BACTERIOLOGÍA DETERMINATIVA (24981)

PRACTICA No.2.
PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN

GÉNEROS Staphylococcus y Enterococcus

INTRODUCCIÓN

Reino: Bacteria, filo: Firmicutes, clase: Bacilli, orden:

Lactobacillales, familia: Streptococcaceae,
género: Streptococcus.
Reino: Bacteria, filo: Firmicutes, clase: Bacilli, orden:
Lactobacillales, familia: Enterococcaceae,
género: Enterococcus.

El género Streptococcus comprende un grupo heterogéneo de

bacterias Gram positivas conimportancia en el campo médico y la
industria. Los miembros de este género bacteriano son cocos
Gram positivos que generalmente se disponen en parejas o Fuente: https://www.freepng.es/png-78g99x/
cadenas, no son mótiles, no forman esporas y son catalasa
negativo. La mayoría de las especies son anaerobios facultativos, pero algunos crecen únicamente en
atmosfera enriquecida con dióxido de carbono (CO2)1. Sus exigencias nutricionales son complejas por lo que
su aislamiento requiere el uso de medios enriquecidos con sangre. Varias especies de estreptococos se
encuentran como flora microbiana normal de animales y humanos; sin embargo, algunas especies pueden
causar enfermedades.

Este género incluye tres de los patógenos más importantes de los seres humanos: el S. pyogenes, S. agalactiae
y S. pneumoniae2.

OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA

• Observar y describir las características macroscópicas y microscópicas de las especies

de Streptococcus y Enterococcus.
• Seleccionar y realizar pruebas microbiológicas que permitan la identificación de Streptococcus
y sus especies.
• Diferenciar las especies bacterianas según las características bioquímicas.

CONTENIDO DE LA PRÁCTICA

Materiales y reactivos:

• Asa recta y curva • Encendedor

• Gradilla • Microscopio
• Elementos de protección personal • Aceite de inmersión
• Láminas portaobjetos • Solución salina estéril
 • Coloración de Gram
• H2O2 al 3%
• Sensidisco: bacitracina, Optoquina, SXT
• Desoxicolato de sodio

• Medios de cultivo: caldo tioglicolato, BHI salado 6.5% NaCl, agar sangre, caldo Mueller-Hinton,agar
bilis esculina, agar BHI salado (NaCl 6,5%), caldo BHI suplementado con PYR 0,01%, agar base con
telurito 0,8%.

TRABAJO DE LABORATORIO

Día # 1:

1. Limpiar, desinfectar y preparar el área de trabajo. Poner un retazo de papel Kraft en el mesón.
2. A partir de la muestra entregada realizar frotis directo, colorear con Gram y observar al
microscopio morfología y agrupación. Describa lo que observa y realice el reporte.
3. Sembrar en los medios agar sangre utilizando el método de estrías por agotamiento.
4. Incubar los medios inoculados a 35°C por 24 horas en atmósfera de CO2.

Día # 2:

Inicio del laboratorio Clasificación de

Lancefield
Pruebas de
identificación para
Observación de la Grupo D Streptococcus grupo D
hemólisis y Enterococcus

Alfa hemólisis Beta hemólisis Gamma hemólisis

Pruebas de Pruebas de
identificación para identificación para alfa-
beta-hemolíticos hemolíticos

5. Luego de 24 horas de incubación, analizar e interpretar el crecimiento microbiano observado:

describir las características macroscópicas, microscópicas, presencia de hemólisis y cambios
bioquímicos en el medio.
6. Realice coloración de Gram para observar morfología y agrupación de los cocos.
7. Realice las pruebas de identificación de especies de Streptococcus.
Pruebas de identificación de Streptococcus

A. Catalasa: los Streptococcus no producen catalasa por ende todas las especies de este género son
catalasa-negativos.

2. Procedimiento:
1. Tomar una colonia con un palillo y depositarla en una lámina porta objetos.
2. Agregar una o dos gotas de de H2O2 al 3%
3. Observar la producción de burbujas.
4. Utilizar como control positivo una cepa de Staphylococcus aureus.

3. Resultado:
Catalasa positiva: producción de burbujas (producción de O2) al contacto de la colonia evaluada con el H2O2
que confirma la producción de catalasa.
Catalasa negativa: ausencia de burbujas luego de 20 segundos de mezclar la colonia con el H2O2.
B. Hemólisis: el crecimiento de los Streptococcus en agar sangre permite la visualización de la hemólisis
producida por diversas especies. La lisis de los eritrocitos es causada por una exotoxina denominada
estreptolisina (S y O)1. Basado en el tipo de hemólisis los Streptococcus pueden agruparse en alfa, beta
y gamma hemolíticos:

Hemólisis alfa (α): aclaramiento parcial de la sangre alrededor de las colonias con una coloraciónverde.
Hemólisis beta (β): aclaramiento completo de la sangre alrededor de las colonias.
Hemólisis gamma (γ): no hay cambio en el medio alrededor de la colonia, no hay lisis de loseritrocitos.
Doble zona de hemólisis: lisis completa alrededor de la colonia con una segunda zona de hemólisisparcial
alrededor de la lisis completa.

Nota: La hemólisis en medios de cultivo puede variar según el agar base y la fuente de sangre utilizada. Por
ejemplo; si se utiliza sangre equina los enterococos pueden ser α, β o γ-hemolíticos; en medio con sangre
humana son β-hemolíticos y en medio con sangre ovina γ-hemolíticos.

Pruebas para identificación de Streptococcus β-hemolíticos.

A. Prueba de aglutinación: permite la identificación de serotipos entre los Streptococcus β-

hemolíticos, que constituyen los patógenos humanos más frecuentemente aislados entre los
representantes de este género2,3. La mayoría de los Streptococcus β-hemolíticos poseenantígenos de
carbohidratos específicos que han sido utilizados para clasificarlos en diferentes serotipos (grupos).
Rebecca Craighill Lancefield (1895-1981), dedicó su vida al estudio de este género bacteriano y con
sus investigaciones demostró que los antígenos estreptocócicos pueden extraerse en forma soluble
e identificarse mediante reacciones de precipitación con antisueros homólogos (específicos de
antígeno)2,3,4.

El método de identificación de grupos utilizado en el BD BBL Streptocard Enzyme Latex TestKit

implica la extracción enzimática de los antígenos y aglutinación con partículas de látex (poliestireno)
de color azul conjugadas con inmunoglobulinas (anticuerpos) de conejo específicas del grupo
permitiendo la identificación de los grupos A, B, C, D, F y G. Las partículas de látex se aglutinan
rápidamente en presencia del antígeno homólogo y no se aglutinan en su ausencia.

Procedimiento:
Nota: Todos los componentes deben estar a temperatura ambiente antes del uso.
1. Resuspender los reactivos del kit mezclando cada frasco por inversión varias veces.
2. Marcar un tubo de ensayo para cada cepa aislada que se va a analizar.
 3. Añadir 200 µL de enzima extractora a cada tubo.
4. Seleccione de 2 a 4 colonias β-hemolíticas con un asa de argolla y suspéndalas en lasolución
de la enzima extractora del tubo de ensayo.
5. Incubar en un baño maría a 37°C por 10 minutos. Mezclar cada tubo a los 5 minutos de
incubación.
6. Dispensar una gota de anticuerpo específico de cada grupo (anti-A, -B, -C, -D, -F y -G) en círculos
independientes de las tarjetas de análisis etiquetadas para cada cepa aisladaque se va a analizar
(ver figura 1).
7. Añada una gota del antígeno extraído sobre cada gota de anticuerpo específico.
8. Mezclar las dos gotas con un palillo de madera cubriendo el área del círculo por
completo. Se debe usar un palillo nuevo para cada círculo (anticuerpo).
9. Agitar con cuidado las tarjetas para que la mezcla fluya lentamente sobre toda el áreade los
círculos de análisis.
10. Observar si la aglutinación se produce en un tiempo máximo de 30 segundos

Figura 1. Tarjeta de análisis para la prueba de aglutinación.

Resultados:
Resultado positivo: aglutinación rápida y fuerte en 30 segundos con uno de los anticuerpos. Aglutinación
(débil) con más de un anticuerpo específico de grupo, con fuerte aglutinación con un único anticuerpo,
Streptococcus duales5.
Resultado negativo: ninguna aglutinación de las partículas de látex.
Resultado no concluyente:
4. Si se observan una aglutinación débil o una reacción no específica (viscosidad) en el círculo después de
30 segundos, el análisis se debe repetir con un subcultivo reciente. Si se observa el mismo resultado
después de repetir el procedimiento, se deben realizar pruebas bioquímicas para identificar la cepa aislada.
5. Si el grado de aglutinación es similar en más de un grupo, es preciso comprobar la pureza del cultivo
usado para realizar el análisis. Si parece puro, repita la prueba y confirme la identificaciónde la cepa aislada
mediante análisis bioquímicos.

B. Susceptibilidad a la bacitracina: se utiliza para la identificación presuntiva de Streptococcus β-

hemolíticos del grupo A ya que estos son sensibles a este antibiótico mientras que los del grupo B son
resistentes. El sensidisco de bacitracina se utiliza a una concentración de 0,04 U6.

Procedimiento:
1. Tomar con asa recta una colonia pura y aislada de la cepa a estudiar y sembrar en agar sangre con
siembra masiva y uniforme utilizando media caja.
2. Colocar el disco de bacitracina (A) en el centro de la siembra.
3. Incubar a 35°C de 18 a 24 horas en aerobiosis.
 Resultados:
Bacitracina sensible: formación de halo de inhibición.
Bacitracina resistente: no hay halo de inhibición.

Nota: cualquier halo de inhibición frente a bacitracina debe considerarse como positivo para
Streptococcus del grupo A.

C. Susceptibilidad al trimetropin sulfametoxasole (SXT): la

evaluación de la susceptibilidad a SXT permite diferenciar los
Streptococcus β-hemolíticos del grupo A y B, que son resistentes a este
antibiótico, de otros grupos (C, F y G) que son sensibles. Se utiliza un
sensidisco de SXT de concentración 1,25 mg de trimetropin y 23,75 mg
de sulfametoxasole6.

Procedimiento:
1. Tomar con asa recta una colonia pura y aislada de la cepa a
estudiar y sembrar en agar sangre con siembra masiva y
uniforme utilizando media caja.
2. Colocar el disco de SXT en el centro de la siembra.
3. Incubar a 35°C de 18 a 24 horas en aerobiosis.
Nota: Realizar las pruebas de
susceptibilidad a SXT y bacitracina en
Resultados: la misma caja.
SXT sensible: formación de halo de inhibición.
SXT resistente: no hay halo de inhibición.

D. Prueba de CAMP: se utiliza para la identificación presuntiva de Streptococcus del grupo B los cuales
secretan una proteína llamada “factor CAMP” o β-lisina que interactúa con la β- hemolisina producida
y liberada por S. aureus produciendo una hemolisis mayor o sinérgica.Para esta prueba se utiliza una
cepa de S. aureus productora de β-hemolisina (β-lisina) que se siembra en una sola estría y
perpendicular a esta se siembra el aislamiento a evaluar. Cuando el factor CAMP entra en contacto
con la β-lisina de S. aureus se forma una cabeza de flecha en el punto de unión de las dos estrías6. Esta
prueba es altamente sensible, e incluso cepas del grupo B no hemolíticas serán CAMP positivas.

Procedimiento:
1. Tomar con un asa de argolla una colonia de S. aureus productor de β-lisina y sembraruna
estría horizontal en la mitad de un agar sangre.
2. Tomar una colonia del aislamiento de a evaluar y sembrarlo en una estría rectaperpendicular
a la siembra de S. aureus, sin unir las dos estrías (ver figura 2).
3. Usar control positivo (cepa de S. agalactiae productora de factor CAMP) y negativo (cepano
productora de factor CAMP).
4. Incubar a 35°C de 18 a 24 horas en aerobiosis.
Figura 2. Siembra de prueba CAMP en agar sangre. Estría de S. aureusen la
mitad del agar, estrías de controles positivo y negativo y cepa a evaluar
perpendiculares a la siembra de S. aureus.

Resultados:
Positivo: se observa una hemolisis en forma de cabeza deflecha
en la intersección de las dos estrías.
Negativo: no se observa la hemolisis en cabeza de flecha en la
intersección de las dos estrías.

E. Fermentación de la trehalosa: Permite la identificación

presuntiva de S. pyogenes dentro de los estreptococos del
grupo A de Lancefield. Se emplea un caldo de carbohidratos
con rojo de fenol como indicador.

Procedimiento:
1. A partir de una colonia aislada inocular por transferencia de colonias el caldo base y el
suplementado con trehalosa.
2. Incubar a 35°C de 18 a 24 horas

Resultados:
Positivo: Viraje de color de rojo a amarillo en el tubo de trehalosa.
Negativo: no se observa viraje de color

Pruebas para identificación de Streptococcus α-hemolíticos.

A. Prueba de susceptibilidad a la Optoquina: es una sustancia química, clorhidrato de

etilhidrocupreína (optoquina). Es un derivado del alcaloide hidroquinina que se obtiene mediante
hidrogenación, desmetilación y etilación de la quinina6. Esta prueba se utiliza paradiferenciar entre S.
pneumoniae y otras especies de Streptococcus α-hemolíticos (viridans). La sensibilidad a la
Optoquina prueba la fragilidad de la membrana celular bacteriana ya que cambia la tensión
superficial induciendo la lisis celular de las bacterias sensibles y se produce una zona de inhibición
por el contacto con esta sustancia5.

Procedimiento:
1. Tomar una colonia pura y aislada de la cepa a estudiar, y sembrar en agar sangre con siembra
masiva y uniforme utilizando media caja.
2. Colocar el disco de bacitracina en el centro de la siembra.
3. Incubar a 35°C de 18 a 24 horas con atmósfera de 5% de CO2.

Resultados:
Optoquina sensible: formación de halo de inhibición de >14 mm. Positivo para S. pneumoniae.
Optoquina resistente: no hay halo de inhibición.

Nota:
-Si se presenta un halo menor a 14 mm (9 – 14 mm) se debe realizar la prueba de solubilidad en bilis para
confirmar la especie.
-Es importante tener en cuenta que para el crecimiento de S. pneumoniae es necesario proveer atmósfera de
5% de CO2, por ende, la prueba de la Optoquina y otras utilizadas en la identificacióndel neumococo se
realizan proporcionando este requerimiento.
 B. Prueba de solubilidad en bilis: esta prueba mide la capacidad de las células bacterianas desufrir un
proceso de lisis en presencia de sales biliares en un tiempo y a una temperatura específica. Permite
la diferenciación entre S. pneumoniae soluble en bilis y otras especies de Streptococcus α-
hemolíticos insolubles. Para esta prueba se utilizan comúnmente las sales biliares: desoxicolato de
sodio (10%) o taurocolato de sodio.
Procedimiento:
1. Tomar una colonia aislada de la cepa a evaluar con el asa recta e inocular dos tubos concaldo
Mueller-Hinton.
2. Incubar a 35°C por 18-24 horas en atmósfera de 5% de CO2.
3. Luego de la incubación y con los medios turbios, adicionar 0,5 ml de desoxicolato desodio al
10% a un tubo y 0.5 ml de solución salina al tubo control.
4. Incubar de 35-37°C por dos horas en incubadora o baño maría.

Resultados:
Positivo: se presenta aclaramiento de la turbidez en el tubo de la muestra con desoxicolato de sodio y no en el
tubo control. El microorganismo es soluble en bilis lo que indica identificación de S. pneumoniae.
Negativo: no hay aclaramiento en el tubo de la muestra con desoxicolato de sodio, indicando que es un
Streptococcus del grupo viridans

Pruebas para identificación de Streptococcus del grupo D y Enterococcus.

A. Prueba de bilis esculina: se basa en la capacidad de algunas especies

como los Streptococcus del grupo D y Enterococcus para hidrolizar
esculina en presencia de bilis (1% al 4%), produciendo glucosa y
esculetina. La esculetina reaccionan con las sales de hierro presentes en
el medio para formar un complejo fenólico de color café/negro6.

Procedimiento:
1. Tomar una colonia aislada del microorganismo a evaluar con asa
recta.
2. Sembrar en medio agar bilis esculina por agotamiento en medio
servido en caja o en el pico de flauta del medio en tubo. Prueba de bilis esculina positiva.
3. Incubar a 35°C de 24 – 48 horas. Tomado de:
https://cutt.ly/MNxUu6o

Resultado:
Positivo: se observa ennegrecimiento difuso en el pico del agar (tubo) o un halo marrón o negro alrededor
de la colonia en la prueba realizada en caja. Aislamiento presuntivo de Streptococcus del grupo D y
Enterococcus.
Negativo: no hay cambio de color.

B. Prueba de tolerancia al cloruro de sodio al 6.5%: permite la diferenciación entre los Streptococcus
del grupo D y los Enterococcus, ya que los últimos crecen en medios con altocontenido de sal.

Procedimiento:
1. Tomar una colonia del aislamiento a evaluar con asa recta e inocular un medio BHI salino(6.5%
NaCl).
2. Incubar a 35°C de 24-48 horas.
 Resultados:
Positivo: crecimiento en el medio que se evidencia por turbidez.
Negativo: no hay crecimiento.

C. Prueba de hidrólisis de pirrolidonil-β-naftilamida (PYR): en esta prueba se detecta la presencia

de la enzima L-pirrilidonil arilamidasa o pirrolidonasa. Sirve para diferenciar Streptococcus del grupo A
y D, que hidrolizan el sustrato PYR, de cualquier otro estreptococo.Se utiliza un agar como tripticasa de
soya o caldo de enriquecimiento suplementado con elsustrato PYR al 0,01%6.
Procedimiento:
1. Inocular 3 ml de caldo BHI suplementado con PYR al 0,01% con las colonias a evaluar.
2. Incubar 18-24 horas 35°C en aerobiosis.
3. Revelar con reactivo p-dimetilaminocinamaldehído (cianamaldehído).

Resultados:
Positivo: desarrollo de un color rojo alrededor del crecimiento al agregar el reactivo p-
dimetilaminocinamaldehído.
Negativo: no hay cambio de color al agregar el reactivo

D. Reducción del telurito: el crecimiento de aislamientos presuntivos de Enterococcus en medio con

telurito permite diferenciar el Enterococcus faecalis de E. faecium u otrosenterococos. La presencia de
telurito de potasio en el medio inhibe la mayoría de los gérmenes asociados a enterococos y la
diferenciación se basa en la capacidad del microorganismo para reducir el telurito de potasio en teluro.
El teluro producido colorea lascolonias de negro.

Procedimiento:
Para esta prueba se utiliza un agar base suplementado con telurito de potasio al 0,8%.
1. Tomar una colonia con el asa y sembrar por agotamiento en el agar.
2. Incubar a 35°C por 18-24 horas.

Resultados:
Positivo: colonias negras (Enterococcus faecalis)
Negativo: ausencia de colonias o colonias blancas (Enterococcus faecium u otros enterococos)

E. Prueba de motilidad: Permite la identificación presuntiva de la especie Enterococcus

casseliflavus entre otras de su mismo género, debido a su capacidad de desplazamiento.

Procedimiento:
Para esta prueba se emplea el agar motilidad (indol modificado) servido en tubo de ensayo.
1. Tomar una colonia con el asa recta y realizar una punción de aproximadamente 1 cm. Es
importante que sea una punción recta y que no se generen más cortes al medio.
2. Incubar a 35°C por 18-24 horas.

Resultados:
Positivo: Turbidez alrededor de la punción o en todo el tubo.
Negativo: Se observa crecimiento únicamente en la punción.

A. Determinación de la susceptibilidad a antibióticos: permite la determinación del perfil de

susceptibilidad de un microorganismo identificado. Los agentes antimicrobianos utilizadospara las
 pruebas de susceptibilidad han sido agrupados según el CLSI* en grupo A:evaluación primaria y
reporte, grupo B: evaluación primaria opcional y reporte de forma selectiva, grupo C:
suplementarios reporte de forma selectiva y grupo U: suplementarios solo para aislamiento de
orina7. Aquellos antibióticos que hacen parte del grupo A y B, sonen general, los utilizados en las
pruebas de susceptibilidad realizadas de rutina en el laboratorio.

*
CLSI, Clinical and Laboratory Standards Institute.
La susceptibilidad puede ser evaluada utilizando el método de difusión de disco (método Kirby-Bauer
o difusión en agar), al menos que se indique la necesidad de determinar la concentración mínima
inhibitoria (CMI) para un antimicrobiano (Revisado en referencia 7).

Antibióticos usados en pruebas de sensibilidad para Streptococcus spp. β-hemolíticos:Grupo

A: clindamicina, eritromicina, penicilina o ampicilina.
Grupo B: cefepime o cefotaxima o ceftriaxona; vancomicina.
Grupo C: ceftarolina, cloranfenicol, daptomicina, levofloxacina, linezolid, tedizolid.

Antibióticos usados en pruebas de sensibilidad para Streptococcus pneumoniae:

Grupo A: eritromicina, penicilina (evaluada con disco de oxacilina), SXT.
Grupo B: cefepime, cefotaxima, ceftriaxona, clindamicina, doxiciclina, levofloxacina, moxifloxacina,
meropenem, tetraciclina, vancomicina.
Grupo C: amoxicilina, amoxicilina-clavulanato, ceftarolina, cloranfenicol, linezolid, rifampicina.

Antibióticos usados en pruebas de sensibilidad para Streptococcus spp. Grupo viridans:Grupo

A: ampicilina y penicilina.
Grupo B: cefepime, cefotaxima, ceftriaxona, vancomicina.
Grupo C: ceftolozano-tazobactam, cloranfenicol, clindamicina, eritromicina, linezolid.

Antibióticos usados en pruebas de sensibilidad para Enterococcus spp.:Grupo

A: ampicilina y penicilina.
Grupo B: daptomicina, linezolid, tedizolid, vancomicina.Grupo C:
gentamicina, estreptomicina.
Grupo U: ciprofloxacina, levofloxacina, fosfomicina, nitrofurantoina, tetraciclina.

Procedimiento:
1. Suspender varias colonias en un caldo Mueller-Hinton suplementado con sangre lisada (2.5-5%) y
llevar a una turbidez de 0.5 escala Mcfarland.
2. Tomar un hisopo estéril de algodón y humedecerlo en el caldo Mueller-Hinton crecido a 0.5
Mcfarland.
3. Sembrar en un medio Mueller-Hinton con 5% de sangre usando el hisopo de algodón
humedecido realizando siembra masiva en tres direcciones.
4. Poner los sensidiscos.
5. Incubar a 35°C con atmosfera de CO2 cuando sea pertinente.
 6. Medir los halos de inhibición.

Nota: revise el último reporte del CLSI-

2019 que contiene los parámetros
aceptados para definirresistencia o
sensibilidad a los antibióticos evaluados.
BIBLIOGRAFÍA

1. Murray, P., Rosenthal, K. y Pfaller, M. (2014). Microbiología médica. Barcelona: Elsevier.

Edición 8, capítulo 19.
2. Ryan, K., Ray, C. y Sherris, J. (2017). Microbiología médica Sherris. Nueva York: McGraw
Hill Medical. Edición 6, capítulo 25.
3. Carroll, K., Morse, S., Mietzner, S., Miller, S. (2016). Microbiología médica. Edición 27,
capítulo 14
4. Elliot, S.D. and Tai, J.Y. (1978). The Type-Specific Polysaccharides of Streptococcus suis. J.
Exp. Med.,148, 1699.
5. Facklam R. (2002). What Happened to the Streptococci: Overview of Taxonomic and
Nomenclature Changes. Clinical Microbiology Reviews. p. 613–630 Vol. 15, No. 4
6. MacFaddin J.F. (2003). Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia
clínica. 3era Edición. Médica Panamericana. Capítulo 1, 2, 4, 37; pag 73-90.
7. CLSI, (2019). M100: Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. Edición
29.