10 ml de caldo triptona peptona de soja (CTS).
se informa “ausencia de E. coli”.
Incubar a 44ºC±0,1°C (preferentemente en baño de agua) durante 30 h. Si existiese
crecimiento típico (colonias rojas), tomar colonias aisladas y realizarles:
1- Gram
2- Siembra en tubo de fermentación caldo verde brillante 2% sales biliares con lactosa.
Incubar a 44°C por 48 horas.
3- Siembra en caldo triptona. Incubar a 44°C por 48 horas.
1- Coco bacilo Gram negativo no formador de esporas.
3- Producción de indol a 44°C.
4- No utiliza citrato.
Alternativamente se pueden utilizar las pruebas del IMViC para la identificación.

g) Determinación de Salmonella (ISO 6579: 1993)

Pre-enriquecimiento en medio líquido
Pesar asépticamente 10 g de muestra en un erlenmeyer con 225 ml de agua peptona
tamponada. Agitar para homogeneizar. Incubar a 37ºC durante 16-20 h.

Transferir 0,1 ml del preenriquecimiento a 10 ml de caldo Rappaport-Vassiliadis (RV).
Incubar a 42,5-43,5ºC durante 18-24 h.
Transferir 1 ml del preenriquecimiento a 10 ml de caldo selenito-cistina. Incubar a 36-38ºC
durante 18-24 h.
55
Fenol (agar BPLS) y una de agar MLCB (manitol-lisina-cristal violeta-verde brillante).
Incubar las placas invertidas a 36-38ºC durante 20-24 h.
BPLS, las colonias son rosadas y el medio circundante rojo brillante. En agar MLCB, las
colonias típicas son violetas y, a veces, con centro negro.
para que desarrollen colonias aisladas. Incubar a 36-38ºC durante 18-24 h. Al cabo de la
Sobre el cultivo puro realizar:

- tinción de Gram
- oxidasa
siguientes medios.
- Medio LIA
Salmonella es lisina decarboxilasa +, ureasa +, lactosa - (la gran mayoría de las cepas),
sacarosa - (la gran mayoría de las cepas).
De ser necesario, pueden realizarse las pruebas del indol (la mayoría de las cepas son -), la
prueba de Voges Proskauer (-), citrato de Simmons (la mayoría de las cepas son +), etc.
De ser posible confirmar el resultado con un test de pruebas múltiples.
análisis. Aclarar modificaciones y pruebas bioquímicas realizadas.
h) Recuento de Staphylococcus aureus coagulasa positiva (APHA 1992)

Siembra y aislamiento en medio sólido
Repartir 1 ml de la dilución adecuada entre 3-4 placas de agar Baird Parker. Realizar un
recuento combinado. Distribuir el inóculo con espátula de Drigalsky para obtener colonias
aisladas. Incubar a 35ºC durante 48 h.
Considerar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias. Seleccionar un número
representativo de colonias sospechosas y transferirlas a tubos de caldo infusión-cerebro-
corazón (BHI). Incubar a 35ºC por 24 h.
56
El volumen y las diluciones empleadas dependen de la contaminación que se espere en la
muestra. Recordar que no se recomienda sembrar más de 0,2 o 0,25 ml por placa. También
puede realizarse un recuento por duplicado sembrando 0,1 ml por placa.
Sobre los cultivos puros de 24 h realizar:
- Tinción de Gram
- Catalasa
- Coagulasa
- Termonucleasa (en la misma placa de Baird - Parker)
Sembrar en paralelo una cepa patrón para comparar con un positivo.
Para realizar los cálculos tener en cuenta las diluciones y las alícuotas sembradas. Aclarar las
modificaciones y pruebas bioquímicas realizadas.
Informar “UFC de S. aureus coagulasa positiva / g de muestra”.
i) Recuento de anaerobios sulfito reductores (Mossel 1982 mod)

Se siembran 2 tubos con agar TSC, fundido deaireado y mantenido a 44-45ºC con dos
diluciones consecutivas (1/10 y 1/100 preferentemente).
Al sembrar, tener la precaución de introducir la pipeta hasta el fondo del tubo. Comenzar a
eliminar el volumen de homogenato o dilución indicado, a medida que se va retirando la
pipeta y describiendo círculos para homogeneizar.
Los tubos preparados se incuban a 35-37°C por 18- 20 h.
Se cuentan las colonias negras por tubo (de ser posible se cuentan tubos que tengan entre 30+
10 colonias) Se expresa el número de UFC de anaerobios sulfito reductores por gramo de
muestra de acuerdo al factor de dilución utilizado.
j) Determinación de Bacillus cereus (APHA 1992)

Medio de cultivo: agar manitol-yema de huevo-polimixina (MYP). Sembrar en superficie 0,1
ml de dos diluciones por duplicado con un rastrillo para cada dilución. Después de sembrar
dejar secar e incubar por 20 ó 24 h a 30°C+ 2oC.
Transferir un número representativo de colonias típicas a agar nutritivo. Incubar 24-48 h a
37ºC. En estos cultivos puros ensayar:
- Gram
- catalasa
- tinción de esporas
- fermentación de glucosa (en caldo rojo fenol en anaerobiosis)
- caldo nitrato
- caldo Voges-Proskauer modificado
Calcular el número de colonias de B. cereus teniendo en cuenta las diluciones empleadas y las
colonias confirmadas. Informar como “UFC de B. cereus/g”.
k) Recuento de enterococos (APHA 1976)

Colocar 1ml de dos diluciones sucesivas en placas de Petri por duplicado. Volcar sobre las
mismas 10 a 15 ml de Agar KF con TTC. Incubar 48 h a 35+1ºC. Contar todas las colonias
rojas y/o rosas. Confirmar entre 5 y 10 colonias transfiriendo a Caldo BHI e incubando 24 h a
35ºC. Realizar Gram, catalasa, crecimiento en Agar Bilis Esculina, crecimiento en BHI NaCl
6,5% y en BHI a 45ºC.
Informar UFC de enterococos/g.
57
l) Recuento de mohos y levaduras (ISO 13681: 1995)
Sembrar por duplicado 1 ml de por lo menos dos diluciones sucesivas de la muestra en placas
de Petri. Agregar agar glucosa-extracto de levadura con oxitetraciclina y gentamicina fundido
a 44-46ºC y mezclar para homogeneizar el inóculo en el agar.
Dejar solidificar. Incubar sin invertir entre 20 y 25 ºC durante 5 días.
Contar las placas que tengan menos de 150 colonias.
m) Determinación de Listeria monocytogenes (USDA, FSIS. Laboratory Communication

Nº57, revised 1989)
m.1) Enriquecimiento
Enriquecimiento primario:
Colocar 25 ml (o g) de muestra en 225 ml de caldo UVM. Homogeneizar durante 2 minutos.
Incubar por 20 a 24 horas a 30°C.
Enriquecimiento secundario:
Transferir 0,1 ml del cultivo anterior a un tubo con 10 ml de caldo Fraser. Incubar 26 + 2
horas a 35°C.
Comparar la coloración de los tubos incubados con uno sin sembrar. Observar tubos
oscurecidos o ennegrecidos por la hidrólisis de esculina. Si el tubo no muestra oscurecimiento
se informa como "Ausencia de L. monocytogenes en 25 g".
En caso de muestras sospechosas de haber causado enfermedad, debe continuarse el análisis
estriando en agar de aislamiento y reincubando el caldo Fraser por otras 24 horas para realizar
otro aislamiento.
m.2) Aislamiento en medio sólido

A partir de los tubos oscurecidos estriar placas de agar MOX (*). Incubar 24-48 horas a
35°C. Las colonias típicas están rodeadas de una zona negra por hidrólisis de la esculina.
Complementariamente pueden emplearse otros medios de aislamiento:
- Agar MMA (Mc Bride Modificado): se incuba en condiciones anaeróbicas a 35°C por 24-48
horas. Las colonias típicas aparecen azul-gris o gris verdoso observadas con iluminación de
Henry con luz incidente a 45°.
- Agar PALCAM: se incuba a 35°C por 24-48 horas. Las colonias típicas son de color gris
verdoso con halo negro-parduzco (por hidrólisis de la esculina), sobre fondo rojo (porque no
fermenta manitol).
- Agar Oxford: se incuba por 24-48 horas a 35°C. Las colonias típicas están rodeadas de una
zona negra por hidrólisis de la esculina.
(*) En el caso del agar MOX utilizar hisopo estéril para sembrar la mitad de la placa y estriar
la otra mitad en ángulo recto.
m.3) Selección de colonias y reestriado en agar de hemólisis

Picar sucesivamente 5 colonias sospechosas de agar MOX.
Estriar este inóculo en una placa de agar base sangre con sobrecapa del mismo agar con 0,4%
de sangre de caballo (las placas deben ser finas para visualizar bien la hemólisis).
Incubar durante la noche a 35°C.
Las placas se examinan con luz fluorescente. Sostener la placa en ángulo recto a la luz
fluorescente.
58
Seleccionar colonias típicas de Listeria monocytogenes: colonias translúcidas de 1 a 2 mm de
diámetro con una delgada zona de β-hemólisis alrededor de la colonia y completo
aclaramiento del medio por debajo.
Las colonias características bien aisladas se pican y se transfieren a un tubo de caldo BHI y a
un tubo de agar para movilidad (alternativamente puede emplearse agar SIM) por punción con
ansa recta. Incubar durante la noche a 20-25°C.
Sobre los cultivos ensayar:
- Tinción de Gram
- Catalasa
- Movilidad típica:
En agar, observar línea de siembra difusa con forma típica de sombrilla invertida.
Del caldo: por la gota pendiente o en fresco.
Si se trata de una cepa bien aislada y pura, bacilo corto Gram positivo no formador de
esporas, catalasa (+), de movilidad característica y hemolítica; se procede a la identificación.
m.4) Identificación
A partir de cultivos puros, realizar pruebas para diferenciar L. monocytogenes de las otras
especies hemolíticas
- Camp Test
- Fermentación de ramnosa
- Fermentación de xilosa
Camp Test
Se realiza sobre una placa de agar sangre. Se inocula en forma de fina estría un cultivo fresco
de Staphylococcus aureus y otra línea paralela de un cultivo fresco de Rhodococcus equi. En
forma transversal se estrían, también como finas líneas y sin llegar a atravesar las estrías ya
hechas, cepas de Listeria monocytogenes, L. seeligeri, L. ivanovii (las tres hemolíticas) y L.
innocua (no hemolítica).
Una reacción Camp positiva se observa por aumento de la hemólisis en la zona cercana a S.
aureus o R. equi.
Especies Camp Test Xilosa Ramnosa

S. aureus R. equi
L. monocytogenes + - - +
L. seeligeri + - + -
L. ivanovii -/+ + + -
Se pueden realizar las siguientes pruebas complementarias (reacción característica de Listeria

spp.):
- Hidrólisis de esculina (+)
- Utilización de glucosa: medio O/F (+)
- Fermentación de manitol (-)
- Reducción de nitrato (-)
- Rojo de Metilo- Voges Proskauer (+/+)
- Oxidasa (+)
59
n) Determinación de E. coli 0157:H7 (USDA, FSIS. Laboratory Communication #38,
revisión 4)
n.1) Enriquecimiento
Pesar 65 g en 225 ml de caldo EC modificado con novobiocina. Agitar para homogeneizar.
Incubar a 35°C por 18-24 horas.
Incluir por lo menos un control positivo por cada grupo de muestras ensayadas. El inóculo
debe ser de aproximadamente 30-300 UFC por el volumen total de enriquecimiento.
Se registrarán todas las reacciones observadas en el control.
n.2) Test de screening

Se emplean dispositivos comerciales de ensayos rápidos para demostrar la presencia de cepas
con antígeno O157 en el caldo de enriquecimiento n.1).
Para las muestras negativas se informa ¨ausencia de Escherichia coli O157:H7 en 25
gramos¨.
Las muestras positivas se continúan analizando.
n.3) Aislamiento en medios sólidos

El caldo de enriquecimiento positivo en n.2) se diluye con diluyente fosfatado Butterfield´s.
Se inoculan placas de agar MSA-BCIG con 0,1 ml de diluciones 10-4, 10-5, 10-6 y 10-7.
Distribuir homogéneamente con espátula de vidrio. Incubar a 42°C durante la noche.
Las colonias características de Escherichia coli O157:H7 son blancas (sorbitol negativas) y
no son fluorescentes (β-glucuronidasa negativas).
Preparar un juego de PRS-MUG y EMB para cada muestra sospechosa. Dibujar sobre el
vidrio, en la parte de atrás de la placa, una grilla de 12 secciones y numerarlas.
Tomar aproximadamente 12 colonias sospechosas y estriar en la zona central de la sección de
EMB y hacer una punción en la zona correspondiente de PRS-MUG.
Incubar las placas a 35°C durante la noche
Colonias típicas:
Examinar los pares de placas. Se continúan analizando solamente aquellos aislados que den
colonias características en ambos medios.
Las colonias características de Escherichia coli O157:H7 resultan:
Agar PRS-MUG: colonias sin cambio de color (color amarillo significa que fermentó
sorbitol) y sin fluorescencia a la luz UV (β-glucuronidasa negativas).
Agar EMB: colonias oscuras con o sin brillo metálico.
n.4) Confirmación serológica de antígeno O157.

Las colonias que resultan sospechosas se ensayan para detectar el antígeno O157. Se estudian
las colonias que crecieron en PRS-MUG.
Se continúa la identificación para los aislados O157 positivos.
n.5) Confirmación
Se realizan las siguientes pruebas (reacción característica de Escherichia coli O157: H7):
- TSI (amarillo/amarillo, H2S negativo)
- Fermentación de sorbitol (negativo)
- Fermentación de celobiosa (negativo)
- Caldo triptona (indol positivo)
- Medio RM-VP (RM: positivo; VP: negativo)
- Citrato de Simmons (negativo)
60
- Lisina decarboxilasa (positivo) *
- Ornitina decarboxilasa (positivo)*
- Medio decarboxilasa base (negativo)
- Medio movilidad (+/-)
Todos los medios se incuban a 35°C. Los azúcares deben leerse a las 24 horas.
*Los caldos decarboxilasa deben llevar un sello de vaselina. Los positivos son púrpura
(medio básico por decarboxilación) y el negativo es amarillo (por acidificación por
fermentación de la glucosa del medio).
n.6) Serología de antígeno H7

Sobre los aislados que hayan dado reacciones típicas de Escherichia coli O157: H7, realizar
una prueba de aglutinación para H7.
61
REQUISITOS MICROBIOLÓGICOS DEL CÓDIGO ALIMENTARIO ARGENTINO
-MERCOSUR-
ANEXO I
Texto de los artículos 156 tris, 255 y 302 del Código Alimentario Argentino (según la
modificación/ inclusión por la Resolución Conjunta SPyRS/ SAGPyA Nº 79/04 y 500/04).
“Art 156 tris: Los productos preparados a base de carne picada, tales como chacinados
frescos embutidos o no embutidos, y otras preparaciones a base de carne picada (albóndigas,
empanadas, pasteles, arrollados o similares) precocidas o no, una vez cocidos y listos para
consumir, ya sea que se dispensen inmediatamente después de finalizada la cocción, en el
establecimiento elaborador o sean enviados a domicilio, deberán responder a las siguientes
especificaciones microbiológicas:
Criterio complementario
Determinación Resultados Método de Análisis
ICMSF o equivalente
Microorganismos de los
n=5 c=2
Recuento de aerobios Alimentos-Vol I-Técnicas de
m=104 M=105 análisis microbiológicos-Parte II-
mesófilos/g
Enumeración de microorganismos
aerobios mesófilos- Métodos de
Recuento en Placa
ICMSF o equivalente
n=5 c=2 Microorganismos de los
Recuento de coliformes/g Alimentos-Vol I-Técnicas de
Bacterias coliformes
ICMSF o equivalente
E. coli/g Ausencia/g Alimentos-Vol I-Técnicas de
análisis microbiológicos-Parte II-
ICMSF o equivalente
Recuento de S. aureus n=5 c=1 Alimentos-Vol I-Técnicas de
coagulasa +/g m<100 M=500 análisis microbiológicos-Parte II-
S. aureus- Recuento de
estafilococos coagulasa positiva
62
Criterio obligatorio
USDA-FSIS Guía de Laboratorio

de Microbiología-capítulo 5 –
n=5 c=0 Detección, aislamiento e
E. coli O157: H7/NM identificación de E. coli
Ausencia/65 g
O157:H7/NM en productos
cárnicos o equivalente
n=5 c=0 Manual de Bacteriología Analítica

Salmonella spp. de FDA (BAM) Capítulo 5
Ausencia/25 g Salmonella o equivalente
Podrán investigarse otros microorganismos cuando las circunstancias lo hicieran necesario.
“Art. 255: Con la designación de carne triturada o picada, se entiende la carne apta para
consumo dividida finamente por procedimientos mecánicos y sin aditivo alguno.
Debe prepararse en presencia del interesado salvo en aquellos casos en los que por la
naturaleza del establecimiento o volumen de las operaciones sean autorizados expresamente
por la autoridad competente.
La carne picada fresca deberá responder a las siguientes especificaciones microbiológicas:
ICMSF o equivalente
Recuento de aerobios n=5 c=3 Alimentos-Vol I-Técnicas de
análisis microbiológicos-Parte II-
mesófilos/g m=106 M=107 Enumeración de microorganismos
aerobios mesófilos-Métodos de
Recuento en Placa
ICMSF o equivalente
Recuento de E. coli/g Alimentos-Vol I-Técnicas de
ICMSF o equivalente
Recuento de S. aureus n=5 c=2 Alimentos-Vol I-Técnicas de
coagulasa +/g m=100 M=1000 análisis microbiológicos-Parte II-
S. aureus-Recuento de
63

de Microbiología-capítulo 5 –
Ausencia/65 g

Podrán investigarse otros microorganismos cuando las circunstancias lo hicieran necesario.
“Art. 302: Se entiende por chacinados, los productos preparados sobre la base de carne y/o
sangre, vísceras u otros subproductos animales que hayan sido autorizados para el consumo
humano, adicionados o no con substancias aprobadas a tal fin. Los chacinados frescos
deberán responder a las siguientes especificaciones microbiológicas:

ICMSF o equivalente
Alimentos-Vol I-Técnicas de
Recuento de aerobios n=5 c=3 análisis microbiológicos-Parte
mesófilos/g m=106 M=107 II-Enumeración de
microorganismos aerobios
mesófilos-Métodos de Recuento
en Placa
ICMSF o equivalente
Recuento de E. coli/g Alimentos- Vol I-Técnicas de
ICMSF o equivalente
Recuento de S. aureus n=5 c=2 Alimentos- Vol I- Técnicas de
coagulasa +/g m=100 M=1000 análisis microbiológicos-Parte II-
S. aureus- Recuento de
64

de Microbiología- capítulo 5 –
Ausencia/65 g

Podrán investigarse otros microorganismos cuando las circunstancias lo hicieran necesario
65
SE.NA.SA PRODUCTOS DE LA PESCA MATERIAS PRIMAS
(Decreto 42.38/68)
Pescados, moluscos Moluscos valvados Crustáceos Vacuna Porcina Tripas naturales
no valvados, y escaldados
crustáceos crudos
AEROBIOS MESOFILOS 1.000.000 col/g 800.000 col/ g 500.000 col/ g 1.000.000 col/g 1.000.000 col/g 5.000.000 col/ g
ENTEROBACTERIAS 200 col/g 500 col/ g 200 col/g 500 col/ g 1000 col/ g 10.000 col/g
COLIFORMES 100 col/ g 200 col/ g 100 col/g 300 col/ g 500 col/ g 5000 col /g
ESTREPTOCOCOS
100 col/ g 100 col/g 100 col/g No considerar No considerar 5000 col /g
GRUPO D
66
CLOSTRIDIOS
20 col/ g 20 col/g 20 col/g 20 col/g 20 col/g 100 col/g
SULFITOREDUCTORES
Bacillus cereus No considerar No considerar No considerar No considerar No considerar No considerar
LACTOBACILOS No considerar No considerar No considerar No considerar No considerar No considerar
FLORA MICOTICA TOTAL 600 col /g 200 col/g 200 col/g 1100 col/ g 1100 col/g 1100 col/g
LEVADURAS 500 col/g 100 col/g 100 col/g 1000 col/ g 1000 col/ g 1000 col/ g
Escherichia coli Ausente en 0,1 g Ausente en 0.1 g Ausente en 0.1 g Ausente en 0.1 g Ausente en 0.1 g Ausente en 0.1 g
Salmonella sp. Ausente en 25 g Ausente en 25 g Ausente en 25 g Ausente en 25 g Ausente en 25 g Ausente en 25 g
Staphylococcus aureus < 100 col/ g < 100 col/ g < 100 col/ g < 100 col/ g < 100 col/ g < 100 col/ g
COAGULASA +
SE.NA.SA Embutidos frescos Embutidos secos Salazones secas Salazones Chacinados Subproductos
(Decreto 42.38/68) Chorizos, salchichas y Salame, salamín, Bondiola, jamón húmedas cocidos comestibles
longanizas parrilleras. longaniza, chorizos crudo, panceta, Jamón, paleta, lomo Salchicha tipo Viena, Extracto de carne,
españoles, etc. pastrón, etc. de cerdo cocido. salchichón, gelatina.
mortadela, morcilla,
matambre, etc.
AEROBIOS MESOFILOS 30.000.000 col/ g No considerar* 800.000 col/ g 10.000 col/ g 10.000 col/ g 10.000 col/ g
ENTEROBACTERIAS 25.000 col/ g 2.000 col/ g 200 col/ g 200 col/ g 200 col/ g 100 col/ g
COLIFORMES 10.000 col/ g 1.000 col/ g 100 col/ g 100 col/ g 100 col/ g 100 col/ g
ESTREPTOCOCOS
10.000 col/ g 200.000 col /g 100 col/ g 100 col/ g 100 col/ g 100 col/ g
GRUPO D
CLOSTRIDIOS
100 col/ g 50 col/ g 20 col/ g 20 col/ g 20 col/ g 20 col/ g
67
SULFITOREDUCTORES
Bacillus cereus No considerar 400 col/ g 400 col/ g 400 col/ g 400 col/ g 400 col/ g
LACTOBACILOS No considerar Sin límite Sin límite No considerar No considerar No considerar
FLORA MICOTICA TOTAL 2.200 col/ g No considerar 1.100 col/ g 1.100 col/ g 200 col/ g 200 col/ g
LEVADURAS 2.000 col/ g Sin límite 1.000 col/ g 1.000 col/ g 100 col/ g 100 col/ g
Escherichia coli Ausente en 0,1 g Ausente en 0.1 g Ausente en 0.1 g Ausente en 0.1 g Ausente en 0.1 g Ausente en 0.1 g
Salmonella sp. Ausente en 25 g Ausente en 25 g Ausente en 25 g Ausente en 25 g Ausente en 25 g Ausente en 25 g
Staphylococcus aureus < 100 col/ g < 100 col/ g < 100 col/ g < 100 col/ g < 100 col/ g < 100 col/ g
COAGULASA +
*Debe predominar la flora de maduración

ANALISIS MICROBIOLOGICO DE ALIMENTOS DESHIDRATADOS
1) Preparación de la muestra y diluciones

Pesar asépticamente 10 g del alimento en un Erlenmeyer con 90 ml de agua peptona 0,1%
estéril y homogeneizar bien.
Tomar con pipeta estéril 1 ml de esta primera dilución y pasar a un tubo con 9 ml de agua
peptona 0,1% para obtener la dilución 1/100. De ser necesarias más diluciones, realizarlas en
tubos conteniendo 9 ml de agua peptona 0,1%.

c) Recuento de Clostridium perfringens
f) Determinación de Bacillus cereus
a) Recuento de bacterias aerobias mesófilas.

recuento (APC) fundido y mantenido a aprox. 44-46ºC. Se mezcla para lograr una
distribución homogénea.
2- Cuando las placas estén frías se invierten y se incuban a 37 ºC durante 48 h.
correspondiente y se informa como “UFC de bacterias aerobias mesófilas/ g de muestra”.

b.1) Medio líquido
Medio de cultivo: caldo verde brillante 2% de sales biliares o caldo Mc Conkey.
Como trabajo de rutina se usan 2 tubos por cada dilución. Si fuera necesaria más precisión,
realizar el NMP usando series de 5 tubos. Sembrar:
2 tubos con 10 ml de la dilución 1/10 (1g) en caldo doble concentración.
2 tubos con 1 ml de la dilución 1/100 (0,1g) en caldo simple concentrado.
2 tubos con 1 ml de la dilución 1/100 (0,01g) en caldo simple concentrado.
Incubar a 37°C por 48 h.
Confirmación: estriar cada tubo presuntamente positivo en agar EMB. Incubar a 37ºC 24 h.
Se consideran colonias de coliformes las de aspecto oscuro/ rojo/rosado y/o mucoso, con o sin
brillo metálico.
Registrar el número de tubos positivos y calcular el número de bacterias coliformes por
gramo de producto empleando las tablas de NMP.
b.2) Recuento en placa

Medio de cultivo: Agar Bilis Rojo Violeta-Lactosa (ABRV-L).
Sembrar dos placas de la dilución 1/10 y dos placas de la dilución 1/100 agregando una
sobrecapa del agar al medio solidificado. Incubar 24 h a 35°C. Seleccionar las diluciones que
presenten entre 10 y 150 colonias. Contar las colonias rojas oscuras con diámetro de por lo
menos 0,5 mm, características de bacterias coliformes.
68
con caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares. Incubar a 30ºC por 22-26 h. Se
consideran positivas aquellas colonias que den producción de gas. El resultado se expresa
como “UFC de coliformes totales/g”.
c) Recuento de Clostridium perfringens

Siembra y aislamiento
Sembrar 1 ml de la dilución 1/10 en el fondo de dos bolsitas plásticas. Volcar a través del
cuello de cada una 30 ml de agar TSN. Homogeneizar bien el inóculo rotando la bolsita
mientras se mantiene presionado el cuello.
Dejar solidificar el agar en un separador. Incubar a 37°C por 24 h.
Se puede sembrar en placas de Petri e incubar en anaerobiosis. También puede realizarse por
NMP en forma similar al recuento de anaerobios sulfito reductores realizado en el análisis de
carnes y productos cárnicos.
Pasar un número representativo de colonias sulfito reductoras a tubos con 10 ml de caldo
tioglicolato. Incubar 24 h a 37°C observando si hay crecimiento vigoroso entre 4 y 6 horas
con producción de abundante gas. A partir de tubos con buen crecimiento realizar:
- Tinción de Gram
- Licuación de la gelatina en tubos con discos de gelatina-carbón. Sembrar 0,2 ml en el
fondo de los tubos conteniendo el medio previamente deaireado. Incubar a 37°C por 18 h.
- Movilidad y reducción de nitrato en agar semisólido Nitrato-Movilidad-Buffereado.
Sembrar por punción e incubar por 24 h a 37°C.
- Fermentación de la lactosa en medio para fermentación de azúcares. Sembrar 0,2 ml en el
fondo de tubos previamente deaireados. Incubar a 37°C por 24 h.
Informar como “UFC/g de muestra o NMP/g de muestra” de acuerdo a la técnica empleada.

Tener en cuenta para los cálculos las diluciones empleadas y el número de colonias
confirmadas.
Pre-enriquecimiento en medio líquido
Pesar asépticamente 25g de muestra en un erlenmeyer con 225 ml de agua peptonada
tamponada. Agitar para homogeneizar. Incubar a 37ºC durante 16-20 h.

Transferir 1 ml de caldo de pre-enriquecimiento a 10 ml de caldo tetrationato (Müller
Kauffmann). Incubar a 42,5-43,5ºC durante 18-24 h.
Transferir 1 ml de caldo de pre-enriquecimiento a 10 ml de caldo selenito-cistina. Incubar a
36-38ºC durante 18-24 h.

A partir de cada uno de los enriquecimientos estriar una placa de agar Xilosa-Lisina-
Desoxicolato (agar XLD) y una de agar Bismuto Sulfito. Incubar las placas invertidas a 36-
38ºC durante 20-24 h.
69
XLD, las colonias son rojas y con centro negro en la mayoría de los casos. En agar Bismuto
sulfito las colonias son marrones a negras con brillo metálico.
para que desarrollen colonias aisladas. Incubar a 36-38ºC durante 18-24 h. Al cabo de la

- tinción de Gram
- oxidasa
siguientes medios:
- Medio LIA
Salmonella es lisina decarboxilasa +, ureasa +, lactosa - (la gran mayoría de las cepas),
sacarosa - (la gran mayoría de las cepas).
De ser necesario, pueden realizarse las pruebas del indol (la mayoría de las cepas son -), la
prueba de Voges Proskauer (-), crecimiento en caldo KCN (no crece), etc.
Emplear una cepa patrón de Salmonella para chequear los medios de cultivo y los medios
análisis. Aclarar modificaciones y pruebas bioquímicas realizadas.

Siembra y aislamiento en medio sólido
Transferir 0,1 ml de la dilución adecuada a una placa de agar Baird Parker. Realizar un
duplicado. Distribuir el inóculo con espátula de Drigalsky para obtener colonias aisladas.
Incubar a 35ºC durante 44-48 h.
Considerar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias. Seleccionar un número
representativo de colonias sospechosas y transferirlas a tubos de caldo infusión-cerebro-
corazón (BHI). Incubar a 35ºC por 24 h.
El volumen y las diluciones empleadas dependen de la contaminación que se espere en la
muestra. Incluso puede realizarse un recuento combinado sembrando un volumen mayor y
repartido en varias placas. Recordar que no se recomienda sembrar más de 0,2 ó 0,25 ml por
placa.
70
Sobre los cultivos puros de 24 h realizar:
- Tinción de Gram
- Catalasa
- Coagulasa
- Termonucleasa (en la misma placa de Baird-Parker)
Sembrar en paralelo una cepa patrón para comparar con un positivo.
Para realizar los cálculos tener en cuenta las diluciones y las alícuotas sembradas. Aclarar las
modificaciones y pruebas bioquímicas realizadas.
Informar “UFC de S. aureus coagulasa positiva/g de muestra”
f) Determinación de Bacillus cereus (APHA 1992)

Medio de cultivo: agar manitol-yema de huevo-polimixina (MYP). Sembrar en superficie 0,1
ml de dos diluciones por duplicado con un rastrillo para cada dilución. Después de sembrar
dejar secar e incubar por 20 o 24 h a 30°C+ 2oC.
Transferir un número representativo de colonias típicas a agar nutritivo. Incubar 24-48 h a
37ºC. En estos cultivos puros ensayar:
- Gram
- catalasa
- tinción de esporas
- fermentación de glucosa (en caldo rojo fenol en anaerobiosis)
- caldo nitrato
- caldo Voges-Proskauer modificado
Calcular el número de colonias de B. cereus teniendo en cuenta las diluciones empleadas y las
colonias confirmadas. Informar como “UFC de B. cereus /g de muestra”.
71
ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUA
1) Toma de muestra y preparación de las diluciones

Utilizar frascos estériles de capacidad adecuada para la cantidad de agua necesaria para
realizar los análisis. Si se supone la presencia de cloro o cloraminas en el agua, agregar 100
mg de tiosulfato de sodio por litro de muestra en los frascos antes de su esterilización. Si
pudieran hallarse presentes metales pesados proceder de igual forma empleando 572 mg de
EDTA por litro de muestra. Realizar diluciones decimales sucesivas empleando como
diluyente agua peptona 0,1% (9060. St. Meth. 18th Ed. 1992).
a) Recuento total de bacterias aerobias mesófilas

c) Determinación de coliformes totales por el método de filtración por membrana
d) Determinación de E. coli por el método de filtración por membrana
e) Determinación de Estreptococos fecales
f) Determinación de P. aeruginosa
g) Determinación de anaerobios esporulados sulfito reductores
a) Recuento total de bacterias aerobias mesófilas

Sembrar en Agar para Recuento en Placa (APC). En la mayoría de las aguas potables los
recuentos adecuados se logran sembrando 1 y 0,1 ml del agua tal cual y 1 y 0,1ml de la
dilución 1/100. Realizar como mínimo dos placas por dilución de diluciones sucesivas.
Incubar a 37oC por 24hs. Informar UFC de aerobios mesófilos/ml (9215. St. Meth. 18th. Ed.
1992).

A) Ensayo presuntivo
A1 - Determinación de coliformes totales por la técnica de fermentación en tubos múltiples
(NMP)
Se inoculan series de 5 tubos de por lo menos 3 diluciones decimales sucesivas (generalmente
10, 1 y 0,1 ml). Si el inóculo es igual o mayor a 10 ml se utiliza el medio de concentración
adecuada para no diluir los nutrientes. Se incuban 24-48 h a 35oC.
A2 - Determinación de coliformes totales por ensayo de Ausencia-Presencia

Sembrar la cantidad adecuada de agua en frascos con igual volumen de Caldo Lauril Sulfato
de doble concentración. Incubar 24-48 h a 35ºC. Producción de gas y/o ácido y/o crecimiento
abundante se confirman como en (1). Se informa ausencia o presencia de coliformes totales
en el volumen de agua sembrada.
(1) - Ensayo de confirmación:

Los tubos o frascos que producen gas y/o crecimiento abundante en A1 y en A2 se transfieren
con ansa a tubos de fermentación de Caldo Verde Brillante Bilis Lactosa. Se incuban 48 h a
35oC. Los tubos que producen ácido en (1) se computan para el cálculo del NMP. En el caso
de que en A1 fueran positivos todos los tubos de dos diluciones consecutivas se confirman
sólo los de la serie más diluida y se computan todos los positivos para el cálculo.
72
Esquema del método 9221. Standard Methods 18th. Ed. 1992.
Inocular tubos de fermentación para NMP (A1) o

frascos para Ensayo de Ausencia-Presencia (A2)
con Caldo Lauril Sulfato. Incubar por 24 h a 35ºC.
(1) (2)
Crecimiento con producción de ácido y/o gas +.
Producción de ácido y/o gas -.
Transferir para confirmación a Caldo Verde
Incubar 24 h más (48 h en total).
Brillante Bilis Lactosa. Incubar 48 h a 35ºC.
(a) (b) (a) (b)

Producción de gas +. Producción de gas -. Producción de gas + Gas -, ácido -.
Transferir a Agar ENDO Ausencia de y/o ácido +. Seguir Ausencia de
o Mac Conkey. coliformes como en (1). coliformes
Incubar 24 h a 35ºC.
(1.1) (1.2)
Colonias típicas o atípicas. Colonias no típicas.
- Transferir a Caldo Lauril Sulfato. Ausencia de coliformes
Incubar 24-48 h a 35ºC.
- Transferir a Agar nutritivo inclinado.
Incubar 24 h a 35ºC a 1.2.
(a’) (b’)
Producción de gas -. Gas +
Ausencia de coliformes Tinción de Gram del AN:
Bacilos Gram – Mezcla de bacilos Esporas y/o bacilos Gram +.

Ensayo completo Gram – y Gram +. Ensayo completo
Presencia de coliformes Repetir desde 1.1. Ausencia de coliformes
(1) (a) - Ensayo completo:

Para establecer con certeza la presencia de coliformes y para obtener datos de control de
calidad se debe usar el Ensayo Completo en por lo menos el 10% de los tubos positivos en los
ensayos anteriores. Se puede utilizar una doble confirmación en Caldo Verde Brillante Bilis
Lactosa o sembrar cada tubo positivo de (1) en Agar Endo o Agar Mac Conkey. Incubar 24 h
a 35ºC. Las colonias típicas en Agar Endo son rosas o rojas con brillo metálico y las atípicas
son rosas o rojas sin brillo metálico, otras colonias se consideran negativas. Las colonias
típicas en Agar Mac Conkey son rojas rodeadas de un halo de precipitación.
De cada placa se pica una o más colonias y se transfieren:
a.1.1. Caldo Lauril Sulfato. Incubar 24-48 h a 35ºC.
a.1.2. Agar Nutritivo inclinado (No necesario en agua de bebida). Incubar 24 h a 35ºC.
La producción de gas en Lauril Sulfato y la presencia de cocobacilos Gram - en el cultivo de
Agar Nutritivo indican: Presencia del grupo coliforme (Ensayo completo).
Si no se produce gas en los tubos de Caldo Lauril Sulfato, ajustar el cálculo del NMP.
73
c) Determinación de coliformes totales por el método de filtración por membrana
(Directiva 95/131 CEE)
Se filtra por membrana la cantidad necesaria de agua y se coloca el filtro en 25 ml de Caldo
Lauril Sulfato. Se incuba 4 h a 30oC y 14 h a 37oC. Si hay producción de ácido y/o gas y/o
crecimiento abundante, confirmar como en (1). Se determina ausencia o presencia del grupo
coliforme en el volumen filtrado.
Si se desea hacer recuento colocar el filtro sobre un pad estéril embebido en el medio de
cultivo (Caldo Lauril Sulfato para filtración por membrana), incubando de igual forma. Las
colonias amarillas se confirman como en (1). Se pueden determinar UFC de coliformes
totales/volumen de agua.
d) Determinación de E. coli por el método de filtración por membrana

Proceder como en 4) e incubar 4 h a 30oC y 14 h a 44oC (Directiva 95/131 CEE).
Producción de ácido y/o gas y/o crecimiento abundante se confirma estriando en agar Endo.
A las colonias aisladas se les realizan las pruebas de IMViC y/o set de pruebas múltiples. Se
informa ausencia o presencia de E. coli en el volumen filtrado (9225 E. St. Meth. 18th Ed.
1992). Si se desea hacer recuento se procede como en 4), incubando 4 h a 30ºC y 14 h a 44ºC.
Las colonias amarillas se confirman por pruebas de IMViC y/o set de pruebas múltiples. Se
informa UFC de E. coli por volumen de agua filtrada.
e) Determinación de Estreptococos fecales (Método APHA 1984)

Filtrar por membrana la cantidad necesaria de agua y colocar el filtro en cajas de Agar KF.
Incubar 48 h a 37ºC.
Confirmación: Aislar las colonias típicas en placas de Agar Cerebro Corazón. Incubar 24 h a
35ºC.
De las colonias aisladas realizar: Gram, catalasa, siembra en Agar Bilis Esculina (48 h a
35ºC), siembra en Agar Infusión de Corazón (24 h a 35ºC), siembra en Caldo Infusión de
Corazón 6,5% de NaCl (24 h a 37ºC).
Informar ausencia o presencia de Estreptococos fecales en el volumen filtrado.
f) Determinación de P. aeruginosa (Norma DIN 38411)

Enriquecimiento:
a) Filtrar por membrana la cantidad adecuada de agua y colocar el filtro en 25 ml de Caldo
Verde de Malaquita.
b) Colocar la cantidad adecuada de agua en igual volumen de Caldo Verde de Malaquita
doble concentrado.
Incubar 48 h a 37oC.
Aislamiento: Si se observa crecimiento en el caldo de enriquecimiento sembrar por estría en
placas de Agar Cetrimida. Incubar 48 h a 42oC.
Confirmación: de las colonias de Agar Cetrimida sembrar en:
Agar F (formación de fluoresceína), Agar P (formación de piocianina) y Agar Acetamida.
Realizar la prueba de oxidasa.
g) Determinación de anaerobios esporulados sulfito reductores (Norma DIN 38411)

Se siembra la cantidad adecuada de agua en igual cantidad de Caldo Diferencial para
Clostridios (DRCM) doble concentrado. Se recubre con parafina líquida y se pasteuriza el
conjunto 20 minutos a 70ºC. Se incuba como mínimo 48 h a 37ºC. La mayoría de los cultivos
pueden reconocerse al cabo de 3-4 días pero es conveniente prolongar las observaciones una
semana o más, ya que la germinación de las esporas puede tardar bastante tiempo.
74
REQUERIMIENTOS MICROBIOLÓGICOS DEL CAA
Art. 982 Agua potable de suministro público y de uso domiciliario.

Art. 983 Agua de bebida potabilizada envasada.
Bacterias mesófilas (APC 24 h a 37ºC): máx. 500UFC/ml
Bacterias coliformes (NMP 48 h a 37ºC en Caldo Lauril Sulfato o Caldo Mac Conkey): igual
o menor que 3 /100ml.
E. coli: ausencia en 100ml
P. aeruginosa: ausencia en 100ml
Art. 985 Agua mineral natural.

No debe tener:
Parásitos en 250 ml.
E. coli en 250 ml.
Estreptococos fecales en 250 ml.
P. aeruginosa en 250 ml.
Anaerobios esporulados sulfito reductores en 50 ml.
75
Tabla I. - Número más probable (N.M.P.) de bacterias coliformes por 100 ml de la muestra, sembrando porciones en no más de tres diluciones
Combinación de tubos sembrados 10, 1 y 0,1 ml respectivamente

Número de tubos positivos
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
0 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5
10 ml 1 ml 0.1 ml 0 0 1 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5
0 1 0 ….. 4,9 4,9 4,7 4,6 4,6 4,6 4,6 4,6 4,5 4,4 4,4 4,4 4,4 4,4 4,3 4,2 4,2 4,2 4,2 4,2 4,1 4,1 4,0 4,0 4,0 4,0
0 1 1 ….. ….. 9,7 ….. 9,3 9,2 9,2 9,2 9,1 ….. 8,9 8,8 8,8 8,8 8,7 ….. 8,5 8,5 8,4 8,4 8,4 ….. 8,1 8,1 8,1 8,1 8,0
0 2 0 ….. ….. ….. 9,5 9,5 9,4 9,4 9,3 9,3 9,1 9,1 9,0 9,0 8,9 8,9 8,7 8,7 8,6 8,6 8,5 8,5 8,3 8,3 8,3 8,2 8,2 8,2
0 2 1 ….. ….. ….. ….. 14 14 14 14 14 ….. 14 14 14 14 13 ….. 13 13 13 13 13 ….. 12 12 12 12 12
0 3 0 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 14 14 14 14 14 14 14 14 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13
1 0 0 6,9 6,5 6,4 6,1 6,0 6,0 6,0 5,9 5,9 5,7 5,7 5,6 5,6 5,6 5,5 5,4 5,4 5,3 5,3 5,3 5,2 5,1 5,1 5,1 5,1 5,1 5,1
1 0 1 ….. ….. 13 ….. 12 12 12 12 12 ….. 12 12 12 12 11 ….. 11 11 11 11 11 ….. 10 9,9 9,9 9,9 9,9
1 1 0 ….. 14 14 13 13 13 13 13 13 12 12 12 12 12 12 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 10
1 1 1 ….. ….. 22 ….. 20 20 20 20 19 ….. 19 19 18 18 18 ….. 18 17 17 17 17 ….. 16 16 16 16 16
1 1 2 ….. ….. ….. ….. ….. 28 27 27 27 ….. ….. 26 25 25 25 ….. ….. 24 24 24 23 ….. ….. 22 22 22 22
1 2 0 ….. ….. ….. 21 21 21 21 20 20 19 19 19 19 19 19 18 18 18 18 18 18 17 17 17 17 17 17

1 2 1 ….. ….. ….. ….. 29 29 28 28 28 ….. 27 26 26 26 26 ….. 25 25 24 24 24 ….. 23 23 23 23 23
1 3 0 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 28 28 27 27 27 27 26 26 25 25 25 25 24 24 24 24 23 23
1 3 1 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 36 36 35 35 35 ….. 33 33 33 32 32 ….. 31 31 30 30 30
2 0 0 ….. 30 30 24 24 23 23 22 22 20 20 20 20 19 19 18 18 18 17 17 17 16 16 16 16 15 15
2 0 1 ….. ….. 95 ….. 52 50 48 46 45 ….. 38 38 37 36 35 ….. 32 31 31 30 30 ….. 27 27 27 26 26

2 0 2 ….. ….. ….. ….. ….. 95 91 87 83 ….. ….. 65 63 61 59 ….. ….. 50 49 48 47 ….. ….. 42 41 40 40
2 0 3 ….. ….. ….. ….. ….. ….. 140 140 130 ….. ….. ….. 95 92 90 ….. ….. ….. 72 71 69 ….. ….. ….. 58 57 56
2 1 0 ….. ….. 240 69 66 62 57 54 51 45 43 42 41 40 39 35 34 34 33 33 32 29 29 29 28 28 28
76
2 1 1 ….. ….. ….. ….. 140 130 120 110 110 ….. 81 77 74 72 69 ….. 57 56 54 53 51 ….. 46 45 45 44 43
2 1 2 ….. ….. ….. ….. ….. 210 190 180 170 ….. ….. 120 120 110 110 ….. ….. 85 83 80 78 ….. ….. 66 65 64 62
Ferramola, “Examen bacteriológico de aguas”,1947

2 1 3 ….. ….. ….. ….. ….. ….. 280 260 240 ….. ….. ….. 160 150 150 ….. ….. ….. 110 110 110 ….. ….. ….. 87 86 84
2 2 0 ….. ….. ….. ….. 300 240 200 180 160 110 100 98 93 89 85 69 67 65 63 61 59 52 51 50 49 48 47
2 2 1 ….. ….. ….. ….. ….. 690 450 360 300 ….. 170 160 150 140 140 ….. 100 100 97 94 91 ….. 77 75 73 71 70
2 2 2 ….. ….. ….. ….. ….. ….. 1.100 700 510 ….. ….. 230 210 200 190 ….. ….. 140 140 130 130 ….. ….. 100 99 96 94
2 2 3 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 1.400 920 ….. ….. ….. 290 270 260 ….. ….. ….. 170 170 160 ….. ….. ….. 130 130 120
2 2 4 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 1.600 ….. ….. ….. ….. 350 340 ….. ….. ….. ….. 210 200 ….. ….. ….. ….. 150 150
2 3 0 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 340 280 240 210 190 140 130 130 120 110 110 90 89 86 84 81 79
2 3 1 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 690 410 290 220 ….. 190 180 170 160 160 ….. 120 120 120 110 110
2 3 2 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 1.100 700 510 ….. ….. 250 230 220 210 ….. ….. 160 150 150 140
2 3 3 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 1.400 920 ….. ….. ….. 300 280 270 ….. ….. ….. 190 180 180
2 3 4 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 1.600 ….. ….. ….. ….. 360 340 ….. ….. ….. ….. 220 210
2 3 5 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 420 ….. ….. ….. ….. ….. 250
2 4 0 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 370 300 270 240 220 160 150 150 140 140 130
2 4 1 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 690 470 390 330 ….. 210 200 190 190 170
2 4 2 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 1.100 700 510 ….. ….. 260 240 230 220
2 4 3 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 1.400 920 ….. ….. ….. 310 290 280
2 4 4 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 1.600 ….. ….. ….. ….. 370 350
2 4 5 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 430
2 5 0 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 390 330 290 260 240
2 5 1 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 720 480 400 350
2 5 2 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 1.100 700 540
2 5 3 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 1.400 920
2 5 4 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 1.600
Tabla II. - Número más probable (N.M.P.) de bacterias coliformes por 100 ml de la muestra, sembrando porciones en no más de tres diluciones
Combinación de tubos sembrados 10, 1 y 0,1 ml respectivamente

Número de tubos positivos
3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
0 1 1 2 2 2 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5
10 ml 1 ml 0.1 ml 0 0 1 0 1 2 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5
0 1 0 ….. 3,3 3,3 3,2 3,2 3,2 3,1 3,1 3,1 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9
1 0 0 4,1 3,9 3,9 3,8 3,7 3,7 3,6 3,6 3,6 3,6 3,6 3,5 3,5 3,5 3,5 3,4 3,4 3,4 3,4 3,4 3,3 3,3 3,3 3,3
1 1 0 ….. 8,1 8,0 7,7 7,7 7,7 7,4 7,4 7,4 7,3 7,3 7,3 7,2 7,1 7,1 7,1 7,1 7,0 6,9 6,9 6,9 6,8 6,8 6,8
1 2 0 ….. ….. ….. 12 12 12 12 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 10
1 2 1 ….. ….. ….. ….. 16 16 ….. 16 15 15 15 15 ….. 15 15 15 15 15 ….. 14 14 14 14 14
1 3 0 ….. ….. ….. ….. ….. ….. 16 16 16 16 16 16 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 14 14

1 3 1 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 20 20 20 20 20 ….. 19 19 19 19 19 ….. 18 18 18 18 18
2 0 0 11 10 10 9,8 9,8 9,7 9,3 9,3 9,2 9,1 9,1 9,1 8,9 8,8 8,8 8,7 8,7 8,7 8,5 8,5 8,4 8,4 8,3 8,3
2 0 1 ….. ….. 16 ….. 15 15 ….. 15 14 14 14 14 ….. 14 14 14 14 13 ….. 13 13 13 13 13
2 1 0 ….. 17 17 16 16 16 15 15 15 14 15 15 14 14 14 14 14 14 13 13 13 13 13 13
2 1 1 ….. ….. 24 ….. 22 22 ….. 21 21 20 20 20 ….. 20 19 19 19 19 ….. 19 18 18 18 18

2 2 0 ….. ….. ….. 23 23 23 21 21 21 21 21 21 20 20 20 20 20 20 19 19 19 19 19 19
2 2 1 ….. ….. ….. ….. 30 30 ….. 28 28 28 27 27 ….. 26 26 26 26 26 ….. 25 25 24 24 24
2 3 0 ….. ….. ….. ….. ….. ….. 29 29 29 29 28 28 27 27 27 27 27 26 26 25 25 25 25 25
2 3 1 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 37 36 36 36 36 ….. 34 34 34 33 33 ….. 32 32 31 31 31
2 4 0 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 35 35 35 35 34 34 33 33 33 32 32 32
2 4 1 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 43 43 42 42 42 ….. 40 40 39 39 39
2 5 0 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 42 41 41 41 40 40
2 5 1 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 49 49 48 48 48
2 5 2 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 57 56 56 56
3 0 0 ….. 34 33 28 27 27 24 24 23 23 23 23 21 21 21 21 21 20 19 19 19 19 19 19
77
3 0 1 ….. ….. 95 ….. 53 51 ….. 40 39 39 38 37 ….. 34 33 33 32 32 ….. 29 29 29 29 28
3 0 2 ….. ….. ….. ….. ….. 95 ….. ….. 65 64 62 60 ….. ….. 51 50 49 48 ….. ….. 43 42 41 40
Ferramola, “Examen bacteriológico de aguas”,1947

3 0 3 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 95 92 90 ….. ….. ….. 73 71 69 ….. ….. ….. 59 58 57
3 1 0 ….. ….. ….. 71 66 63 46 45 44 43 42 41 37 36 36 35 35 34 32 31 31 30 30 30
3 1 1 ….. ….. ….. ….. 140 130 ….. 81 78 75 72 70 ….. 59 57 56 54 53 ….. 47 46 46 45 44

3 1 2 ….. ….. ….. ….. ….. 210 ….. ….. 120 120 110 110 ….. ….. 85 83 81 78 ….. ….. 67 65 64 63
3 2 0 ….. ….. ….. ….. 300 240 110 100 98 93 89 85 69 67 65 63 61 59 51 50 49 48 47 46
3 2 1 ….. ….. ….. ….. ….. 700 ….. 170 160 150 140 130 ….. 100 100 97 94 91 ….. 77 75 73 71 69
3 2 2 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 230 210 200 190 ….. ….. 140 140 130 130 ….. ….. 100 99 97 94
3 2 3 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 290 270 260 ….. ….. ….. 170 170 160 ….. ….. ….. 130 130 120
3 2 4 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 350 330 ….. ….. ….. ….. 210 210 ….. ….. ….. ….. 150 150
3 2 5 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 420 ….. ….. ….. ….. ….. 240 ….. ….. ….. ….. ….. 180
3 3 0 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 340 280 240 210 190 140 130 130 120 110 110 92 89 86 83 81 79
3 3 1 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 690 460 370 320 ….. 190 180 170 160 160 ….... 120 120 120 110 110
3 3 2 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 1.100 700 530 ….. ….. 250 230 220 210 ….. ….. 160 150 150 140
3 3 3 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 1.400 920 ….. ….. ….. 300 280 270 ….. ….. ….. 190 180 180
3 3 4 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 1.600 ….. ….. ….. ….. 360 340 ….. ….. ….. ….. 220 210
3 3 5 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 420 ….. ….. ….. ….. ….. 250
3 4 0 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 370 300 270 240 220 160 150 150 140 140 130
3 4 1 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 710 470 390 330 ….. 210 200 190 180 170
3 4 2 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 1.100 700 540 ….. ….. 260 240 230 220
3 4 3 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 1.400 920 ….. ….. ….. 310 290 280
3 4 4 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 1.600 ….. ….. ….. ….. 370 350
3 4 5 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 430
3 5 0 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 390 330 290 260 240
3 5 1 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 720 480 400 350
3 5 2 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 1.100 700 540
3 5 3 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 1.400 920
3 5 4 ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. ….. 1.600
MPN index and 95% confidence limits for various combinations of positive results when
various numbers of tubes are used. (Inocula of 0.1, 0.01, and 0.001 g)
3 Tubes per dilution 5 Tubes per dilution
95% Confidence 95% Confidence

limits limits
Combination MPN index Lower Upper MPN index Lower Upper
of positives per g per g
0-0-0 <3 <0.5 <9 <2 <0.5 <7

0-0-1 3 <0.5 9 2 <0.5 7
0-1-0 3 <0.5 13 2 <0.5 7
0-2-0 - - - 4 <0.5 11
1-0-0 4 <0.5 20 2 <0.5 7
1-0-1 7 1 21 4 <0.5 11
1-1-0 7 1 23 4 <0.5 11
1-1-1 11 3 36 6 <0.5 15
1-2-0 11 3 36 6 <0.5 15
2-0-0 9 1 36 5 <0.5 13
2-0-1 14 3 37 7 1 17
2-1-0 15 3 44 7 1 17
2-1-1 20 7 89 9 2 21
2-2-0 21 4 47 9 2 21
2-2-1 28 10 150 - - -
2-3-0 - - - 12 3 28
3-0-0 23 4 120 8 1 19
3-0-1 39 7 130 11 2 25
3-0-2 64 15 380 - - -
3-1-0 43 7 210 11 2 25
3-1-1 75 14 230 14 4 34
3-1-2 120 30 380 - - -
3-2-0 93 15 380 14 4 34
3-2-1 150 30 440 17 5 46
3-2-2 210 35 470 - - -
3-3-0 240 36 1,300 - - -
3-3-1 460 71 2,400 - - -
3-3-2 1,100 150 4,800 - - -
3-3-3 >1,100 >150 >4,800 - - -
FAO, “Manual of Food Control Quality. Microbiological Analysis”, 1992.
78
BIBLIOGRAFIA
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Mossel y Moreno García, "Microbiología de los alimentos. Fundamentos ecológicos para
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USDA, FSIS, Microbiology Division Beltsville, MD. “Method for the isolation and
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Vanderzant, C. & Splittstoesser, D. (Eds.). “Compendium of methods for the microbiological
examination of foods” 3rd Ed. APHA, 1992.
79
ANEXO - BIOSEGURIDAD
REGLAS BÁSICAS DE HIGIENE Y SEGURIDAD PARA ALUMNOS DE LABORATORIOS DE

QUÍMICA Y BIOLOGÍA - PAUTAS DE ACTUACION EN CASOS DE EMERGENCIAS
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES - SERVICIO DE HIGIENE Y SEGURIDAD
_____________________________
Las prácticas que se realizan en los laboratorios presentan riesgos propios de cada actividad.
Las reglas básicas aquí indicadas son un conjunto de normas destinadas a proteger la salud de
los alumnos y a evitar accidentes y contaminaciones tanto dentro del ámbito de trabajo, como
hacia el exterior.
Es un elemento clave en la seguridad la información que permita reconocer y minimizar o

evitar los riesgos presentes en el laboratorio. Será fundamental respetar la metodología de
cada técnica, y trabajar con cuidado y en forma ordenada.
MEDIDAS GENERALES
1. Se deberá conocer la ubicación de los elementos de seguridad en el lugar de trabajo, tales

como: matafuegos, salidas de emergencia, mantas ignífugas, lavaojos, gabinete para
contener derrames, accionamiento de alarmas, etc.
2. No se debe comer, beber, fumar o maquillarse en el laboratorio.
3. No se debe guardar alimentos en heladeras que contengan drogas o preparados.
4. Se debe utilizar vestimenta apropiada para realizar trabajos de laboratorio, guardapolvo
abrochado (preferentemente de algodón y de mangas largas) y zapatos cerrados. Evitar el
uso de accesorios colgantes (aros, pulseras, collares, etc.). Llevar el cabello recogido.
5. Las mesadas de trabajo, deben estar despejadas, sin libros, ni abrigos ni objetos
personales. Es imprescindible mantener el orden y la limpieza. Cada persona es
responsable directa de la zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes.
6. Las manos deben lavarse cuidadosamente después de cualquier manipulación de
laboratorio y antes de retirarse del mismo.
7. Se deben utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias química o
material biológico. Toda persona cuyos guantes se encuentren contaminados no deberá
tocar objetos, ni superficies, tales como: teléfono, lapiceras, manijas de cajones o puertas,
cuadernos, etc.
8. No se permite correr en los laboratorios.
9. No se deben bloquear las rutas de escape o pasillos con bancos, sillas, equipos, máquinas
u otros elementos que entorpezcan la correcta circulación.
10. De aviso inmediato al docente responsable si encuentra instalaciones eléctricas y de gas
precarias o provisorias.
11. No utilice equipos (Ej. Rotavap, columnas de destilación, sonicadores, hornos etc.) sin
haber recibido entrenamiento previo y sin supervisión durante su uso.
12. Toda herida o abrasión, aún los pequeños cortes que puedan producirse durante el trabajo
práctico deben ser informados al Docente. Los laboratorios cuentan con un botiquín de
primeros auxilios con los elementos indispensables para atender casos de emergencia.
13. Respete las señales de advertencia. (ej.: riesgo eléctrico, alta temperatura, radiaciones,
etc.)
80
14. Todo residuo generado debe colocarse en los recipientes destinados para tal fin según las
indicaciones del docente (ver Pautas para Gestión de Residuos).
LABORATORIOS DE QUÍMICA
1. No se permite pipetear con la boca.

2. Siempre que sea necesario proteger los ojos y la cara de salpicaduras o impactos se
utilizarán anteojos de seguridad, viseras o pantallas faciales u otros dispositivos de
protección. Cuando se manipulen productos químicos que emitan vapores o puedan
provocar proyecciones, se evitará el uso de lentes de contacto.
3. No utilice el contenido de un recipiente que no este identificado. Los envases que
contengan agentes químicos deben adecuadamente etiquetados con la denominación del
compuesto y el tipo de riesgo (Ej.: corrosivo, tóxico, inflamable, oxidante, radiactivo,
explosivo o nocivo).
4. Cuando sea necesario manipular grandes cantidades de materiales inflamables (más de 5

litros) deberá tenerse a mano un extintor apropiado para ese material en cuestión.
5. Al almacenar sustancias químicas se debe considerar las incompatibilidades que dan lugar
a reacciones peligrosas. Consultar con el Docente.
81
6. No almacenar en estantes sobre mesadas sustancias corrosivas y en caso de ácidos o
álcalis concentrados (mayor de 2N) deben ser mantenidos en bandejas de material
adecuado.
7. Las prácticas que produzcan gases, vapores, humos o partículas, y que puedan ser
riesgosas por inhalación deben llevarse a cabo bajo campana.
8. Se debe verificar la ausencia de vapores inflamables antes de encender una fuente de
ignición.
9. No se debe trabajar con materiales inflamables o solventes sobre llamas directas o cerca
de las mismas. Para calentamiento, sólo se utilizarán resistencias eléctricas o planchas
calefactoras blindadas. Se prestará especial atención al punto de inflamación y de
autoignición del producto.
10. Está prohibido descartar líquidos inflamables o tóxicos o corrosivos por los desagües de
las piletas, sanitarios o recipientes comunes para residuos. Se deben seguir las pautas
para la gestión de residuos.
11. Los cilindros de gases comprimidos y licuados deben estar en posición vertical sujetos
con correas o cadenas a la pared en sitios de poca circulación, de ser posible fuera del
lugar de trabajo, protegidos de la humedad y fuentes de calor.
12. El material de vidrio roto no se depositará con los residuos comunes. Será conveniente
envolverlo en papel y ubicarlo en cajas resistentes,
13. Todo recipiente que hubiera contenido agentes químicos puede ser descartado junto a los
residuos comunes vaciado totalmente, enjuagado apropiadamente y sin etiquetas.
14. Está terminantemente prohibido hacer experimentos no autorizados por el Docente. No
substituya nunca un producto químico por otro en una práctica.
LABORATORIOS DE BIOLOGIA
1. Leer Reglas Básicas para Laboratorios de Química.

2. Se deben utilizar mascarillas descartables cuando exista riesgo de producción de
aerosoles (mezcla de partículas en medio líquido) o polvos durante operaciones de pesada
de sustancias tóxicas o biopatógenas, apertura de recipientes con cultivos después de
agitación, etc.
3. Está prohibido descartar material biológico por los desagües de las piletas, sanitarios o
recientes comunes para residuos. En cada caso se deberán seguir los procedimientos
establecidos para la gestión de residuos.
4. La superficie de trabajo se deberá descontaminar una vez terminadas las tarea o luego de
cada derrame de material viable, utilizando productos probadamente efectivos contra los
agentes con que se trabaja.
5. El derrame o caída de muestras contaminadas, diluciones y medios sembrados o
inoculados será informada al docente de inmediato. Se procederá a tratar el área afectada
con la solución desinfectante que corresponda, la cual se dejará actuar y se recogerá con
papel absorbente que será luego descartado con los residuos patogénicos.
6. En caso de rotura del recipiente de vidrio que contiene microorganismos, proceder de
igual forma pero no tocar los residuos antes que el desinfectante haya actuado.
7. Cuando proceda a la limpieza de una superficie con alcohol, verifique que no haya
mecheros encendidos.
8. Consulte con el Docente si el material biológico debe ser descontaminado previo a su
descarte en recipiente de residuos patogénicos (bolsa roja).
82
PAUTAS PARA LA GESTIÓN DE RESIDUOS PELIGROSOS Y PATOGÉNICOS
Peligrosos (ácidos, álcalis, oxidantes, corrosivos, guantes, trapos, etc.):

Los residuos líquidos se deberán acumular en bidones provistos por el Servicio de Higiene y
Seguridad. Mantenerlos tapados. No mezclar sin consultar al Docente.
Los residuos sólidos se deberán acumular en bolsas negras dentro de cajas provistas por el
Servicio de Higiene y Seguridad. No tirar residuos domésticos.
Patogénicos (tips, guantes, cajas de petri, etc.):

Los residuos biológicos (sangre, tejidos animales o humanos y todo el material que haya
estado en contacto con ellos) se deberán acumular en bolsas rojas dentro de cestos con tapa
provistos por el Servicio de Higiene y Seguridad. Quedan exceptuados los elementos corto-
punzantes (agujas, hojas de bisturíes), que se recogerán en contenedores especiales.
ANTE CUALQUIER DUDA CONSULTE CON EL DOCENTE
La seguridad la disfrutamos todos. Actuemos responsablemente
PAUTAS DE ACTUACIÓN EN CASO DE EMERGENCIAS
En caso de accidente, avisar inmediatamente al Docente.
) EMERGENCIAS MÉDICAS
Si ocurre una emergencia tal como cortes o abrasiones, quemaduras o ingestión accidental de
algún producto químico, tóxico o peligroso, se deberá proceder en la siguiente forma:
1. A los accidentados se les proveerá los primeros auxilios
2. Se da aviso al Departamento de Seguridad y Control (Int. 311 Emergencias)
3. El Docente responsable del turno o una autoridad del Departamento, deberá
completar el Formulario de Incidentes y enviarlo al Servicio de Higiene y Seguridad
para su conocimiento y evaluación.
CENTROS PARA REQUERIR AYUDA MEDICA

S.A.M.E. Teléfono 107
Hospital Pirovano
Av. Monroe 3555 Tel. 4542-5552 / 9279
INTOXICACIONES:
Hospital de Niños. Dr. R. Gutiérrez
Sánchez de Bustamante 1399. Capital Federal. Tel: 4962-6666.
Hospital de Niños. Dr. P. de Elizalde
Av. Montes de Oca 40 Tel. 4307-7491 Toxicología 4300-2115
QUEMADURAS:
Hospital de Quemados
P.Goyena 369 Tel. 4923-4082 / 3022
83
OFTALMOLOGÍA
Hospital Santa Lucía
San Juan 2021 Tel. 4941-7077
Hospital Dr. P. Lagleyze
Av. Juan B. Justo 4151 Tel. 4581-0645 / 2792
1. Quemaduras.
Las pequeñas quemaduras producidas por material caliente, baños, placas o mantas
calefactoras, etc., se trataran lavando la zona afectada con agua fría durante 10-15 minutos.
Las quemaduras más graves requieren atención médica inmediata. No utilices cremas y
pomadas grasas en las quemaduras graves.
2. Cortes.
Los cortes se tienen que lavar bien, con abundante agua corriente, durante 10 minutos como
mínimo. Si son pequeños y dejan de sangrar en poco tiempo, lávalos con agua y jabón y
tápalos con una venda o apósito adecuados. Si son grandes y no paran de sangrar, requiere
asistencia médica inmediata.
3. Derrame de productos químicos sobre la piel.

Los productos químicos que se hayan vertido sobre la piel han de ser lavados inmediatamente
con agua corriente abundante, como mínimo durante 15 minutos. Es necesario sacarle toda la
ropa contaminada a la persona afectada lo antes posible. El lavado es muy importante para
reducir la gravedad y la extensión de la herida. Requiere asistencia médica.
4. Actuación en caso de producirse corrosiones en la piel.

Por ácidos. Sacar o cortar lo más rápidamente posible la ropa. Lavar con agua corriente
abundante la zona afectada. Neutralizar la acidez con bicarbonato sódico durante 15-20
minutos. Esperar la asistencia médica.
Por álcalis. Lavar la zona afectada con agua corriente abundante y luego con una solución
saturada de ácido bórico. Secar y esperar la asistencia médica.
5. Fuego en el cuerpo.
Si se te incendia la ropa, pide ayuda. El afectado no correrá, tiene que tirarse en el suelo y
rodar sobre si mismo para apagar las llamas. Es tu responsabilidad ayudar a alguien que se
esté quemando. Cubrirlo con una manta antifuego, conducirlo hasta la ducha de seguridad, si
está cerca. No utilices nunca un extintor sobre una persona. Una vez apagado el fuego,
mantener a la persona tendida, hasta que llegue la asistencia médica.
6. Actuación en caso de producirse corrosiones en los ojos.

En este caso el tiempo es esencial (menos de 10 segundos). Cuanto antes se lave el ojo,
menos grave será el daño producido. Lavar los dos ojos con agua corriente abundante durante
15 minutos como mínimo en una ducha de ojos, o con solución fisiológica. Es necesario
mantener los ojos abiertos con la ayuda de los dedos para facilitar el lavado debajo de los
párpados. Es necesario recibir asistencia médica, por pequeña que parezca la lesión.
7. Actuación en caso de ingestión de productos químicos.

Antes de cualquier actuación concreta pide asistencia médica. Si el paciente está
inconsciente, ponerlo en posición inclinada, con la cabeza de lado. Si está consciente,
mantenerlo apoyado. No dejarlo sólo. No provocar el vómito si el producto ingerido es
corrosivo.
84
8. Actuación en caso de inhalación de productos químicos.
Identificar el vapor tóxico. Si se trata de un gas, utilizar el tipo adecuado de máscara para
gases durante el tiempo que dure el rescate del accidentado. No arriesgarse. Conducir
inmediatamente la persona afectada a un sitio con aire fresco. Requiere asistencia médica lo
antes posible. Ante el primer síntoma de dificultad respiratoria, iniciar la respiración artificial
boca a boca.
) INCENDIOS
1. Fuego en el laboratorio.
Mantenga la calma.
Informe al docente responsable.
Se dará aviso inmediatamente al Dpto. de Seguridad y Control (Interno 311) informando el
lugar y las características del siniestro
2. Fuegos pequeños
Si el fuego es pequeño y localizado, y sabe utilizar un extintor, trate de apagarlo utilizando un
extintor adecuado, arena, o cubriendo el fuego con un recipiente de tamaño adecuado que lo
ahogue.
Retirar los productos químicos inflamables que estén cerca del fuego.
No utilices nunca agua para extinguir un fuego provocado por la inflamación de un solvente.
3. Fuegos grandes
Si el fuego es de consideración, no se arriesgue y manteniendo la calma ponga en marcha el
plan de evacuación. Apague los equipos eléctricos y cierre las llaves de gas y ventanas.
Acate las indicaciones de los brigadistas.
Evacue la zona por la ruta asignada.
No corra, camine rápido, cerrando a su paso la mayor cantidad de puertas. No utilice
ascensores. Descienda siempre que sea posible.
No lleve consigo objetos, pueden entorpecer su salida.
Si pudo salir por ninguna causa vuelva a entrar. Deje que los equipos especializados se
encarguen.
) DERRAME MAYORES DE PRODUCTOS QUÍMICOS
− Avise al Departamento de Seguridad y Control (int. 311 Emergencias)

− Atender a cualquier persona que pueda haber sido afectada.
− Notificar a las personas que se encuentren en las áreas cercanas acerca del derrame.
Buscar los elementos en el Gabinete para contener derrames.
− Coloque la cinta de demarcación para advertir el peligro.
− Evacuar a toda persona no esencial del área del derrame.
− Si el derrame es de material inflamable, apagar las fuentes de ignición, y las fuentes de
calor.
− Evite respirar los vapores del material derramado, si es necesario utilizar una máscara
respiratoria con filtros apropiados al tipo de derrame.
− Ventilar la zona.
− Utilizar los elementos de protección personal tales como equipos de ropa resistente a
ácidos, bases y solventes orgánicos y guantes.
− Confinar o contener el derrame, evitando que se extienda. Para ello extender los cordones
en el contorno del derrame.
− Luego absorber con los paños sobre el derrame.
85
− Deje actuar y luego recoger con pala y colocar el residuo en la bolsa roja (patogénicos) o
negra (peligrosos) y ciérrela.
− Si el derrame es de algún elemento muy volátil deje dentro de la campana hasta que lo
retire para su disposición.
− Disponer la bolsa con los residuos (consultar al Servicio de Higiene y Seguridad, int. 275)
− Lave el área del derrame con agua y jabón. Seque bien.
− Cuidadosamente retire y limpie todos los elementos que puedan haber sido salpicados por
el derrame.
− Lave los guantes, la máscara y ropa.
86
Fecha: ..................................................................
Declaro haber leído las REGLAS BÁSICAS DE HIGIENE Y SEGURIDAD EN LABORATORIOS

DE QUÍMICA Y BIOLOGÍA – PROCEDIMIENTOS ANTE EMERGENCIAS que aparecen en la
guía de Trabajos Prácticos de la Materia
................................................................................................
Turno de Laboratorio: ........................................
Firma:...................................................................
Aclaración:............................................................
L.U. Nº: ...............................................................
87

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Microbiología de

Dpto. Química Orgánica

GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS

GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS

-Introducción de los medios de cultivo y pruebas bioquímicas características de Enterococcus

- Análisis de las cepas

1) Realizar la tinción de Gram.

-Introducción de los medios de cultivo y pruebas bioquímicas características de

- Análisis de las cepas

1) Realizar la tinción de Gram.

5) Prueba de la Coagulasa: Colocar 0,5 ml de plasma, de conejo o humano, citratado, diluido

6) Prueba de la Termonucleasa: Las placas de Baird-Parker en las que se observan colonias

7) Fermentación de manitol en anaerobiosis

-Reconocimiento de los grupos de microorganismos marcadores y patógenos más importantes

- Análisis de las cepas

a) Siembra en agar de aislamiento por la técnica de vertido en placa. Observación de

b) Confirmación de colonias típicas. Características morfológicas y pruebas bioquímicas.

a) Siembra en medio líquido (caldo de fermentación). Observación de reacción característica.

- Con cada cepa 2) sembrar 1 tubo de fermentación de caldo Lactosa-Verde Brillante-2%

b) Siembra en medio sólido ABRV-L (agar Bilis-Rojo-Violeta-Lactosa). Observación de

3) Coliformes a 45°C (coliformes fecales)

a) Agar de aislamiento: EMB (agar eosina azul de metileno según Levine).

b) Características morfológicas y pruebas bioquímicas

Investigación de Indol -Técnica de Kovacs:

Investigación de acetil metil carbinol - Técnica de Voges-Proskauer modificada por Barrit.

Resultados típicos de Escherichia coli:

a) Medios sólidos (agar) de aislamiento. Observación de colonias típicas.

A partir de cada cepa

b) Características morfológicas, pruebas bioquímicas, confirmación serológica.

Resultados típicos de Salmonella sp.

Toda cepa sospechosa de Salmonella debe identificarse bioquímicamente antes de efectuar el

Sueros polivalentes somáticos de Salmonella

Observar la morfología típica de colonias de Bacillus cereus en medios usados para su

- Análisis de las cepas

1) Coloración de Gram: realizar la coloración según la técnica descripta en la guía de medios

5) Movilidad: inocular por punción el medio de movilidad. Incubar 24 h a 37°C. Observar

7) Hidrólisis de gelatina: inocular el medio por punción. Incubar 24 h a 37°C. Enfriar en

Observar la morfología típica de colonias de C. perfringens en medios usados para su

- Análisis de las cepas

1) Coloración de Gram: realizar la técnica descripta en la guía de reactivos y medios de

2) Coloración de esporas: realizar la coloración de verde de malaquita. Observar las esporas.

4) Reducción de nitrato/movilidad: sembrar una ansada por punción en un tubo de agar

6) Hidrólisis de almidón: sembrar por estría en agar almidón. Incubar en anaerobiosis 24 h a

8) Hidrólisis de caseína: sembrar por estría en agar caseína. Incubar en anaerobiosis 24 h a

El estudio de los hongos se basa en las siguientes características:

Se usa el mismo método que para las bacterias.

Existen dos tipos básicos de métodos para el análisis de aflatoxinas en alimentos:

b) métodos químicos: el procedimiento para la determinación de aflatoxinas en un dado

AFLATOXINAS. REGLAMENTO TÉCNICO SOBRE LÍMITES MÁXIMOS DE

ALIMENTO AFLATOXINA LIMITE

2) Determinación de aflatoxinas por cromatografía en capa fina

Se utilizan cubas sin saturar y sin papel.

1 - Tomar el extracto seco con 250 microlitros de cloroformo.

3) Cuantificación por el método de comparación visual

1- Sembrar 2, 5 y 10 microlitros de aflatoxina B1 (estándar) y desarrollar el cromatograma.

Vs: volumen de estándar (microlitros) cuya intensidad de fluorescencia es igual a la que

Cs: concentración del estándar de aflatoxina B1 en microgramos/ml.

Vx: volumen de muestra (microlitros) cuya intensidad de fluorescencia es igual a la de Vs.

a) Recuento microscópico directo (recuento de bacterias totales en leche)

a) Recuento microscópico directo (recuento de bacterias totales en leche)

RECUENTO Promedio de Recíproca de la

b) Recuento de bacterias aerobias mesófilas (FIL 100B: 1991)

c) Recuento de bacterias psicrotróficas (APHA, 1992)