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Lic. En Biol.

Gregorio Poot Mex


Replica curso de
determinacin Salmonella sp.
y Listeria monocytogenes en
alimentos.
Actualizaciones en determinacin de Salmonella sp.
y Listeria monocytogenes en alimentos
En las siguientes diapositivas se
expondr las actualizaciones en
la determinacin de Salmonella
sp y Listeria monocytogenes para
su aislamiento en muestras de
alimentos.



Se trata de las actualizaciones
que propone el PROY-NOM-210-
SSA1-2013 y sobre las cuales fue
efectuado el curso taller L.
monocytogenes y Salmonella sp.
Caractersticas del gnero
Salmonella
Bacilo Gram negativo
Familia Enterobacteriaceae
Generalmente mviles
Aerobios o anaerobios facultativos
Antgenos somticos O (lipopolisacrido)
Antgenos flagelares H (protenas)
Determinacin de Salmonella sp.
Pre- enriquecimiento
Se utiliza de manera general el Caldo Lactosado.
Incubar por 24 +/- 2 h a 35C
Enriquecimiento selectivo
Se utilizan Caldo Selenito Cistina y Caldo Tetrationato.
Incubar por 24 +/- 2 h a 35 C. Adicionar 0.2 ml de Yodo
Yoduro y 0.1ml de Verde Brillante. Se menciona el uso del
Caldo Rappaport Vassiliadis
Seleccin en medios slidos
Se menciona que se pueden utilizar tres agares de los
siguientes: Agar Verde Brillante, Agar Sulfito de Bismuto y
Agar XLD, Agar Hektoen, Agar SS. Incubar por 24 +/- 2h a 35
+/- 1C
Se menciona que se prueben dos o ms colonias tpicas de
cada placa
Identificacin bioqumica
Menciona pruebas bioqumicas adicionales para la
identificacin cuando no se identifica directamente con la
serologa.
Confirmacin serolgica
N
O
M

-
1
1
4

S
S
A
1
-
1
9
9
4

Prueba de ureasa se
puede incluir en las
pruebas presuntivas
Pre- enriquecimiento
Se utiliza de manera general el Agua Peptonada
Amortiguada. Incubar por 18 +/- 2 h a 37C
Enriquecimiento selectivo
Se descarta el uso del Caldo Selenito Cistina.
Se utiliza el Calo Mller- Kauffmann Tetrationato
novobiocina. 0.2 ml de solucin Yodo Yoduro Incubar
por 24 +/- 3 h a 37 +/- 1C +/- y se utiliza el Caldo
Rappaport Vassiliadis. Incubar por 24 +/- 3 h a 41.5 +/-
1C.
Seleccin en medios slidos
Se indica el uso de Agar XLD y se menciona que se
utilicen dos agares ms, Agar Sulfito de Bismuto y
Agar Hektoen. Incubar por 24 +/- 3 h a 37 +/- 1C
Se menciona que se prueben dos o ms colonias
tpicas de cada placa y si no hay, dos o ms colonias
atpicas.
Sembrar en agar nutritivo ; incubar 24 hrs a 35 c
Identificacin bioqumica y serologa.
Prueba de Ureasa
Prueba de Lisina descarboxilasa
Deteccin de Beta-Galactosidasa
Prueba de Indol
Prueba de Voges Proskawe
Implica un da ms de anlisis
P
R
O
Y
-
N
O
M

-
2
1
0

S
S
A
1
-
2
0
1
3

COMPARACIN DE LA NOM-114-SSA1-1994 y El
Proyecto de la NOM-210-SSA1-2013

CONCLUSIN
NOM-114
Se utiliza de manera general el Caldo
Lactosado. Incubar por 24 +/- 2 h a
35C
Tiempo total: 4 das
Permite el uso de otros medios solidos
para aislamiento.
Tsi y Lia

Proy. NOM-210
Tiempo total: 6 das
Se utiliza de manera general el Agua
Peptonada Amortiguada. Incubar por
18 +/- 2 h a 37C
Incluye el uso de novobiocina permite
mejor selectividad en el
enriquecimiento. MKTTn
Pruebas bioquimicas adicionales
Se mantienen XLD, SB y Hecktoen.

Listeria monocytogenes
Generalidades
Gram (+)
Bacilo 1-2 x 0.5-0.8 m
No esporulado
0 45 C [37 C]
pH 5.0 9.6 [pH 7.0]
Tolera 10 % NaCl
C

a

r

a

c

t

e

r


s

t

i

c

a

s

Patgeno intracelular
facultativo
-hemlisis discreta |
CAMP (+)
hidroliza la esculina
oxidasa(-) catalasa (+)
Voges-Proskauer y Rojo de
Metilo (+)
Flagelos pertricos / 25 C
(Mandell et al., 2002).
Ciclo infectivo L. monocytogenes
La bacteria es inocua en el medio
ambiente y es la modificacin del
ambiente al ser sometida a presin
selectiva la que permitir la
expresin de los factores de
virulencia.
1.- Entrada a las clulas del husped.
2.- Escape del fagosoma y desarrollo
intracelular.
3.-Desplazamiento intracitoplsmico.
4.- Diseminacin clula a clula.
Especies de Listeria
L. monocytogenes
L. ivanovii
L. seeligeri
L. innocua, L. welshimeri, L. grayi, L.
murrayi, L.rocourtiae. L. marthii
La identificacin de Listeria
monocytogenes se apoya
en las caractersticas
fisiolgicas, bioqumicas y
antignicas:
L.monocytogenes se
divide en 14 serotipos,
identificados por la frmula
somtica (O) y flagelar (H).
Determinacin Listeria monocytogenes
NOM-143-SSA1-1995
Tomar 25 gr o ml en 225 caldo EB
homogeneizar, incubar por 48 hrs a
30c
Resembrar en OXA a 35c
por 24 a 48 hrs .
Colonias negras con halo
negro
Resembrar en LMP a 30 c
de 24 a 48 hrs.
Con iluminacin de Henry
colonias de color blanco o
azul iridiscentes.
Seleccionar 5 o mas colonias tpicas y
pasar a placas de ASTEL
35c por 24 hrs
a 24 y 48 h
a 24 y 48 h
Prueba de
movilidad en
fresco.
Solucion salina
0.85%
Tincion gram.
Gram +
Prueba de
catalasa.
Solucin de
perxido al 3%
Prueba de hemolisis.
Agar sangre de cordero al 5%.
48 hrs a 35c
Prueba de reduccin de nitrato.
Caldo nitratos incubar a 35c x 5 das.
Leer 0.2ml de reactivo A y 0.2ml reactivo B rojo
indica nitritos
Agregar zinc en polvo rojo despus de 1h indica
nitratos.
Prueba de movilidad en
agar.
Usando SIM o MTM forma
de paraguas.
7 dias de 20 a 25c
Prueba de Cristie-Atkins-Munch-Peterson.
SINERGIA DE HEMOLISINAS
En agar sangre de carnero
Rhodoccocyus equi ATCC 6339
Staphylococcus aureus ATCC 25923
Incubar a 35c por 24 a 48 hrs

Serologia.
Informe. Reportar
presencia/ausencia en 25 gr
o ml.
Prueba de utilizacin de carbohidratos.
En caldo purpura de bromocresol al 5% con:
Dextrosa, Esculina, Maltosa, Ramnosa, Manitol y
Xilosa.
A 35c por 7 dias
Polivalente listeria monocytogenes
Determinacin Listeria monocytogenes
PROY- NOM-210-SSA1-2013
25 g r o ml de la muestra en 225
caldo Fraser medio a 30c1c por
242 h
Nota: una coloracin oscura puede
aparecer.
Inocular por estra
cruzada 2 placas Oxford a
30c1c a de 24 a 48 hr
Colonias a 24 h pequeas
de 1mm grisceas
rodeadas de un halo
oscuro a las 48 horas de 2
mm oscuras con posible
brillo verdoso halos
negros y centros hundidos
Inocular PALCAM 2 placas
por estra cruzada incubar
a 37c1c por 24 a 48 hrs
Colonias a 24 hrs muy
pequeas grisceas o
verde olivo de 1.5 a 2mm
a veces con centros negro
pero siempre con halos
oscuros a las 48 horas de
color verde con el centro
hundido y halos negros Transferir 0.1ml del enriquecimiento
primario a caldo Fraser incubar a48h2 h
a 37c1c

Presuntivo: Observacin de la
hidrlisis de la esculina.
Seleccionar 5 o mas colonias
sospechosas y pasar a placas de TSYEA
por estra cruzada incubar a 37c2C
por 18 a 24 hrs no mas de 72 hrs
Se puede usar ptica de Henry como
parte informativa colonias azul-gris o
azul.
Se recomienda TSYEA delgado 15ml por
placa
Prueba de movilidad en fresco.
Tomar una colonia aislada de
TSYEA e inocular CSTYE
incubar a 25c1c por 8 a 24
hrs o hasta turbiedad examinar
en microscopio.
Tincion gram. Gram +
Prueba de catalasa.
Solucin de perxido al 3%
Prueba de movilidad en
agar.
forma de paraguas.
Incubar 25c1c por 48 h

Pruebas complementarias.






Tincin gram a 100 x
Prueba catalasa
Forma tpica de paraguas en Agar
Movilidad
Prueba de hemolisis.
Agar sangre de cordero al 5%
Dibujar una cuadricula de 20 a 25 cuadros inocular
por picadura; utilizar cepas de referencia
L.monocytogenes y L.innocua.
L. monocytogenes produce una zona discreta de3
hemolisis alrededor de la picadura; L. innocua no
muestra una zona de hemolisis y L.ivanovii
muestra una zona ancha, clara y delimitada por -
hemolisis.
Prueba de utilizacin de carbohidratos.
Ramnosa y xilosa
En caldo carbohidratos inocular usando colonias
de TSYEA. Incubar a 35c2c por 5 das.
Pueden usarse sistemas de bioqumicas
miniaturizadas o tcnicas de biologa molecular.
Prueba de Cristie-Atkins-Munch-Peterson.
SINERGIA DE HEMOLISINAS
En agar sangre de carnero
Rhodoccocyus equi ATCC 6339
Staphylococcus aureus ATCC 25923
Incubar a 35c2c por 12 a 18 hrs

Para fines de vigilancia sanitaria , los aislamientos
que seran considerados como L. monocytogenes
deben ser enviados al laboratorio de referencia de
la COFEPRIS para realizar tipificacion.
Polivalente listeria monocytogenes
Sistema API LISTERIA
PRUEBA CAMP
PRUEBAS PARA CONFIRMACION DE LISTERIA MONOCYTOGENES
GRACIAS