Trabajo Práctico N°7: DETERMINACIÓN DE BACTERIAS COLIFORMES

TOTALES, FECALES Y E. COLI POR NMP

Delfina Brachfeld Parlaghy

Aylen Lucia Rauch

Introducción

A la hora de determinar si el agua es apta para el consumo humano, hay varios factores que se deben
analizar. Entre ellos se encuentra la presencia de microorganismos que indican la contaminación fecal.
Esto puede determinarse mediante la determinación y recuento de organismos coliformes. El grupo
coliforme está constituido por una gran variedad de organismos que suelen habitar en los intestinos de
animales con sangre caliente y están presentes en aguas potables contaminadas con materia fecal. Se
pueden dividir en dos grupos:

Coliformes totales: compuesto por todos los bacilos Gram (-) aerobios o anaerobios facultativos, no
esporulados, que fermentan lactosa con producción de gas en un lapso de 48 hs a 35°C ± 1°C.
Conformado por los grupos Enterobacter, Escherichia, Citrobacter y Klebsiella.

Coliformes fecales: compuesto por bacterias Gram (-) que fermentan lactosa con producción de gas
en un lapso de 48 hs a 44,5°C ± 1°C. Conformado principalmente por la Escherichia coli.

Para determinar los coliformes totales y fecales se utiliza el método del número más probable (NMP),
el cual se basa en la capacidad de estos microorganismos de fermentar lactosa con producción de
ácido y gas utilizando un medio de cultivo que contenga sales biliares. Está compuesto por dos fases:
la presuntiva y la confirmativa. En fase presuntiva se recuperan los microorganismos dañados que se
encuentren en la muestra que podrían llegar a ser coliformes. Esto se realiza utilizando como medio
de cultivo el lauril sulfato de sodio para que los microorganismos utilicen lactosa como fuente de
carbono. En la fase confirmativa se desarrollan los microorganismos capaces de tolerar sales biliares y
verde brillante y se confirma la presencia de coliformes. Para esto se utiliza caldo lactosado bilis
verde brillante como medio de cultivo. A partir de los tubos que resulten positivos, se determina el
NMP de coliformes totales y fecales. Para determinar la presencia de Escherichia coli, se utilizan los
tubos positivos del caldo EC para sembrar en un medio selectivo y diferencial y luego realizar las
respectivas pruebas bioquímicas básicas.

El objetivo de este trabajo fue determinar la presencia de coliformes totales, fecales y E. coli en una
muestra de agua para poder analizar si cumple los estándares sanitarios.

Materiales y métodos

Para realizar la prueba presuntiva, primero se obtuvo una muestra de agua con posible contaminación
fecal. Luego, se prepararon 50 ml de una solución buffer de KH2PO4 (32 g/l), se ajustó a pH 7
agregando NaOH 2M y se esterilizó por autoclave. Se agregaron 9 ml de buffer en tres tubos de
ensayo estériles y en uno de los tubos se agregó 1 ml de la muestra. Se realizaron diluciones seriadas
(agitando previamente) hasta llegar a una dilución 10-3.

Luego se prepararon 120 ml del medio de cultivo lauril sulfato según especificaciones comerciales, el
cual tenía un pH de 6,7. Se transvasaron 10 ml a cada uno de diez tubos de ensayos estériles con
campanas de Durham y se esterilizaron por autoclave (un tubo se utiliza como control de esterilidad).
Una vez que se esterilizó el medio de cultivo, se agregó por triplicado 100 µl de cada dilución seriada
(10-1, 10-2, 10-3) al lauril sulfato. Se taparon y se incubaron en estufa a 37°C ± 0,5°C por 48 hs. Los
tubos donde hubo producción de gas y variación en el color del medio se consideraron como
positivos.

Para la prueba confirmativa, se prepararon 120 ml del medio de cultivo caldo verde brillante bilis y
120 ml de EC según especificaciones comerciales, los cuales tenían un pH de 6,8. Se transvasaron 10
ml en cada uno de diez tubos de ensayos estériles con campanas de Durham por cada medio de cultivo
y se esterilizaron por autoclave. Por cada resultado positivo obtenido en la prueba presuntiva, se
sembraron 100 µl en cada uno de los tubos con caldo VB y EC. Se taparon y se incubaron en estufa
por 48 hs: el medio caldo VB a 37°C ± 0,5°C y el medio EC a 44°C ± 0,5°C. Pasado ese tiempo, se
determinaron los tubos positivos.

Para la determinación de Escherichia coli, primero se prepararon 50 ml del medio de cultivo Agar
EMB según especificaciones comerciales y se ajustó a un pH 7,2 utilizando NaOH 2M. Se esterilizó
por autoclave y se trasavsó a placas de Petri. Una vez solidificado el medio, se sembraron con ansa
esteril los tubos positivos para coliformes fecales y se incubaron en estufa a 35°C ± 0,5°C por 48 hs.
Pasado ese tiempo, se determinó la presencia de E. coli en las colonias que presentaran un centro
oscuro y brillo verde metálico.

Resultados y discusiones

En la fase presuntiva, todos los tubos resultaron positivos. En la prueba confirmativa, en el medio VB
seis resultaron positivos y en el medio EC ocho. Por error, el medio VB quedó sólido ya que contenía
agar pero se sembró igualmente. A partir de estos resultados, se determinó el NMP utilizando la tabla
provista por los docentes.

Coliformes totales: 240 NMP/cm con un límite confiable de 95% interior de 36 y superior de 1300.

Coliformes fecales: 1100 NMP/cm con un límite confiable de 95% interior de 150 y superior de
4800.

Figura 1. Resultados de la fase presuntiva del medio lauril sulfato incubadas en estufa por 48 hs a
37°C ± 0,5°C de dilución 10-1, 10-2 y 10-3 junto al tubo de control a la izquierda.
 Figura 2. Resultados de la fase confirmativa del medio VB incubadas en estufa por 48 hs a 37°C ±
0,5°C de dilución 10-1 (A), 10-2 (B) y 10-3 (C) junto al tubo de control a la izquierda.

Figura 3. Resultados de la fase confirmativa del medio EC incubadas en estufa por 48 hs a 44°C ±
0,5°C de dilución 10-1 (A), 10-2 (B) y 10-3 (C) junto al tubo de control a la izquierda.

No se observó la presencia de Escherichia coli en el medio EMB, pero sí se pudieron observar otras
colonias de microorganismos de distintas características.

Figura 4. Resultados de la siembra de los tubos positivos para coliformes fecales en el medio de
cultivo EMB de dilución 10-3 (A), 10-2 (B) y 10-1 (C).

Conclusiones

La muestra de agua analizada no presentó Escherichia coli, pero si arrojó un alto porcentaje de
coliformes totales y fecales; evidenciando una alta posibilidad de contaminación con patógenos de la
misma y de peligro para la salud humana por su consumo.