UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEON

Facultad de Ciencias Biológicas

Lic. Químico Bacteriólogo Parasitólogo

Microbiología

Práctica 4 y 5 PRUEBAS BIOQUÍMICAS DE IDENTIFICACIÓN BACTERIANA

Integrantes:

Jonathan Valdemar Guerrero Hernández 1897937

Grupo:252

Maestra: Mayra Alejandra Gomez Govea

Fecha de entrega :07 de abril 2022

 PRUEBAS BIOQUÍMICAS DE IDENTIFICACIÓN BACTERIANA

Primera Parte

Etapa 1: Introducción a la Microbiología y características generales y estructurales de los

microorganismos.

1. Elemento de competencia: Aplicar los conocimientos acerca de la estructura, función y

principios nutricionales de la diversidad metabólica de los organismos procariotas en las
técnicas de laboratorio para que el estudiante pueda llevar a cabo el aislamiento y
caracterización morfológica de una bacteria.

1. Propósito de la Práctica

• Que el alumno comprenda los fundamentos bioquímicos de las reacciones enzimáticas

en las que se basan las “Pruebas Bioquímicas” para identificación bacteriana y
desarrollar dichas técnicas para diferenciar e identificar géneros y especies de bacterias.

1. Introducción

Las pruebas bioquímicas en microbiología hacen referencia al conocimiento del metabolismo de

los microorganismos. Por lo cual han sido elaboradas una serie de pruebas que permiten
determinar la presencia ó ausencia de diferentes enzimas que participan en el metabolismo de
los substratos, permitiendo de esta manera conocer parte de las características fisiológicas de
los microorganismos lo cual nos va a ayudar a diferenciar e identificar a los mismos. Para la
realización de estas pruebas generalmente se usan medios de cultivo diferenciales que consisten
en una base simple más el sustrato que se desea probar, además se puede añadir un indicador
que nos muestre un cambio debido a la reacción, en ocasiones es necesario agregar algunos
reactivos después del período de incubación para determinar algún producto de la
reacción. Han sido desarrolladas cientos de pruebas bioquímicas diferentes pero aquí
solamente realizaremos algunas de las más comúnmente empleadas (1).

CATALASA. Se utiliza principalmente para diferenciar los géneros: Streptococcus (-) de

Micrococcus y Staphylococcus (+), también para diferenciar a Bacillus (+) de Clostridium (-),
además para distinguir a Listeria monocytogenes (+) de Erysipelothrix (-). La catalasa es una
enzima que se encuentra en la mayoría de las bacterias aerobias que contienen citocromo
excepto en Streptococcus.
OXIDASA. La detección de esta enzima es empleada para diferenciar a Pseudomonas (+) de las
enterobacterias (-), también sirve para distinguir a Moraxella y Neisseria (+) de Acinetobacter (-).
La enzima oxidasa activa la oxidación del citocromo reducido por el oxígeno molecular.

O-F (OXIDO-FERMENTACIÓN). Esta prueba permite diferenciar a las enterobacterias (OF-

fermentativos) de Acinetobacter y Pseudomonas (OF-oxidativos), también ayuda a diferenciar a
Micrococcus (OF-oxidativo) de Staphylococcus (OF-fermentativo). El principio de esta prueba es
determinar el metabolismo oxidativo o fermentativo del azúcar universal la glucosa.

FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS EN MEDIO TSI. Las reacciones en el medio TSI se utilizan

principalmente para la diferenciación de enterobacterias. En el TSI se determina la capacidad de
un organismo para fermentar un carbohidrato con producción de ácido y posibles gases, además
en este medio diferencial también se determina producción de ácido sulfhídrico.

PRUEBA DEL ÁCIDO SULFHÍDRICO. Esta prueba ayuda a diferenciar las especies de Proteus
mirabilis y P. vulgaris (+) de P. morganii y P. rettgeri (-), además permite diferenciar a
Pseudomonas putrefaciens (+) de otras Pseudomonas (-), también permite identificar algunas
enterobacterias como Arizona (+), Edwardsiella (+) y Salmonella (+).

PRODUCCIÓN DE INDOL. Sirve para diferenciar: Edwardsiella (+) de Salmonella (-), E. coli (+) de
Klebsiella y Enterobacter (-), Bacillus alvei (+) de otras especies de Bacillus (-), Proteus mirabilis (-
) de otros Proteus (+). Esta prueba consiste en determinar la capacidad de un organismo para
desdoblar el indol a partir de la molécula de triptófano (2).

1. Material para el desarrollo de la practica

Material biológico

1. Cultivos en caldo nutritivo de 24 a 48 h de incubación de Bacillus subtilis y

Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli,
Salmonella spp. y Proteus spp.

Reactivos y otro material

- 2 placas con agar nutritivo, 2 Juegos de tubos con medio O-F, 4 tubos con medio TSI, y 3 tubos
con medio de SIM. El tamaño de los tubos puede ser 13x100 o 15x125 con torunda o tapón de
rosca.

Nota: parte de este material se guardará en refrigeración para trabajar en el PIA, se recomienda
preparar este material con tubos de tapón de rosca.
- Gradilla

- Asa bacteriológica

- Reactivos: Frasco con peróxido de hidrógeno al 30%, Solución acuosa al 1.0% de di o tetrametil-
parafenil-endiamina, reactivo de Kovac

- Mechero

- Cerillos, etiquetas y algodón.

- Alcohol al 70%

- Incubadora a 37ºC

Nota: Todos los medios de cultivo deberán incubarse a 37°C para prueba de esterilidad.
Posteriormente guardar en refrigeración debidamente etiquetado con el medio de cultivo, grupo
y equipo.

-Bata, cubrebocas y cofia.

1. Procedimiento para el desarrollo de la práctica

Nota: Tomar fotografías de todos los tubos antes de inocularlos, estos serán tomados como
control

a. Prueba de la CATALASA.

1. Inocule por estría la superficie del agar nutritivo en placa, la mitad con B. subtilis, otro
con E. faecalis

1. Incube los medios a 37ºC por 24 a 48 h.

1. Agregue unas gotas de peróxido de hidrógeno sobre las colonias de los cultivos de los
microorganismos y observe buscando la formación inmediata de burbujas y espuma en
la superficie del medio.

1. Interprete sus resultados basándose en que la prueba es positiva si hay producción de

burbujas, mientras que si no se forman se considera catalasa negativa.

Nota: El peróxido de hidrógeno es muy inestable y debe pasar por un control de calidad antes de
emplearse.

a. Prueba de la OXIDASA.
 1. Inocule por estría la superficie del agar nutritivo en placa, la mitad con E. coli y la otra
con P. aeruginosa.

1. Incube las placas a 37ºC por 24 h.

1. Agregue unas gotas del reactivo tetrametil-parafenil-endiamina sobre el crecimiento de

cada uno de los microorganismos.

1. Interprete y anote sus resultados, considerando que esta prueba es positiva si las
colonias toman un color púrpura o azul el cual después puede pasar a negro.

Nota: El reactivo para la oxidasa generalmente es muy sensible a ser oxidado en presencia de
luz, por lo que se debe mantener fuera del alcance de la luz y de preferencia preparar la solución
en el momento que se requiere.

a. Prueba de Óxido-Fermentación (O-F)

1. Inocule por picadura milímetros antes del fondo del medio en los tubos, de la siguiente
manera:

Un juego de tubos con E. coli.

Un juego de tubos con P. aeruginosa

2. Incube todos los medios con O-F a 37ºC por 24 a 48 h.

Nota: Para la interpretación de resultados debe tomar en cuenta que en los microorganismos O-
F fermentativos ambos tubos tanto el abierto como el cubierto con aceite viran tomando un
color amarillo debido a la producción de ácido a partir de la glucosa, mientras que los O-F
oxidativos solo producen ácido en la superficie del medio del tubo abierto y los microorganismos
que no son ni fermentativos ni oxidativos (inertes) producen una ligera alcalinidad en el medio
del tubo sin aceite (color azul verdoso) y el tubo cubierto no presenta cambio de color (se
mantiene verde).

a. Prueba de Fermentación de Carbohidratos en medio TSI.

1. Inocule por picadura y estría cada uno de los medios de TSI utilizando los siguientes
cultivos puros: E. coli, Salmonella spp. Proteus spp. y Pseudomonas aeruginosa.

2. Incube estos medios a 37 º C por no más de 24 h.

Nota. Para interpretar resultados compare y registre cambios de sus cultivos con el control
negativo. Los posibles resultados son:

a) Superficie ácida y fondo ácido con o sin gas. (Amarillo = ácido).

b) Superficie ácida, fondo ácido y H2S (+). (Negro = H2S).

c) Superficie alcalina, fondo ácido, con o sin gas. (Rojo = alcalino).

d) Superficie alcalina, fondo ácido, gas y H2S (+).

e) Superficie alcalina y fondo alcalino o superficie alcalina y fondo sin cambio.

e) Prueba del Ácido Sulfhídrico.

1. Inocule por picadura casi hasta el fondo medio de SIM en tubos, con cultivos axénicos de
la bacterias Salmonella spp., E. coli y Proteus spp.

1. Incube todos los tubos con SIM a 37 ºC por 24 horas.

1. Observe sus medios de SIM, buscando la formación de un precipitado negro; esto indica
un resultado positivo para la prueba; mientras que la falta de ennegrecimiento nos
indica que el microorganismo es H2S negativo.

Nota: En el medio de SIM también se pueden determinar la prueba de indol y movilidad.

f) Producción de Indol

1. En el medio de SIM, primero determine H2S y movilidad, posteriormente añada unas gotas de
reactivo de Kovac para detectar el indol.

Nota: La formación de un anillo de color rojo nos indica que el microorganismo es indol positivo
(3,4).

1. Análisis de Resultados

Construya una matriz para registrar tus resultados en donde para cada microorganismo
evaluado y para cada prueba realizada, siguiendo el ejemplo a continuación.

PRUEBA “A” Observación de resultado Interpretación de resultado

Microorganismo #1 Describir cambios de color, ¿Qué significa el cambio de color

producción de gas, precipitación, o producción de gas? ¿Prueba
Microorganismo #2
etc. positiva o negativa? ¿Presencia u
Microorganismo #3 ausencia de enzima?

Control negativo
PRUEBA Oxidasa Observación de resultado Interpretación de resultado

B. subtilis En la placa mostró un color azul El cambio de color se debe a que

después de añadir cuando se le aplica el reactivo con
E.coli
tetrametilparafendiamina. la presencia de oxígeno se oxida y
se convierte en azul de indo fenol
indicando que la prueba es positiva

PRUEBA Catalasa Observación de resultado Interpretación de resultado

P.aeuriginasa En la placa efervescencia después de La efervescencia se debe a la

añadir el peróxido de hidrogeno. descomposición del peróxido de
E.coli
hidrogeno a agua y oxígeno. Al
aplicar el peróxido de hidrogeno se
mostró efervescencia el cual indica
que la prueba es positiva

PRUEBA OF Observación de resultado Interpretación de resultado

P.aeuriginasa Los tubos mostraron un color verde Al tener un color verde en nuestros
fuerte. medios quiere decir que la vía es
E.coli
oxidativa.

PRUEBA KIA Observación de resultado Interpretación de resultado

Proteus spp Uno de los tubos (Salmonella) no En el caso de proteus spp. El color
tuvo cambios, su color permaneció negro en el medio nos indica una
Salmonella spp
en rojo, en el caso del proteus el tubo producción de H2S.
cambió a color negro.

PRUEBA INDOL Observación de resultado Interpretación de resultado

E.coli En el tubo donde se inoculó E.coli se Los reactivos de Erhlich o Kovacs

puede observar un aro violeta contienen DMABA que reacciona
Salmonella spp
encima del líquido color amarillo. con el indol producido formado un
compuesto quinónico color violeta
 esto nos indica que hay presencia
de la enzima triptofanasa

PRUEBA MIO Observación de resultado Interpretación de resultado

Klebsiella El tubo donde se inoculó proteus spp. Al presentar el proteus spp un

Presenta un color morado y partes color morado y en la superficie un
Proteus spp
amarillas con un anillo color rojo en color amarillo con un anillo rojo
la superficie, en la parte de klebsiella nos indica que el indol es positivo
se presenta un color amarillo y un mientras que en la klebsiella nos
ligero anillo color rojo en la superficie indica que el indol es negativo.

PRUEBA LIA Observación de resultado Interpretación de resultado

Salmonella spp El tubo donde se inoculó proteus spp. Al presentar el proteus spp un
Presenta un color amarillo con color color amarillo y en la superficie un
Proteus spp
rojo en la superficie. color rojo nos indica que hay una
desaminación.
En el tubo de la salmonella presenta
un color negro. El tubo de la salmonella color
negro nos indica una producción
de H2S

PRUEBA CITRATOS Observación de resultado Interpretación de resultado

Klebsiella En el tubo donde se inoculó klebsiella Al presentar un color azul verdoso

podemos observar un tono color azul en el tubo de klebsiella se
verdoso mientras que en el tubo demuestra que el resultado es
donde se inoculo E. coli se ve verde positivo lo que quiere decir que
ocurre la producción del enzima
citrato
De acuerdo a sus resultados y sus procedimientos complete la siguiente tabla:

Prueba Medio de Cultivo Ingrediente(s) clave para la Enzima que

Requerido detecta.
Prueba enzimática.

Catalasa Agar nutritivo Peróxido de hidrógeno Catalasa

Óxido- OF Reactivo tetrametil-parafenil- Catalasa

Fermentación endiamina

Ácido SIM Reactivo kovac Tiosulfato

Sulfhídrico reductasa, cisteína
desulfurilasa y
tiptofanasa.

Movilidad SIM Reactivo kovac Tiosulfato

reductasa, cisteína
desulfurilasa y
tiptofanasa.

Indol SIM Reactivo kovac Triptofanasa.

Discusión

Revise 3 citas bibliográficas y discuta sus resultados.

Las pruebas bioquímicas según Emilia Cercenado (2014) “Las pruebas bioquímicas permiten
determinar las características metabólicas de las bacterias objeto de identificación”. Lo que
quiere decir que mediante estas pruebas se puede comprobar si hay o no hay presencia de
algunas enzimas.

Dentro de estas pruebas bioquímicas discutiremos sobre la realizaciones de algunas de ellas,

empezando sobre la prueba de indol, en esta prueba utilizamos el medio SIM el cual preparamos
diferentes tubos de ensayos, el medio SIM lo utilizamos en distintas pruebas como la de
movilidad y la de acido sulfhídrico, el medio SIM por definición de Condalab (2019) “es un medio
semisólido utilizado para la diferenciación de bacterias entéricas a través de la producción de
sulfuro, la formación de indol y la motilidad”. Un medio perfecto para estas pruebas.

En nuestra prueba de catalasa como se puede observar se utilizó un medio de agar nutritivo lo
interesante es cuando a la catalasa se le agrega peróxido de hidrogeno esto servirá en la prueba
porque “La catalasa es una enzima que poseen la mayoría de las bacterias aerobias.
Descompone el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno” (Ugr, 2013). La presencia de burbujas
demuestra que la prueba es positiva.

Conclusión

En esta práctica aprendimos a realizar diferentes pruebas bioquímicas, aprendimos el

fundamento de cada prueba bioquímica y el contexto en el cual se usa cada una. En lo personal
la realización de esta práctica me ha parecido gratificante y muy completa ya que aplicamos
distintos conocimientos a la vez, los cuales nos ayudaran en algún futuro ya que estas pruebas
son indispensables para nuestra vida profesional como químico bacteriólogo parasitólogo

Cuestionario

1. ¿Todos los microorganismos producen el mismo producto final a partir de piruvato?

Explique su respuesta.

No, ya que existe diferentes tipos de fermentación, algunas su producto final son lactato y en
otros su producto final es etanol.

1. ¿Todas las bacterias aeróbicas darán positivo para una prueba de catalasa? Justifique su
respuesta.

Si, ya que la catalasa descompone el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno siendo que las
bacterias aeróbicas se encuentran en constante contacto con el oxígeno darán positivo

Salto de página

1. Instrumento de evaluación

Lista de cotejo para evaluar la practica

Elemento Cumple/No
Aspectos Criterio Puntos
(puntos) cumple

Manual identificado en la
Manual de portada con nombre y grupo,
FORMA
Laboratorio (5) entregado a tiempo y contestado
a mano con letra legible.
 El estudiante participa
activamente durante la
Trabajo en equipo
realización de la práctica. Se
(5)
integra con sus compañeros de
equipo.

Completos, ordenados y concisos,

presentados en párrafos, tablas o
Resultados (25)
gráficos claramente
identificados.

Discute todos los resultados

obtenidos, comparándolos con lo
reportado en literatura,
Discusiones (25)
colocando la referencia entre
paréntesis y en el formato
FONDO correcto.

Argumenta de forma adecuada,

Conclusiones (20) de acuerdo al objetivo propuesto
y a los resultados obtenidos.

Contesta correctamente todas las

Cuestionario (10)
preguntas

Referencias Es actual y/o especializada y

(10) además sigue el formato APA.

Salto de página

1. Referencias

a) Citas en el texto

1. Madigan M. T., J. M. Martinko, J. Parfer, T. D. Brock. 2009. Biología de los

Microorganismos. Décima segunda Edición. Prentice Hall Iberia, Madrid España.

1. Segretain G., E., Drouhet y F. Mariat. 1977. Diagnóstico de Laboratorio en Microbiología

Médica. Editorial Fournier, S. A., México, D. F.

1. Cowan S. T., K. J. Steel. 1985. Manual Para la Identificación de Bacterias de Importancia

Médica. Segunda Edición. CIA. Editorial Continental, S. A. de C. V., México.

1. Mac Faddin J. F. 1984. Pruebas Bioquímicas Para la Identificación de Bacterias de

Importancia Clínica. Editorial Médica Panamericana S. A., México, D. F.
b) Literatura consultada

1. Cercenado, E., & Cantón, R. (2014, 1 junio). Procedimientos en Microbiología Clínica.

Seim.org. Recuperado 7 de abril de 2022, de
https://seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/sei
mc-procedimientomicrobiologia37.pdf
2. Metodos Catalasa y Oxidasa. (2013, 14 julio). Ugr.es. Recuperado 7 de abril de 2022, de
https://www.ugr.es/~pomif/pom-bac/pb-v/pb-v-3-catalasa_oxidasa.htm
3. Condalab. (2019, 13 mayo). Medio SIM. Condalab.com. Recuperado 7 de abril de 2022,
de https://www.condalab.com

1. Abreviaturas

° C: grados Centígrados

h: horas

min: minutos

g: gramos

mL: mililitros

%: porciento
5.- PRUEBAS BIOQUÍMICAS DE IDENTIFICACIÓN BACTERIANA.

Segunda Parte

Etapa 1: Introducción a la Microbiología y características generales y estructurales de los

microorganismos.

1. Elemento de competencia: Aplicar los conocimientos acerca de la estructura, función y

principios nutricionales de la diversidad metabólica de los organismos procariotas en las
técnicas de laboratorio para que el estudiante pueda llevar a cabo el aislamiento y
caracterización morfológica de una bacteria.

1. Propósito de la práctica

• Comprender los fundamentos de las reacciones enzimáticas en las que se basan las
pruebas bioquímicas y aplicarlas para la clasificación o identificación bacteriana.

• Que el estudiante :

• Determine cualitativamente la actividad enzimática de: ornitina descarboxilasa, lisina

descarboxilasa, citrato desmolasa y ureasa en medios diferenciales adecuados para la
caracterización bioquímica de un microorganismo desconocido.

• Evalúe la capacidad para mantener estables los productos terminales ácidos a partir de
la fermentación de la glucosa de algunas bacterias entéricas.

• Detecte géneros bacterianos capaces de producir H2S, y de producir indol a partir de

triptófano.

• Analice integralmente los resultados de las pruebas bioquímicas obtenidas, para

determinar el grupo microbiano al que pertenece un microorganismo desconocido.

1. Introducción.

DESCARBOXILACIÓN DE LA ORNITINA. Esta prueba ayuda a diferenciar los géneros Enterobacter

(+) de Klebsiella (-) y las especies Proteus mirabilis (+) de P. vulgaris (-). En esta prueba se va a
determinar la capacidad de un microorganismo para descarboxilar el aminoácido L-ornitina,
donde se obtiene la diamina putrescina y CO2, lo cual conduce a una consiguiente alcalinidad del
medio. La enzima implicada en esta reacción es la ornitina descarboxilasa, la cual actúa sobre el
grupo carboxilo del aminoácido. La descarboxilación se determina en el medio diferencial MIO
(Agar movilidad - indol-ornitina) en el cual también se puede determinar la prueba de
producción de indol y motilidad del microorganismo.
DESCARBOXILACIÓN DE LA LISINA. Sirve para diferenciar los géneros: Edwardsiella (+),
Salmonella (+), Arizona (+), Citrobacter (-) y las especies Enterobacter aerogenes y E. hafniae (+)
de E. cloacae y E. agglomerans (-). En este caso el aminoácido L-lisina sufre descarboxilación
produciéndose la diamina cadaverina y CO2, lo cual conduce a una consiguiente alcalinidad del
medio; esto por acción de la enzima lisina-descarboxilasa. Esta prueba se puede determinar en
varios medios pero uno de los más usuales es el LIA (Agar lisina hierro) en este medio además se
pueden determinar desaminación de la lisina y producción de H2S.

REACCIÓN DE LA UREASA (hidrólisis de la urea). Esta prueba ayuda en la diferenciación e

identificación de los géneros Klebsiella (+) de Escherichia (-), Proteus (+) de Providencia (-) Dicha
prueba sirve para determinar la capacidad de un microorganismo para producir la enzima
ureasa, la cual hidroliza la urea por rompimiento de los enlaces carbono-nitrógeno de esta
diamina, formándose como productos CO2 y amoníaco, esto conduce al medio hacia un pH
alcalino. Existen varios medios para realizar esta prueba, uno de los más utilizados es el agar
urea de Christensen, este medio contiene el indicador de pH rojo de fenol el cual vira a rojo
cuando el medio es alcalinizado.

REACCIONES DEL IMViC. Las siglas del IMViC representan a cuatro pruebas que son indol, rojo de
metilo, Voges-proskauer y citratos. Estas pruebas son muy utilizadas en la diferenciación e
identificación de bacilos entéricos.

UTILIZACIÓN DE CITRATOS. Esta prueba permite diferenciar a Edwardsiella (-) de Salmonella (+),
Serratia liquefaciens (+) de Yersinia enterocolitica (-), Klebsiella-Enterobacter (+) de Escherichia
coli (-), aquí se determina la producción de la enzima citrato desmolasa la cual permite que el
microorganismo utilice el citrato como única fuente de carbono. Para realizar esta prueba se
utiliza el medio de citrato de Simmons que contiene citrato de sodio como única fuente de
carbono y sales de amonio como única fuente de nitrógeno y además un indicador de pH que es
el azul de bromotimol. Si el microorganismo tiene capacidad de utilizar estos sustratos, el
desdoblamiento de las sales de amonio provoca alcalinidad del medio que se detecta mediante
el azul de bromotimol (1,2).

1. Material para el desarrollo de la práctica

Material Biológico

1. Cultivos en caldo nutritivo de 24 h de incubación de los microorganismos: Proteus

mirabilis, Salmonella spp, E. coli, Klebsiella spp, B. subtilis.

Reactivos y otros materiales

• 2 tubos con medio MIO, 3 tubos con medio LIA, 4 tubos con caldo MRVP, 2 tubos con
Agar Urea y 2 con Agar citrato de Simmons. El tamaño de los tubos puede ser 13x100 o
15x125 con torunda o tapón de rosca. Nota: parte de este material se guardara en
 refrigeración para trabajar en el PIA, se recomienda preparar este material con tubos de
tapón de rosca.

• Reactivos: Kovac, rojo de metilo, alfa-naftol y KOH al 40%.

• Mechero

• Gradilla

• Asa bacteriológica

• Encendedor, etiquetas y algodón

• Alcohol al 70%

• Incubadora 37 °C

• Bata, cubrebocas y cofia.

1. Procedimiento para el desarrollo de la práctica

Nota: Tomar fotografías de todos los tubos antes de inocularlos, estos serán tomados como
control.

a. Descarboxilación de la Ornitina

1. Inocule por separado dos tubos con medio MIO por picadura hasta el fondo con las
bacterias P. mirabilis, y Klebsiella spp.

1. Incube todos los tubos con medio MIO a 37 ºC por 24 a 48 h.

1. Interprete sus resultados observando y comparando sus medios inoculados con el

control, determinando los cambios que se registren.

Nota: La prueba positiva se obtiene al observar un color púrpura en el fondo del medio. En este
medio (MIO) también se puede determinar movilidad y además indol, para la prueba de indol
añada unas gotas del reactivo Kovac después de haber determinado la descarboxilación de la
ornitina y motilidad.

a. Descarboxilación de la Lisina

1. Inocule el medios LIA por picadura y estría con los microorganismos P. mirabilis, E. coli, y
Salmonella spp

1. Incube los medios de LIA a 37 º C por 24 a 48 h.

1. Tome nota de los cambios que mostraron cada uno de los medios inoculados,
comparándolos con el control.

Nota: En el medio LIA se pueden obtener varios resultados, algunos de los más representativos
se enlistan enseguida. Asegúrese de consultar la literatura correspondiente para interpretar sus
resultados debidamente en la sección de Discusiones.
a) Superficie púrpura y fondo amarillo, b) Superficie púrpura y fondo púrpura, c) Superficie roja y
fondo amarillo y d) Superficie púrpura y fondo negro

c) Reacción de la Ureasa (hidrólisis de urea).

1. Inocule por estría toda la superficie del medio de agar urea, con los microorganismos:
Proteus spp. y E. coli.

1. Incube todos los medios a 37 º C por 24 h.

1. Registre los cambios comparando sus medios inoculados con el control negativo.

Nota.- Esta prueba es positiva cuando el medio toma un color rojo que se extiende de la
superficie al resto del medio de cultivo.

d) Prueba de rojo de Metilo.

1. Inocule dos tubos de medio MR- VP con el microorganismo: E. coli y dos más con
Klebsiella spp. o B. subtilis.

1. Incube los tubos con medio a 37ºC por 48 h.

1. Separe sus tubos de medio MRVP en juegos de dos tubos donde un juego esté inoculado
por E. coli y el otro por Klebsiella spp.

1. Utilice un juego de tubos para realizar rojo de metilo, añada 5 unas gotas del reactivo
rojo de metilo a sus tubos y registre de inmediato sus resultados.

Nota.- Los microorganismos rojo de metilo positivo, muestran una coloración roja del medio al
reaccionar con el reactivo.

e) Prueba de Voges-Proskauer.

1. Utilice el otro juego de tubos con medio de MRVP para

determinar Voges-Proskauer. Añada en orden los siguientes
reactivos: 5 gotas de alfa naftol más 3 gotas de KOH al 40%, agite bien el medio en el
tubo y déjelo reposar por 30 a 60 minutos.

1. Registre los resultados para cada uno de los microorganismos.

Nota: Los microorganismos positivos desarrollan un color rosa en la superficie del medio después
de 30 – 60 min., el cual se extiende hacia el fondo del medio en el tubo.

f) Prueba de utilización de Citratos.

 1. Inocule por estría toda la superficie del agar citrato de Simmons un con E. coli y otro con
Klebsiella spp.

1. Incube todos los tubos con el medio a 37 º C por 24 h.

1. Compare sus medios inoculados, con el control. Registre y anote los cambios que se
observen (3,4).

Nota: Un cambio de verde a azul del medio, nos indica que ese microorganismo es positivo.

1. Análisis de resultados

Construya una matriz para registrar tus resultados en donde para cada microorganismo
evaluado, siguiendo el ejemplo a continuación.

PRUEBA “A” Observación de resultado Interpretación de resultado

Microorganismo #1 Describir cambios de color, ¿Qué significa el cambio de color o

producción de gas, precipitación, producción de gas? ¿Prueba
Microorganismo #2
etc. positiva o negativa? ¿Presencia u
Microorganismo #3 ausencia de enzima?

Control negativo
PRUEBA Oxidasa Observación de resultado Interpretación de resultado

B. subtilis En la placa mostró un color azul El cambio de color se debe a que

después de añadir cuando se le aplica el reactivo con
E.coli
tetrametilparafendiamina. la presencia de oxígeno se oxida y
se convierte en azul de indo fenol
indicando que la prueba es positiva

PRUEBA Catalasa Observación de resultado Interpretación de resultado

P.aeuriginasa En la placa efervescencia después de La efervescencia se debe a la

añadir el peróxido de hidrogeno. descomposición del peróxido de
E.coli
hidrogeno a agua y oxígeno. Al
aplicar el peróxido de hidrogeno se
mostró efervescencia el cual indica
que la prueba es positiva

PRUEBA OF Observación de resultado Interpretación de resultado

P.aeuriginasa Los tubos mostraron un color verde Al tener un color verde en nuestros
fuerte. medios quiere decir que la vía es
E.coli
oxidativa.

PRUEBA KIA Observación de resultado Interpretación de resultado

Proteus spp Uno de los tubos (Salmonella) no En el caso de proteus spp. El color
tuvo cambios, su color permaneció negro en el medio nos indica una
Salmonella spp
en rojo, en el caso del proteus el tubo producción de H2S.
cambió a color negro.

PRUEBA INDOL Observación de resultado Interpretación de resultado

E.coli En el tubo donde se inoculó E.coli se Los reactivos de Erhlich o Kovacs

puede observar un aro violeta contienen DMABA que reacciona
Salmonella spp
encima del líquido color amarillo. con el indol producido formado un
compuesto quinónico color violeta
 esto nos indica que hay presencia
de la enzima triptofanasa

PRUEBA MIO Observación de resultado Interpretación de resultado

Klebsiella El tubo donde se inoculó proteus spp. Al presentar el proteus spp un

Presenta un color morado y partes color morado y en la superficie un
Proteus spp
amarillas con un anillo color rojo en color amarillo con un anillo rojo
la superficie, en la parte de klebsiella nos indica que el indol es positivo
se presenta un color amarillo y un mientras que en la klebsiella nos
ligero anillo color rojo en la superficie indica que el indol es negativo.

PRUEBA LIA Observación de resultado Interpretación de resultado

Salmonella spp El tubo donde se inoculó proteus spp. Al presentar el proteus spp un
Presenta un color amarillo con color color amarillo y en la superficie un
Proteus spp
rojo en la superficie. color rojo nos indica que hay una
desaminación.
En el tubo de la salmonella presenta
un color negro. El tubo de la salmonella color
negro nos indica una producción
de H2S

PRUEBA CITRATOS Observación de resultado Interpretación de resultado

Klebsiella En el tubo donde se inoculó klebsiella Al presentar un color azul verdoso

podemos observar un tono color azul en el tubo de klebsiella se
E.coli
verdoso mientras que en el tubo demuestra que el resultado es
donde se inoculo E. coli se ve verde positivo lo que quiere decir que
ocurre la producción del enzima
citrato
Llene la siguiente tabla, complete los espacios utilizando las evidencias que obtuvo en las
actividades realizadas en esta práctica.

Medio de Actividades Descripción de un resultado Grupo de

Cultivo enzimáticas/bioquímicas positivo microorganismo que
evaluadas identifica una prueba
positiva

MRVP producción de al adicionar KOH se da una E.coli positivo

acetilmetilcarbinol coloración roja.

LIA Descarboxilación de la Cambia el color purpura del Salmonella positiva

bromocresol.
lisina Proteus negativo

MIO descarboxilar el no cambia de color es positivo Proteus positivo

aminoácido L- ornitina
Klebsiella negativo

OF utiliza las vías de la Cambia de color de verde a Diferencia Klebsiella

Glucólisis (Embden- amarillo positivo
Meyerhof-Parnas EMP), de
de E. coli negativo.
las Pentosas fosfato y
Entner-Doudoroff.

Citratos Se determina la producción Cambio de color del medio de Klebsiella positivo

de enzima citrato
Color verde a color azul. de E. coli negativo.
Discusión

En esta práctica pudimos observar diferentes resultados para cada prueba bioquímica,
indagando en distintas fuentes de investigación pudimos observar algunas similitudes en
algunos resultados y diferencias en algunos otros.

En la prueba de la oxidasa como resultado se pudo observar una enorme mancha color azul,
según Cercenado (2014) dice que “En presencia de oxígeno atmosférico la enzima intracelular
citocromo oxidasa oxida el reactivo fenilendiamina y forma un compuesto color púrpura”
comparando nuestro resultado con otros compañeros el resultado es el mismo, no ocurre una
mancha color purpura sino color azul, característica del azul de indo fenol.

En la prueba de la catalasa después de añadir peróxido de hidrogeno ocurro efervescencia tal y

como era de esperarse, Ismael Soto López (2007) nos menciona que “La catalasa es una enzima
perteneciente a la categoría de las oxidorreductasas que cataliza la descomposición del peróxido
de hidrógeno (H2O2) hacia oxígeno y agua”. Razón por la que al colocar el peróxido de
hidrogeno ocurre la reacción de efervescencia.

Como resultados importantes en nuestra prueba de citrato no estamos totalmente seguro si

ocurrió un gran cambio ya que apenas se nota algún cambio de color en nuestros medios,
consultando diferente literatura nos mencionan que “Es positiva cuando se observa crecimiento
a lo largo de la estría, y este se acompaña o no de un viraje del indicador de verde a azul. El
cambio de color del medio a azul indica una reacción positiva” (Natalia Izurieta, 2011). Por lo
cual nos preocupa el resultado que obtuvimos, este fallo puede deberse a un mal manejo de
reactivos

Conclusión

En esta práctica se logró comprender con éxito la preparación de distintas pruebas bioquímicas.
Aprendimos a preparar diferentes pruebas bioquímicas e interpretar los resultados de esta. En
lo personal esta práctica me gustó mucho ya que pudimos apreciar las diferentes pruebas y sus
resultados, fue sorprendente el cómo cambiaban de color algunas pruebas, esta practica sera de
suma importancia una vez esté en campo laboral ya que por ejemplo en la prueba de la ureasa
se verá mucho en el área clínica.

Cuestionario

1. Explique la reacción bioquímica de la ureasa y diga por qué es importante esta enzima en
microorganismos de interés clínico o sanitario.

la ureasa es la hidrólisis de urea hacia ácido carbámico; la cual se produce 10₁₄ veces más rápido
en presencia de dicha enzima, teniendo como productos el ácido carbónico y el amoníaco en la
prueba de la ureasa se utiliza el rojo fenol el cual indica la presencia de amonio el cual es el
resultado de la ureasa

Esta enzima es de gran importancia ya que aumenta el pH del lugar en que está presente y
favorece su proliferación.

1. ¿Qué es la desaminación de la Lisina? ¿cómo se observa esta reacción enzimática

positiva en el medio LIA?

La desaminación se produce ácido alfa-ceto-carbónico, el cual, con la sal de hierro y bajo la

influencia del oxígeno forma un color rojizo en la superficie del medio y un color amarillento en
la base.

Elemento Cumple/No
Aspectos Criterio Puntos
(puntos) cumple

Manual identificado en la
Manual de portada con nombre y grupo,
Laboratorio (5) entregado a tiempo y contestado
a mano con letra legible.
FORMA El estudiante participa
activamente durante la
Trabajo en equipo
realización de la práctica. Se
(5)
integra con sus compañeros de
equipo.

Completos, ordenados y concisos,

presentados en párrafos, tablas o
Resultados (25)
gráficos claramente
FONDO identificados.

Discute todos los resultados

Discusiones (25) obtenidos, comparándolos con lo
reportado en literatura,
 colocando la referencia entre
paréntesis y en el formato
correcto.

Argumenta de forma adecuada,

Conclusiones (20) de acuerdo al objetivo propuesto
y a los resultados obtenidos.

Contesta correctamente todas las

Cuestionario (10)
preguntas

Referencias Es actual y/o especializada y

(10) además sigue el formato APA.

1. Instrumento de evaluación

Lista de cotejo para evaluar la práctica Salto de página

1. Referencias

a) Citas en el texto

1. Madigan M. T., J. M. Martinko, J. Parfer, T. D. Brock. 2009. Biología de los

Microorganismos. Décima segunda Edición. Prentice Hall Iberia, Madrid España.

1. Segretain G., E., Drouhet y F. Mariat. 1977. Diagnóstico de Laboratorio en Microbiología

Médica. Editorial Fournier, S. A., México, D. F.

1. Cowan S. T., K. J. Steel. 1985. Manual Para la Identificación de Bacterias de Importancia

Médica. Segunda Edición. CIA. Editorial Continental, S. A. de C. V., México.

1. Mac Faddin J. F. 1984. Pruebas Bioquímicas Para la Identificación de Bacterias de

Importancia Clínica. Editorial Médica Panamericana S. A., México, D. F.

b) Literatura consultada

1. Cercenado, E., & Cantón, R. (2014, 1 junio). Procedimientos en Microbiología Clínica.

Seim.org. Recuperado 7 de abril de 2022, de
https://seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/sei
mc-procedimientomicrobiologia37.pdf
2. Soto López, I. (2015, 16 enero). El tema de la catalasa en los diferentes niveles de
enseñanza aprendizaje. Pag.org. Recuperado 7 de abril de 2022, de
https://www.pag.org.mx/index.php/PAG/article/view/265
 3. Izurieta Cergneux, N. (2011, 29 mayo). Laboratorio no. 5 pruebas bioquímicas.
Slidershare.net. Recuperado 7 de abril de 2022, de
https://es.slideshare.net/nataliaizurieta/laboratorio-no-5-pruebas-bioqumicas-8146300

9. Abreviaturas

h: horas

° C: grados Centígrados

%: porciento

pH: potencial de hidrógeno