DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA

INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

ENZIMOLOGÍA

Monografía

TEMA:

PURIFICACIÓN E INMOVILIZACIÓN ENZIMÁTICA

GRUPO:

ANGIE CAROLINA REYES PAREDES

MARIA EMILIA ROCA ROJAS

GABRIELA NIKOLE RODRIGUEZ RODRIGUEZ

Docente: Rodrigo Ávalos

NRC: 5273

SANGOLQUÍ - 2021-2021
ÍNDICE

TÍTULO 3

OBJETIVOS 3

INTRODUCCIÓN 3
JUSTIFICACIÓN 4

MARCO TEÓRICO 4

MÉTODOS DE PURIFICACIÓN 4
Métodos por su tamaño 4
Centrifugación 4
Centrifugación diferencial 5
Centrifugación por zona de velocidad 5
Diálisis 5
Ultrafiltración 5
Métodos por su carga 6
Electroforesis 6
Electroforesis de frente móvil 6
Electroforesis de zona 7
Electroforesis enfoque isoeléctrico 7
Electroforesis SDS-PAGE 7
Electroforesis bidimensional 8
Métodos por su solubilidad 8
Precipitación por punto isoeléctrico (pH) 8
Precipitación por salado o “salting out” 9
Precipitación con solventes 9
Métodos cromatográficos 10
Cromatografía de afinidad 10
Cromatografía de pseudoafinidad 10
Cromatografía de interacción hidrofóbica 11
Cromatografía por intercambio iónico 11
Cromatografía de exclusión molecular o de filtración en gel 12
Cromatografía de fase reversa 12
Cromatografía líquida de alta eficiencia 12
Otros métodos 13
Concentración por precipitación 13
Ventajas y desventajas de la purificación de enzimas 13

INMOVILIZACIÓN 14
Métodos de retención física 14

1
 Atrapamiento 14
En capas 14
Inclusión en membranas 15
Encapsulación 15
Métodos de unión química 15
Unión a soportes 15
Unión covalente 16
Absorción iónica 16
Reticulado 17

APLICACIONES 17

CONCLUSIONES 19

BIBLIOGRAFÍA 20

ANEXOS 22

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 I. TÍTULO

II. OBJETIVOS

Objetivo General

Investigar y comprender los métodos tanto de purificación como de inmovilización

enzimática.

Objetivos Específicos

● Analizar el principio y funcionamiento de los distintos métodos de purificación

y de inmovilización enzimática.
● Establecer las ventajas y desventajas de cada método.
● Indicar las distintas aplicaciones de los métodos de purificación e
inmovilización enzimática.

III. INTRODUCCIÓN

A sido notorio como a aumentado cada vés la demanda de el uso enzimatico en

campos como la medicina, el medio ambiente, la industria alimentaria y de bebidas,,
productos de limpieza, ropa, productos de papel, combustibles para el transporte,
productos farmacéuticos, dispositivos de control, generación de productos y procesos
biotecnológico. Sin embargo sólo una cantidad mínima de ellas a sido usada de
manera industrial (Mayolo-Deloisa et al., 2012).

Dentro de la naturaleza las macromoléculas biológicas más importantes son las

enzimas, Una de las muchas ventajas de las enzimas es que contrario a un catalizador
químico que se usaban de forma tradicional en la industria estas trabajan con una
mayor especificidad (Spencer & Jordan, 1992).

Las enzimas se caracterizan por la presencia de un sitio activo en el cual el sustrato

se une y se metaboliza para producir el producto. Esta interacción del sustrato con la
enzima reduce la energía de activación de la reacción, formando un estado de
transición estabilizado y acelerando la formación de producto. Las enzimas tienen una
alta especificidad para catalizar reacciones ya que tienen selectividad quimio es decir
de grupo funcional, regio o posicional y estereo que está relacionado con la quiralidad
(Shivcharan & Ipsita, 2018).

Esta selectividad se da en un producto libre de impurezas ya que se minimiza la

formación de subproductos, reduce el costo del producto y el número de pasos
involucrados en el proceso, es por ello que a pesar de que las enzimas funcionan
dentro de la naturaleza con normalidad, es requerido de varios procesos adicionales
para usarlo de manera artificial o a nivel industriales ya que la presencia de impurezas,
hace necesario el protocolo de purificación para separar los contaminantes asociados
con la preparación de la enzima cruda (Shivcharan & Ipsita, 2018).

Las enzimas están optimizadas para funcionar en condiciones fisiológicas y cambios

en estas condiciones causa que su actividad y estabilidad se vean comprometidas

3
 La inmovilización es la reducción de la movilidad de una proteína o una célula, lo que
disminuye la flexibilidad de la conformación nativa, aumenta la rigidez y estabiliza la
proteína al ralentizar las reacciones de desactivación. Esta tiene varias ventajas como
alta estabilidad, resistencia al esfuerzo cortante, reutilización de biocatalizadores,
velocidad de reacción más rápida debido a la alta concentración de catalizador, entre
otros. Se conoce que en su mayoría las enzimas tienen una estabilidad más alta luego
de la inmovilización pero una menor actividad. (Anders & Jinek, 2014).

JUSTIFICACIÓN

Es conocido a las enzimas por su amplio campo de aplicabilidad dentro de la industria,

además el uso de enzimas reduce el tiempo de fabricación en un 80% y el coste de
las materias primas en un 99% y tiene beneficios medioambientales. Las enzimas son
usadas debido a su especificidad, la misma que proporciona eficiencia al proceso,
por lo cual es indispensable que la enzima tenga la menor cantidad de impurezas, es
por ello que es de suma importancia una buena purificación además los procesos de
inmovilización ayudan a dichas enzimas a mantener su estabilidad además

IV. MARCO TEÓRICO

V. MÉTODOS DE PURIFICACIÓN
Las enzimas se purifican mediante procedimientos de fraccionamiento. En una serie
de etapas independientes, se aprovechan las diversas propiedades fisicoquímicas de
las enzimas que interesan para separarlas progresivamente de otras proteínas y/o de
las demás sustancias. Las características de las enzimas que se emplean en los
diversos procedimientos de separación son: solubilidad, carga iónica, tamaño
molecular, propiedades de absorción y capacidad de unión a otras moléculas
biológicas (Voet & Voet, 1992).

A. Métodos por su tamaño

Centrifugación
La centrifugación es un método por el cual se pueden separar sólidos de líquidos de
diferente densidad mediante una fuerza centrífuga. La fuerza centrífuga es provista
por una máquina llamada centrifugadora, la cual imprime a la mezcla un movimiento
de rotación que origina una fuerza que produce la sedimentación de los sólidos o de
las partículas de mayor densidad (Peña & Purizaca, 2016).
Los componentes más densos de la mezcla se desplazan fuera del eje de rotación de
la centrífuga, mientras que los componentes menos densos de la mezcla se desplazan
hacia el eje de rotación. De esta manera los químicos y biólogos pueden aumentar la
fuerza de gravedad efectiva en un tubo de ensayo para producir una precipitación del
sedimento en la base del tubo de ensayo de manera más rápida y completa (Peña &
Purizaca, 2016).

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 ● Centrifugación diferencial
Se basa en la diferencia en la velocidad de sedimentación de las moléculas.
Esta diferencia debe ser grande para que sea observada al centrifugar. Las
partículas que posean densidades similares se sedimentarán juntas. Este
método es inespecífico, por lo que se usa como centrifugación preparativa para
separar componentes en la mezcla (por ejemplo, para separar mitocondrias de
núcleos y membrana) pero no es útil para separar moléculas (Muñoz et al.,
2009).

● Centrifugación por zona de velocidad

Las partículas se separan por la diferencia en la velocidad de sedimentación a
causa de la diferencia de masa de cada una. La muestra se coloca encima de
un gradiente de densidad preformado. Por la fuerza centrífuga las partículas
sedimentan a distinta velocidad a través del gradiente de densidad según su
masa. Se debe tener en cuenta el tiempo de centrifugación ya que si se
excede, todas las moléculas podrían sedimentar en el fondo del tubo de
ensayo (Muñoz et al., 2009).

Diálisis
La diálisis es una forma de filtración molecular. Es un proceso que separa moléculas
de acuerdo con su tamaño, mediante el empleo de membranas semipermeables que
contienen poros de dimensiones inferiores a las macromoleculares. Estos poros
permiten que moléculas pequeñas, tales como las de los disolventes, sales y
metabolitos pequeños, se difundan a través de la membrana pero bloqueen el tránsito
de moléculas mayores (Amorós et al., 2013).
Se emplea rutinariamente para cambiar el disolvente en el que se encuentran
disueltas las macromoléculas. Una disolución macromolecular se introduce en el saco
de diálisis, que se sumerge en un volumen relativamente grande de disolvente nuevo.
Las moléculas pequeñas pasan a través de la membrana al fluido externo hasta que
se alcanza el equilibrio, las macromoléculas permanecerán en el interior de saco de
diálisis. El proceso puede repetirse varias veces a fin de sustituir completamente un
sistema disolvente por otro (Amorós et al., 2013).

Ultrafiltración
En la ultrafiltración, el agua y otras pequeñas moléculas son pasadas a través de una
membrana semi-permeable mediante una fuerza transmembranal tal como la
centrifugación o las altas presiones (Harris y Angal, 1995). La superficie de estas
membranas contienen poros de diámetros lo suficientemente pequeños como para
distinguir los tamaños y formas de las moléculas disueltas; aquellas por encima de un
rango de tamaño determinado son retenidas, mientras que aquellas por debajo de
dicho rango pasan a través de la membrana junto con el flujo de solvente permeado
(Schratter, 1996).
Las membranas para ultrafiltración son caracterizadas de acuerdo al peso molecular
de los solutos a retener: el peso molecular de corte de la membrana (MWCO –
molecular weight cutoff–) es el parámetro de operación más mencionado en la teoría
de ultrafiltración y se define como el peso molecular de solutos globulares hipotéticos

5
 (proteínas) que serán en un 90% retenidos por la membrana en cuestión (Harris y
Angal, 1995).
Sin embargo, puesto que la relación retenido:permeado no es sólo una función del
tamaño físico sino también de la forma y características eléctricas de la molécula, el
MWCO no pasa de ser un indicador que se encuentra basado en solutos modelo.
Moléculas lineales como polisacáridos tenderán a ser permeados por la misma
membrana que retendrá moléculas globulares del mismo peso molecular, razón por la
cual se plantea como regla escoger una membrana cuyo MWCO sea alrededor de la
mitad del valor del peso molecular de la proteína a concentrar, de manera tal que se
genere un balance entre altas recuperaciones de proteína y mínimos tiempos de
filtración (Schratter, 1996).
El tamaño de poro en membranas de ultrafiltración es considerablemente más
pequeño que en las membranas de microfiltración, y el área de poro por unidad de
superficie también es menor. Como consecuencia, el flujo que se maneja en una
membrana de ultrafiltración es generalmente mucho más pequeño que el de las
membranas de microfiltración (Weatherley, 1994). Los diámetros de poro para
ultrafiltración se encuentran entre 1 y 20 nm (Harris y Angal, 1995).

B. Métodos por su carga

Electroforesis
La electroforesis es un método analítico de alto poder resolutivo que permite la
separación de moléculas biológicas cargadas por la combinación de su migración en
un campo eléctrico y el efecto de tamizado molecular a través de un gel de corrida.
Las proteínas, al ser moléculas anfotéricas polivalentes, migran en un campo eléctrico
de acuerdo con su carga neta, que a su vez depende de la carga macromolecular, del
tamaño y de la forma, como así también de las propiedades fisicoquímicas del medio
electroforético (Makowski & Ramsby,1997).
La incorporación del detergente SDS a la solución proteica permite separar todos los
tipos de proteínas, incluyendo las insolubles en agua. El SDS se une a las regiones
hidrofóbicas de las moléculas proteicas haciendo que se desplieguen las cadenas
polipeptídicas, liberándolas de sus asociaciones con otras moléculas proteicas o
lipídicas. En estas condiciones la electroforesis separa los polipéptidos en función de
su tamaño, lo que proporciona información sobre su peso molecular. Además, el
agregado de un agente reductor como el β-mercaptoetanol reduce los enlaces
disulfuro que pudieran existir en las proteínas, de modo que se pueden visualizar
todos los polipéptidos constitutivos de las moléculas poliméricas (Voet & Voet, 1992)

● Electroforesis de frente móvil

El campo eléctrico se aplica a disoluciones o suspensiones. Históricamente,
es el origen de la electroforesis tal y como hoy la conocemos. Actualmente
está en desuso, ya que al ser un fluido el medio en el que se desarrolla. Las
diferentes proteínas se desplazan a velocidades diferentes según sus cargas
y coeficientes de fricción respectivos, formándose nubes que se van
desplazando en la disolución tampón y que puede seguirse con diversos

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 sistemas ópticos, poniéndose de manifiesto las sustancias que se van
separando tiene poco poder de resolución (Rincón, 2011).

● Electroforesis de zona
La muestra se desplaza sobre un soporte sólido (Rincón, 2011).
Fuente de alimentación: Proporciona el campo eléctrico mediante los
dos electrodos, estableciendo una diferencia de potencial (Rincón,
2011).
Cubeta: Recipiente en cuyos extremos se sitúan los electrodos
(Rincón, 2011).
Soporte electroforético: Es el elemento fundamental. Debe ser inerte.
La pequeña cantidad necesaria de muestra permite que las moléculas
migren en discretas zonas o bandas (Rincón, 2011) .

● Electroforesis enfoque isoeléctrico

Se trata de una variante de electroforesis en la que el gel de poliacrilamida,
posee un gradiente de pH fijado en su estructura. Esto se consigue incluyendo
en su preparación moléculas ionizables con valores de pK diferentes. Como
consecuencia, al avanzar los componentes de la muestra a lo largo del gel se
encuentran en entornos de pH diferente, y eventualmente alcanzan una región
en la cual el pH local es igual al punto isoeléctrico de la molécula muestra y,
en consecuencia, ésta detiene su avance. Se alcanza, pues, un equilibrio y se
consigue la separación de los componentes de la muestra de acuerdo con su
punto isoeléctrico, que además se puede medir, pues se conoce la geometría
del gradiente de pH fijado al gel (Universidad de Alcalá, 2015).

● Electroforesis SDS-PAGE
En este tipo de electroforesis utilizamos dodecil sulfato de sodio (SDS), que es
un detergente usado en muchas preparaciones bioquímicas dado que se une
con firmeza a las proteínas y las hace asumir una estructura desordenada de
manera de obtener una eficiente desnaturalización (Arizmendi, et al., 2018).
La electroforesis de proteínas en un gel de poliacrilamida con SDS (SDS-
PAGE) separa a las macromoléculas en el orden de sus masas moleculares
por los efectos de filtración por geles. Este tipo de electroforesis es una
variante de la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) donde los geles
se forman por polimerización de la acrilamida y la N,N’-metilen bisacrilamida
inducida por radicales
libres en un buffer. Las proteínas unen SDS en una proporción bastante
uniforme de alrededor de 1,4g del detergente por gramo de proteína (que
equivale a 1 molécula de SDS cada 2 residuos aminoacídicos
aproximadamente). La carga otorgada por el SDS enmascara a las cargas
proteicas intrínsecas de forma que las proteínas tratadas con SDS tienden a
presentar relaciones carga/masa casi idénticas y formas similares
(desplegadas) (Arizmendi, et al., 2018).
Es por esto que la separación ocurre por efecto de filtración de geles en función
del MW (separación por tamaño o largo de la cadena polipeptídica). Las masas
moleculares de las proteínas se determinan con una precisión del 5-10 % con

7
 esta técnica, y las movilidades relativas de las proteínas varían en forma lineal
con el logaritmo de sus masas moleculares. Algunas proteínas están formadas
por más de una cadena polipeptídica; al tratarla con SDS se rompen las
interacciones no covalentes entre estas subunidades. De esta manera el SDS-
PAGE nos permite obtener masas moleculares de las subunidades de la
proteína en vez de la proteína intacta. Distinto es el caso cuando tenemos
subunidades unidas por puentes disulfuro. En este último caso, para separar
las subunidades se agrega mercaptoetanol a los geles SDS-PAGE de manera
de escindir los puentes di-sulfuro por reducción (Arizmendi, et al., 2018).

● Electroforesis bidimensional
Es una técnica de alta resolución cuyo objetivo es la separación de mezclas
de proteínas altamente complejas. La base de su elevado poder de resolución
está precisamente en la bidimensionalidad, es decir, en que las proteínas son
separadas secuencialmente por dos criterios físicos. En primer lugar las
proteínas son separadas en un gel con gradiente de pH en condiciones
desnaturalizantes de acuerdo con su punto isoeléctrico (isoelectroenfoque).
Tras esta separación por carga las proteínas son separadas de acuerdo con
su masa molecular por electroforesis discontinua en gel de poliacrilamida en
presencia de SDS (SDS-PAGE). Tras la tinción del gel las proteínas aparecen
formando manchas circulares (spots)(Ramos, 2014).

C. Métodos por su solubilidad

Las diferencias en comportamientos de solubilidad han sido usadas por más de 50
años para la separación de proteínas (Weatherley, 1994). Actualmente, la
precipitación es usualmente utilizada como un paso de separación durante las
primeras etapas de un proceso de purificación, y normalmente es seguida por otro tipo
de separaciones, como la cromatografía. La precipitación puede ser utilizada también
como método de concentración de proteínas como paso previo a un proceso de
purificación (Harris y Angal, 1995).
La precipitación de proteínas es obtenida por la adición de sales, inducida por el
cambio de pH o potencial iónico, o por adición de solventes -ya sean orgánicos, inertes
o polímeros. Los precipitados pueden ser recuperados por filtración o centrifugación,
por lavado o por resuspensión en un buffer adecuado (Harris y Angal, 1995).

● Precipitación por punto isoeléctrico (pH)

Uno de los métodos más fáciles para la precipitación de proteínas se lleva a
cabo ajustando el pH de la solución a uno cercano o igual al punto isoeléctrico
de la proteína de interés; este proceso es llamado también precipitación
isoeléctrica. La superficie de las proteínas está cubierta por grupos cargados
positiva y negativamente; cuando está
cargada negativamente, se dice que está por encima del punto isoeléctrico, y
de manera contraria, cuando la superficie está cargada positivamente, la
proteína se encuentra por debajo del punto isoeléctrico (Harrison et al, 2003).

8
 En ambos casos, las moléculas cargadas de manera igual a la superficie son
repelidas por la proteína. Sin embargo, cuando se alcanza el punto
isoeléctrico, las cargas positivas y negativas presentes en la superficie se
neutralizan unas con otras y la repulsión
electrostática con otras moléculas no ocurre, dando lugar a la atracción entre
las moléculas de proteína disueltas y formando así un precipitado (Harris y
Angal, 1995). Es importante tener en cuenta que valores extremos de pH
pueden favorecer la desnaturalización de la proteína.

● Precipitación por salado o “salting out”

La precipitación por adición de sales neutras tiene sus orígenes en 1859,
cuando Denis realizó un trabajo para la separación de proteínas de la sangre
(Weatherley, 1994). La proteína no es desnaturalizada y la actividad
enzimática es recuperada mediante la resuspensión del pellet; adicionalmente,
las sales pueden estabilizar las proteínas contra la desnaturalización, la
proteólisis o la contaminación bacteriana, características que hacen de este
método una alternativa fácil y confiable para la separación de proteínas (Harris
y Angal, 1995).
La causa de la precipitación por salado difiere a la causada por el ajuste del
pH, lo que lleva a que estas técnicas sean usadas una tras otra con el fin de
maximizar la purificación de las proteínas deseadas. El salting-out depende de
la naturaleza hidrofóbica de la superficie de la proteína. Los grupos
hidrofóbicos predominan en el interior de ésta,
pero algunos se localizan en diferentes regiones de la superficie; el agua es
puesta en contacto con la superficie, haciendo que estas regiones no queden
expuestas; cuando la sal es agregada, el agua solvata los iones de la sal, y
mientras la concentración de sal se incrementa, el agua es removida de los
alrededores de la proteína, eventualmente exponiendo las regiones
hidrofóbicas. Dichas regiones en las proteínas pueden interactuar mutuamente
o con las de otras moléculas, resultando en una aglomeración. De esta forma
las proteínas con regiones hidrofóbicas más abundantes formarán agregados
y se precipitarán más rápidamente que aquellas con pocas regiones resultando
un fraccionamiento (Harris y Angal, 1995).

● Precipitación con solventes

Es la precipitación de una proteína por la adición de un solvente orgánico como
etanol o acetona, a una solución acuosa de proteínas, produciendo agregados
de moléculas proteicas que tienden a precipitar. Esto se debe a que el solvente
presenta una constante dieléctrica menor que la del agua, lo que produce un
incremento de las fuerzas de atracción entre cargas opuestas y una
disminución del grado de ionización de los radicales de la proteína, en
consecuencia una disminución en la solubilidad de esta (Muñoz et al., 2009).

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D. Métodos cromatográficos
La fase móvil de una cromatografía consiste en una mezcla de sustancias que se van
a fraccionar disueltas en un líquido, que se hace fluir a través de una columna de una
matriz porosa, que constituye la fase estacionaria. Las interacciones de los solutos
individuales con la fase estacionaria determinan que cada componente migre con
velocidades diferentes y que la mezcla se separe en bandas de sustancias puras. Los
diversos métodos cromatográficos surgen de la interacción dominante entre la fase
estacionaria y las sustancias que están siendo separadas y son: cromatografía de
intercambio iónico, de adsorción, de exclusión molecular, de interacción hidrofóbica o
de afinidad (Voet & Voet, 1992).

Cromatografía de afinidad
La cromatografía de afinidad separa las proteínas (analitos) en función de su
especificidad de fijación de ligandos. Los ligandos de afinidad son moléculas
poliméricas que sirven de soporte porque están unidas covalentemente sobre la
columna cromatográfica o matriz inerte que debe de tener una estructura de poro
abierta y estabilidad en condiciones de cambio de pH, detergentes y agentes
disociantes, para así, retener y adsorber específicamente a las proteínas, la fase
estacionaria es sólida. Estos ligandos se clasifican según su naturaleza química o su
selectividad para la retención de analitos, esta última se clasifica en ligandos
específicos (anticuerpos) y generales (como las lecitinas). Cuando las proteínas no
específicas se han lavado a través de la columna, se eluye la proteína ligada con
solución que contiene ligando libre. Después se introduce una nueva fase móvil que
se desactiva, generalmente por el acoplamiento o alteración de los sitios activos
inhibidor-ligando, para que esto pueda ser posible, se necesita un cambio en el pH, la
fuerza iónica o la polaridad, debido a que estas condiciones modifican las
características de los sitios activos, la finalidad de este proceso es hacer fluir a la
proteína para continuar con la regeneración de la columna cromatográfica. La
cromatografía de afinidad tiene la ventaja de ser altamente selectiva para la retención
de proteínas afines a la columna, para ello, emplea sistemas de baja presión,
columnas cortas y un campo restringido para la separación (Universidad Nacional
Autónoma de México, 2007).

Cromatografía de pseudoafinidad
La cromatografía de afinidad es donde un ligando específico se agrega a la fase
sólida, que captura la composición del interés como una proteína específica. La
naturaleza específica de esta acción recíproca significa que la proteína del interés se
puede separar de una mezcla de proteínas. La proteína del interés se puede entonces
liberar posteriormente del ligando cambiando las condiciones de la
cromatografía(Yokoyama, 2019).
En la moda similar, la cromatografía de la pseudo-afinidad utiliza los tintes como los
ligandos para apuntar las proteínas. Los tintes utilizaron al imitador los ligandos, pero
no visualizan alta especificidad. Por lo tanto, estos tintes pueden capturar una
variedad de proteínas (Yokoyama, 2019).
Algunos compuestos como colorantes de antraquinona y colorantes azoicos pueden
usarse como ligandos debido a su afinidad, especialmente por deshidrogenasas,

10
quinasas, transferasas y reductasas. El tipo más conocido de este tipo de
cromatografía es la cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC)
(Coskun, 2016).

Cromatografía de interacción hidrofóbica

La cromatografía de interacción hidrofóbica (Hydrophobic Interaction
Chromatography, HIC) es uno de los métodos de purificación de macromoléculas
biológicas más utilizado, especialmente para proteínas terapeúticas (Lienqueo et al.,
2007; Mahn et al., 2005). Los mecanismos de adsorción en el cual están basados las
interacciones hidrofóbicas de las moléculas con la fase estacionaria fueron
primeramente demostradas por Tiselius en 1940 (Porath, 1987).

La HIC explota la interacción reversible entre la superficie hidrofóbica de una proteína

y una matriz cromatográfica con un ligando hidrofóbico a moderadamente altas
concentraciones de sal, como el sulfato de amonio. Este tipo de sales tiene alta
polaridad y se unen fuertemente al agua, lo cual induce la exclusión del agua sobre la
proteína y la superficie del ligando lo que promueve las interacciones hidrofóbicas y la
precipitación de la proteína (salting-out) (Lienqueo et al., 2007; Xia et al., 2004).
Las interacciones hidrofóbicas son las fuerzas no covalentes más importantes que
pueden estar relacionadas con diferentes procesos, como la estabilización de la
estructura de las proteínas, la unión de enzimas a un sustrato y el replegamiento de
proteínas. Este tipo de interacción aparece cuando compuestos no polares son
colocados dentro de un ambiente acuoso (Lienqueo et al., 2007; Queiroz et al., 2001).

Cromatografía por intercambio iónico

La cromatografía de intercambio iónico es un método que permite la separación de
moléculas basada en sus propiedades de carga eléctrica. Se compone de dos fases:
la fase estacionaria o intercambiador iónico, y la fase móvil. La fase estacionaria
insoluble lleva en la superficie cargas electrostáticas fijas, que retienen contraiones
móviles que pueden intercambiarse por iones de la fase móvil, la cual suele ser una
disolución acuosa con cantidades moderadas de metanol u otro disolvente orgánico
miscible con agua que contiene especies iónicas generalmente en forma de buffer.
Los iones de ésta compiten con los analitos por los sitios activos de la fase
estacionaria (Álvarez et al., 2018).

El principio básico de la cromatografía de intercambio iónico es que las moléculas

cargadas se adhieren a los intercambiadores de forma reversible de modo que dichas
moléculas pueden ser asociadas o disociadas cambiando el ambiente iónico. La
separación mediante intercambiadores
iónicos se realiza por lo general, en dos fases: en la primera las sustancias a separar
se unen al intercambiador utilizando condiciones que originan una unión fuerte y
estable; a continuación, se eluye de la columna con buffers de diferentes pH o
diferente fuerza iónica, compitiendo los componentes del buffer con el material por los
sitios de unión (Álvarez et al., 2018).

11
Cromatografía de exclusión molecular o de filtración en gel
La cromatografía de exclusión molecular (Size Exclusión Chromatography, SEC) es
el nombre general para los procesos de separación de biomoléculas de acuerdo a su
tamaño cuando una solución fluye a través de una cama empacada con un medio
poroso (Irvine 1997; Kostanski et al., 2004).

Para la separación en SEC, se utilizan las propiedades de tamiz molecular de una

variedad de materiales porosos. El proceso de separación depende del tamaño y el
volumen hidrodinámico (volumen que ocupa una molécula en solución), el cual define
la capacidad de la molécula de penetrar o no en los poros de la fase estacionaria. De
tal forma que, las moléculas de alto peso molecular son excluidas de los poros debido
a un efecto estérico y pasan rápidamente a través de la matriz. En el caso de
biomoléculas pequeñas, estas tienen diferente accesibilidad en las cavidades de la
matriz porosa (Mayolo-Deloisa et al., 2012b).

Cromatografía de fase reversa

La cromatografía de fase reversa (Reversed Phase Chromatography, RPC) describe
un tipo de cromatografía en la cual la fase estacionaria es menos polar que la fase
móvil . La RPC es una técnica de purificación capaz de separar componentes con
características muy similares, como proteínas que difieren en solo un aminoacido e
isomeros conformacionales de péptidos (de Collongue-Poyet et al., 1995; McNay y
Fernandez, 2001). Sin embargo, el valor de la RPC puede estar limitado por diversos
factores, como el uso de solventes y su disposición final así como a los bajos
porcentajes de recuperación debidos a los cambios conformacionales ocasionados
por las interacciones envueltas en el proceso (McNay y Fernandez, 2001; Sokol et al.,
2003).
La asociación de una molécula con la fase estacionaria puede ocurrir tanto por
partición como por adsorción. Los mecanismos de adsorción están basados en la
teoría de Melander y Horvath (Horvath y Melander 1977), que establece que la
retención en RPC surge de la unión de las moléculas en la fase estacionaria y se debe
principalmente al resultado de las interacciones hidrofóbicas entre el soluto y la fase
móvil (Mayolo-Deloisa et al., 2012b).

Cromatografía líquida de alta eficiencia

La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) opera mediante el bombeo de
una mezcla de muestra a alta presión a través de la fase estacionaria de este
procedimiento, la cual es una columna con material de relleno cromatográfico. Para
que esta muestra fluya por la columna, es necesario la presencia de una corriente de
gas en movimiento de helio o nitrógeno. El tiempo de retención de las moléculas
dentro de la columna variará dependiendo de la interacción de estas con la fase
estacionaria, así como del solvente o solventes utilizados (Mayolo-Deloisa et al.,
2012b).
A medida que la muestra pasa por la columna, su interacción entre las dos fases se
da a una velocidad distinta debido a las diferentes polaridades de los analitos. Por lo
tanto, los analitos que tengan una menor interacción con la fase estacionaria o por el

12
 contrario, mayor interacción con la fase móvil, saldrán más rápido de la columna
(Mayolo-Deloisa et al., 2012b).
Esta técnica tiene la capacidad de separar e identificar compuestos que están
presentes en cualquier muestra que se pueda disolver en un líquido en
concentraciones de trazas tan bajas como partes por billón (Linde, 2004).

E. Otros métodos

Concentración por precipitación

Productos biotecnológicos como las enzimas pueden variar con la temperatura, pH,
fuerza iónica y la constante dieléctrica del medio, aprovechando estas propiedades se
utilizan como técnicas de concentración y purificación .La precipitación se basa en
concentrar un producto de una solución convirtiéndolo en sólido mediante la acción
del agente precipitante. Las características que se deben tomar en cuenta son; Los
agentes tomados en cuenta no deben producir la desnaturalización del producto, estos
agentes deben proveer mayor estabilidad del soluto en el precipitado que en la
solución, el equipo que se utiliza es sencillo, es un proceso que se puede utilizar a
escala de laboratorio o industrial, puede realizarse de forma continua. Existen diversos
agentes precipitantes y la mayoría son económicos(Tejeda, Montesinos, & Guzman,
2011).
Las enzimas que poseen mayor número de residuos hidrófobos en su superficie son
menos solubles en soluciones acuosas, por lo contrario, las enzimas que poseen
menos residuos hidrófobos serán más solubles, por lo tanto, en presencia de un
agente precipitante las primeras precipitarán de forma más rápidas que las segundas
(Tejeda, Montesinos, & Guzman, 2011).
Cuando una enzima se mantiene en solución acuosa es porque termodinámicamente
es más conveniente mantenerse rodeado por el solvente que por otras proteínas, es
por esto que cambiar el solvente o la estructura de la proteína insolubilizará la enzima.
La precipitación puede darse utilizando varios principios como la disminución de la
solubilidad, desnaturalización selectiva y por afinidad. (Rojas, 2009).

F. Ventajas y desventajas de la purificación de enzimas

De acuerdo con (Godtfredsen et al., 1985) las ventajas de este proceso son:
● Aumento de la solubilidad de sustratos polares.
● Favorecimiento de reacciones de síntesis frente a la hidrólisis en el
desplazamiento del equilibrio termodinámico.
● Eliminación de reacciones laterales que dependan del agua.
● Fácil recuperación por filtración o centifugación ya que constituyen una fase
diferente del medio.
● Proceso simple porque los productos tiene bajo punto de ebullición
● Mejora la termoestabilidad.
● Eliminación de contaminación microbiana.
● Potencial uso de las enzimas para ser utilizadas directamente en un nuevo
proceso químico.
● Posibilidad de las enzimas de actuar enantioselectivamente sobre sustratos
orgánicos de naturaleza quiral.

13
 ● Alta selectividad respecto al sustrato.

De la misma manera, la purificación de enzimas tiene una serie de inconvenientes como

(Godtfredsen et al., 1985):
● Inactivación fuerte por disolventes orgánicos.
● Inactivación cuando no trabajar en rangos cercanos al pH óptimo y en
disolventes orgánicos este factor es difícil de controlar.
● Inhibición por sustratos y productos hidrofílicos presentes en la reacción.
● Algunos protocolos antes mencionados no son amigables con el ambiente.
● Complejidad elevada del sistema de reacción.

VI. INMOVILIZACIÓN

Es un proceso en el que se confirma o localiza a la enzima en una región definida del

espacio, para dar lugar a formas insolubles que retienen su actividad catalítica y que
pueden ser reutilizadas repetidamente. Posteriormente esta definición se ha ampliado
a aquel proceso por el cual se restringen, completa o parcialmente, los grados de
libertad de movimiento de enzimas, orgánulos, células, etc. por unión a un soporte
(Arroyo, 1998).
Entre las ventajas del uso de enzimas inmovilizadas se puede destacar:
1. El aumento de la estabilidad de la enzima.
2. La posible reutilización del derivado, por lo que disminuyen los costes del
proceso.
3. La posibilidad de diseñar un reactor enzimático de fácil manejo y control,
adaptado a la aplicación de la enzima inmovilizada.
Entre los inconvenientes del proceso están:
1. La alteración de la conformación de la enzima respecto a su estado nativo.
2. La gran heterogeneidad del sistema enzima-soporte donde pueden existir
distintas fracciones de proteínas inmovilizadas con un diferente número de
uniones al soporte.
3. Siempre suele haber una pérdida de actividad de la enzima durante la
movilización.
4. El biocatalizador es más caro que la enzima nativa.
A. Métodos de retención física
● Atrapamiento
Consiste en la retención física de la enzima en las cavidades interiores de una
matriz sólida porosa, constituida generalmente por prepolímeros
fotoentrecruzables o polímeros del tipo poliacrilamida, colágeno, alignato,
carraginato o resinas de poliuretano (Arroyo, 1998).

● En capas
La enzima queda atrapada en el interior de un gel.
● En fibras
La enzima se encuentra ocluida dentro de las microcavidades de una
fibra sintética.

14
 ● Inclusión en membranas
● Encapsulación
En esta técnica, las enzimas están rodeadas de membranas
semipermeables que permiten el paso de moléculas de sustrato y
producto, pero no de enzima. Estas membranas semipermeables pueden
ser permanentes o no permanentes. Las microcápsulas obtenidas son de
forma esférica, con tamaños comprendidos entre 1 y 100 µm de diámetro
(Arroyo, 1998).

● Reactores de membrana
El desarrollo de reactores o sistemas que contengan enzimas atrapadas
ha despertado gran interés en la industria. Estos reactores emplean
membranas permeables al producto final, permeables o no al sustrato
inicial e impermeables a la enzima. Mediante una bomba se establece un
flujo líquido de sustrato que atraviesa el reactor (Arroyo, 1998).
En general, en dicha metodología, se procede inicialmente a la adsorción
de la enzima sobre la membrana que formará el reactor. Esta adsorción se
puede realizar de dos formas:
1. Mediante el paso de una solución tamponada de enzima a través de la
membrana;
2. Por contacto continuo de una solución de enzima con la membrana,

B. Métodos de unión química

● Unión a soportes
La elección del soporte y del tipo de enlace resultan determinantes en el
comportamiento posterior del biocatalizador. Se debe procurar que la
inmovilización incremente la afinidad por el sustrato, disminuya la inhibición,
amplie el intervalo de pH óptimo y reduzca las posibles contaminaciones
microbianas. Además el soporte debe tener resistencia mecánica adecuada a las
condiciones de operación del reactor y ser fácilmente separable del medio líquido
para que pueda ser reutilizado (Arroyo, 1998).
Los soportes pueden clasificarse en dos grandes grupos:
Soportes inorgánicos: Dentro de este grupo tenemos una gran variedad de
soportes, que pueden ser naturales (arcillas como la bentonita, piedra pómez,
sílice, etc.) o materiales manufacturados (óxidos de metales y vidrio de tamaño
de poro controlado, vidrio no poroso, alúmina, cerámicas, gel de sílice, etc)
(Arroyo, 1998).
Soportes orgánicos, a su vez se clasifican en:
● Polímeros naturales: a su vez divididos en: polisacáridos (celulosa, almidón,
dextranos, agar-agar, agarosa, alginatos, quitina, chitosan, etc). proteínas
fibrosas (colágeno, queratina, etc).
● Polímeros sintéticos: divididos en:
Poliolefinas (como el poliestireno)
Polímeros acrílicos (poliacrilatos, poliacrilamidas, polimetacrilatos, etc.)
Otros tipos (alcohol polivinílico, poliamidas, etc).
Las enzimas se pueden unir a estos soportes mediante adsorción o por unión
covalente

15
● Unión covalente
La unión covalente de una enzima a un soporte es quizá el método de
inmovilización más interesante desde el punto de vista industrial. La
metodología de la unión covalente se basa en la activación de grupos
químicos del soporte para que reaccionen con nucleófilos de las
proteínas. De entre los 20 aminoácidos diferentes que se encuentran
en la estructura de las enzimas, los más empleados para la formación
de enlaces con el soporte son principalmente la lisina, la cisteína, la
tirosina y la histidina, y en menor medida la metionina, el triptófano, la
arginina y el ácido aspártico y glutámico. El resto de aminoácidos,
debido a su carácter hidrófobo, no se encuentran expuestos hacia el
exterior de la superficie proteica, y no pueden intervenir en la unión
covalente (Arroyo, 1998).
Este método presenta las siguientes ventajas:
1. La manipulación de los derivados inmovilizados es sencilla;
2. La carga de enzima permanece constante después de la
inmovilización;
3. Los derivados pueden utilizarse en reactores en continuo,
empaquetados, de lecho fluidizado o tanque agitado.
4. Una mayor resistencia a la desactivación por el efecto de la
temperatura, de los disolventes orgánicos o del pH, al tener
estabilizada su estructura terciaria

En cambio la inmovilización por enlace covalente también presenta una

serie de inconvenientes:
1. Es necesario conocer la densidad de grupos activos por unidad
de superficie, ya que condiciona el número de uniones enzima-
soporte y su geometría, que puede ser distorsionante y conducir
a derivados inactivos.
2. El proceso de inmovilización puede alterar la estructura del
centro activo. Para evitar esta posible alteración, se realiza la
inmovilización en presencia de un inhibidor que bloquee el
centro activo.
3. La inmovilización covalente no es aconsejable en aquellas
enzimas muy sensibles a cambios de pH, fuerza iónica, etc.
● Adsorción iónica
En la adsorción, la enzima se une a un soporte sin funcionalizar
mediante interacciones iónicas, fuerzas de Van der Waals y por
puentes de hidrógeno (Arroyo, 1998).
Los principales factores que influyen en la adsorción, son:
1. El pH del medio: controla el número y la naturaleza de las
cargas que presenta la superficie de la proteína y del sólido;
2. La fuerza iónica: al aumentar la fuerza iónica se produce la
desorción de la enzima, ya que los iones inorgánicos se unen
con más fuerza al soporte que la proteína;
3. El diámetro de poro: debe ser aproximadamente dos veces el
tamaño del eje mayor de la enzima;
4. La presencia de iones que actúen como cofactores de la
enzima, ya que pueden incrementar la carga enzimática del
derivado.
Como principales ventajas de este método destacan:

16
 1. Su preparación sencilla,
2. Su bajo coste,
3. No hay cambios de especificidad enzimática,
4. Los derivados son estables en medios de trabajo con bajo
contenido en agua.

Los inconvenientes de la adsorción son principalmente:

1. La optimización de las variables que controlan la adsorción,
2. Los derivados obtenidos son poco estables desde el punto de
vista mecánico,
3. La unión al soporte es débil.

Una variante dentro de la técnica de la adsorción consiste en emplear

resinas de intercambio iónico, las cuales contienen grupos funcionales
y contraiones móviles. Estos contraiones se pueden intercambiar
reversiblemente por otros iones de la misma carga, sin que se
produzcan cambios en la matriz insoluble (Arroyo, 1998)).

● Reticulado
También denominado entrecruzamiento o cross-linking, es una técnica que ha
sido ampliamente utilizada en la estabilización de muchas enzimas. El método
del reticulado consiste en uso de reactivos bifuncionales que originan uniones
intermoleculares entre las moléculas de enzima. Como reactivos bifuncionales
se pueden emplear dialdehídos, diiminoésteres, diisocianatos, sales de
bisdiazonio e, incluso, diaminas si están activadas con carbodiimida. El
resultado del reticulado son enzimas con enlaces intermoleculares
irreversibles capaces de resistir condiciones extremas de pH y temperatura.
El co-reticulado, permite eliminar las pérdidas de actividad enzimática
debidas a efectos difusionales, mediante el entrecruzamiento de las enzimas
con una proteína sin actividad enzimática y rica en residuos de lisina (por
ejemplo, la albúmina bovina). Un procedimiento mixto de inmovilización muy
común consiste en inmovilizar la enzima por adsorción sobre una resina de
intercambio iónico o un soporte polimérico (con lo que se consigue una elevada
carga enzimática) y posteriormente añadir el reactivo bifuncional.
Actualmente el método más novedoso de cross-linking consiste en la
cristalización de enzimas y su posterior reticulado con glutaraldehído (Cross-
Linked Enzyme Crystals o CLECs). El aumento de estabilidad se basa en la
obtención de un entramado cristalino, donde las moléculas de enzima están
rodeadas exclusivamente por otras moléculas de proteína. De esta manera la
propia enzima actúa como soporte, y su estructura terciaria está estabilizada
por las uniones covalentes intermoleculares. La estructura cristalina posee
canales microscópicos (20-50Å) que permiten el paso de sustratos hasta el
centro activo de la enzima donde se cataliza la reacción. Estos cristales
pueden soportar temperaturas elevadas y pH extremos, así como la acción de
las proteasas. Esta tecnología se ha aplicado a enzimas muy diferentes, las
cuales se han utilizado en la obtención de compuestos enatioméricamente
puros y en la síntesis de péptidos (Arroyo, 1998).

VII. APLICACIONES

Dentro de la industria tanto los métodos de purificación como inmovilización han sido
ampliamente utilizados.

17
Purificación

La purificación enzimática ha logrado que enzimas como las proteasas que son las más
comunes a nivel industrial, sean aplicadas dentro de la cosmética, o como ingrediente activo
de detergentes y agentes de limpieza. Otra enzima es lipasa que actúa como biocatalizador,
ya que es altamente eficiente en medios acuosos y no acuosos. Estos mencionados son
catalizadores ideales para la biotecnología. ya que hidrolizan de enlaces éster de varios
sustratos no polares con alta actividad, regioselectividad, estereoselectividad y la capacidad
de catalizar la reacción inversa en disolventes no polares hace que las proteasas sean
catalizadores ideales para la biotecnología (Dn & Vk, 2016).

Se ha utilizado la purificación mixta de resinas para capturar la proteína objetivo directamente

de una materia prima de fuerza iónica moderada y evitar la dilución u otras adiciones, incluida
una proteasa extracelular (Dn & Vk, 2016).

Otro de los usos de purificación es el diseño de un método de purificación de anticuerpos

monoclonales a partir de la proteína A (Dn & Vk, 2016).

Otra aplicación destacable es que dada la purificación enzimática de la sintasa F1Fo-ATP

sintasa de I un complejo macromolecular unido a la membrana, responsable de la síntesis de
ATP, la enzima utiliza la fuerza motriz del protón o del sodio para impulsar la síntesis de ATP
(Krasnoselska & Meier, 2018)

Una de las técnicas de purificación es la de cromatografía líquida quien es usada para

detectar cambios conformacionales y de estabilidad en una proteína, en especial a las de
más uso comercial como lo es la insulina humana recombinante.

También es usado en el replegamiento de proteínas recombinantes frecuentemente

expresadas en cuerpos de inclusión que no tienen la actividad biológica deseada, por lo que
tienen que ser replegados para recuperar su actividad (Mayolo-Deloisa et al., 2012a)

Inmovilización
Al hablar de inmovilización se dice que esta es importante en la biocatálisis, de hecho es
usado como herramienta rutinaria en la industria. Esta técnica es económicamente más viable
para estabilizar enzimas para uso industrial(Shivcharan & Ipsita, 2018).
Aplicaciones:
● Se dice que Clinton Corn Processing Company ha estado utilizando glucosa
isomerasa inmovilizada para la producción de jarabe de maíz con alto contenido de
fructosa. Ya que la diferencia de tamaño entre el catalizador inmovilizado en un
intercambiador de iones y el producto (fructosa), causa que la separación sea más
fácil.
● Uso de enzimas inmovilizadas para diseño de biosensores
● Fabricación de tiras reactivas de glucosa, en la cual la glucosa oxidasa inmovilizada
cataliza la reacción cuando hay glucosa presente.
● Otra enzima inmovilizada usada en la industria láctea para la producción de suero y
leche hidrolizada con lactosa, es mediante la β-galactosidasa para personas
intolerantes a la lactosa.
● También es usada la lipasa inmovilizada para la producción de la manteca de cacao.
● Para la producción del ácido 6-aminopenicilánico (6-APA) se usa la enzima penicilina
acilasa inmovilizada.

18
 ● Existen técnicas de inmovilización sin matriz, como los agregados enzimáticos
reticulados, que permiten la separación de enzimas mediante filtración o
centrifugación o el uso de enzimas en disolventes orgánicos.
Otras aplicaciones son (Arroyo, 1998):

● Las enzimas inmovilizadas, son utilizadas para el tratamiento antitumoral, cicatrizante

y terapéutico en general, ya que con más resistente a la acción de las proteasas, un
ejemplo es la L-asparaginasa usada en el tratamiento de leucemias, la tripsina o la
colagenasa quienes eliminan los tejidos muertos de heridas y quemaduras.
● En la industria farmacéutica las enzimas inmovilizadas se usan en la síntesis química
y permite la obtención de productos de gran pureza óptica aplicados en fármacos,
hormonas o antibióticos como los antibióticos ß-lactámicos.
● Es usado para la fármacos ópticamente puros dado que el fármaco dependen de su
estereoquímica un ejemplo es lipasas microbianas inmovilizadas usadas en la
obtención de antiinflamatorios no esteroídicos.
● También se aplican en la Industria Alimentaria permitiendo que las enzimas puedan
ser reutilizadas, un ejemplo son las enzimas proteolíticas empleadas en la
modificación del contenido proteico de los alimentos, en proceso de degradación del
almidón, mediante amilasa, glucoamilasa y glucoisomerasa inmovilizadas para
obtención de jarabes y bebidas como la Coca-Cola o Pepsi.
● Además, las enzimas inmovilizadas permiten la obtención industrial de edulcorantes
alimentarios como el aspartamo, fructooligosacáridos, diversos dipéptidos, etc.
● Y en el Tratamientos de aguas residuales mediante la reducción de nitratos a nitritos
en aguas residuales a partir de enzimas inmovilizadas.

VIII. CONCLUSIONES

● Los métodos de purificación enzimática varían con respecto a su técnica, complejidad

y costos, en general se clasifican en métodos de purificación por solubilidad,
centrifugación, tamaño, cromatografía y electroforesis.
● La cromatografía es un método útil de separación, purificación y análisis de enzimas
y proteínas. Las técnicas cromatográficas pueden llevarse a cabo por diferentes
mecanismos como son: absorción continua, adsorción, partición e intercambio iónico.
● La electroforesis convencional es de gran utilidad; sin embargo, este tipo de
separación electroforética es lenta, laboriosa, con poca reproducibilidad, difícil de
automatizar, y además no proporciona resultados cuantitativos precisos.
● La inmovilización enzimática es un procedimiento que se desarrolla para dar un mejor
uso a las enzimas por la mejora a la estabilidad que proporciona y el aumento de la
productividad.
● Los métodos de inmovilización se dividen en físicos y por unión química, donde los
métodos físicos se pueden realizar por atrapamiento o por inclusión en membranas y
los métodos químicos mediante la unión a soportes y por reticulado, además la unión
covalente es el más interesante desde el punto de vista industrial.
● Tanto la purificación como la inmovilización tienen una amplia aplicación a nivel
industrial, medicinal, siendo parte de varios tratamientos terapéuticos, en el área
alimenticia, incluso en bioremediación.

19
IX. BIBLIOGRAFÍA

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X. ANEXOS
1) ¿Cómo ocurre la centrifugación por zona de velocidad?
Las partículas se separan por la diferencia en la velocidad de sedimentación a
causa de la diferencia de masa de cada una.

2) ¿Cuál es el mecanismo de funcionamiento de los métodos

cromatográficos en la purificación enzimática?
La fase móvil de una cromatografía consiste en una mezcla de sustancias que
se van a fraccionar disueltas en un líquido, que se hace fluir a través de una
columna de una matriz porosa, que constituye la fase estacionaria. Las
interacciones de los solutos individuales con la fase estacionaria determinan
que cada componente migre con velocidades diferentes y que la mezcla se
separe en bandas de sustancias puras.
3) ¿Cuál es una de las desventajas del método unión covalente?
a) La manipulación de los derivados inmovilizados es sencilla
b) Los derivados obtenidos son poco estables desde el punto de vista
mecánico
c) Es necesario conocer la densidad de grupos activos por unidad de
superficie, ya que condiciona el número de uniones enzima-soporte y
su geometría, que puede ser distorsionante y conducir a derivados
inactivos.
d) Siempre suele haber una pérdida de actividad de la enzima durante la
movilización.
Respuesta: c)
4) ¿En qué se dividen los métodos físicos de inmovilización enzimática?
a) Atrapamiento e inclusión en membranas
b) Unión a soportes y reticulado
c) Encapsulación y reactores de membrana
d) Unión a soportes e inclusión en membranas
Respuesta: a)
5) Dentro de las aplicaciones mencionadas subraya una aplicación de la
inmovilización.
a) Diseño de biosensores
b) Tratamiento de aguas residuales
c) a y b son correctas
d) Ninguna de las anteriores
Respuesta: c)

22
 Universidad de las Fuerzas Armadas
- ESPE-
Ingeniería en Biotecnología

Purificación e
inmovilización enzimática
GRUPO 1
Integrantes
Angie Reyes
Maria Emilia Roca
Gabriela Rodriguez

NRC 5273
 Objetivos
General
Investigar y comprender los métodos tanto de
purificación como de inmovilización enzimática.

Específicos
Investigar y comprender los
métodos tanto de purificación Establecer las ventajas y
01 como de inmovilización
02 desventajas de cada método.
enzimática.

Indicar las distintas aplicaciones de los métodos de purificación e

03 inmovilización enzimática.
 Justificación
Es conocido a las enzimas por su amplio campo de aplicabilidad dentro
de la industria, además el uso de enzimas reduce el tiempo de
fabricación en un 80% y el coste de las materias primas en un 99% y
tiene beneficios medioambientales. Las enzimas son usadas debido a su
especificidad, la misma que proporciona eficiencia al proceso, por lo
cual es indispensable que la enzima tenga la menor cantidad de
impurezas, es por ello que es de suma importancia una buena
purificación además los procesos de inmovilización ayudan a dichas
enzimas a mantener su estabilidad además
 Médica INTRODUCCIÓN
Bioremediación Demanda de
uso SELECTIVIDAD
enzimático

Transporte
Industrial Quimio (Grupo funcional)

Especificidad enzimática

Regio ( Posicional)

Estereo ( Quiralidad)
 a u t i l i z a r u n a Introducción
e n ec e s i t a p ar
¿Que s el i n d u s t r i al ?
en z i m a a n i v Tener estabilidad

Alta estabilidad
Debe estar libre de impurezas 01

Minimiza la Reduce el número

Resistencia al
formación de de pasos del
02 esfuerzo cortante
subproductos proceso

Reutilización de
03 biocatalizadores

Purificación Inmovilización
Reducción de la movilidad de una proteína, Alta velocidad por
Separar los contaminantes
disminuye la flexibilidad de la conformación alta concentración
asociados con la preparación de la
nativa, aumenta la rigidez y estabiliza la 04 de catalizador
enzima cruda proteína

Ventajas
Purificación de enzimas

Procedimientos de Etapas
fraccionamiento independientes

Aprovechamiento de
propiedades
fisicoquímicas
Purificación de enzimas Diferencial
Centrifugación
Por zona de velocidad
Por su tamaño
Diálisis
De frente móvil
Ultrafiltración
De zona
Métodos de
Por carga Electroforesis
purificación Enfoque isoeléctrico

Por solubilidad pH
SDS- PAGE
Otros
salting out
Bidimensional
Concentración solventes
por
precipitación
Por cromatografía Afinidad HIC SEC
HPLC
Pseudoafinidad IIC RPC
 Ventajas Desventajas
Aumento de la solubilidad de sustratos Inactivación fuerte por disolventes
polares. orgánicos.

Favorecimiento de reacciones en el
desplazamiento del equilibrio Inactivación por rangos no cercanos al pH
termodinámico. óptimo

Eliminación de reacciones laterales que Inhibición por sustratos y productos

dependan del agua. hidrofílicos presentes en la reacción

Fácil recuperación por filtración o

centifugación. Algunos protocolos antes mencionados no
son amigables con el ambiente
Bajo punto de ebullición
Mejora la termoestabilidad
Complejidad elevada del sistema de
reacción
Actúa como enantiómeros
Alta selectividad respecto al sustrato
 Inmovilización de enzimas
Permite la mejora Posibilita su empleo
significativa de en la producción
las enzimas industrial

La inmovilización permite superar ciertos

inconvenientes

Es aquel proceso por el cual se restringen,

completa o parcialmente, los grados de libertad
de movimiento de enzimas, orgánulos, células,
etc. por su unión a un soporte.
 Ventajas y Desventajas

VENTAJAS DESVENTAJAS

● La alteración de la
● El aumento de la estabilidad de conformación de la enzima
la enzima. respecto de su estado nativo.
● La posible reutilización del ● Gran heterogeneidad del
derivado. sistema enzima-soporte.
● La posibilidad de un reactor ● Pérdida de actividad de la
enzimático de fácil manejo y enzima.
control.
● Biocatalizador es más caro
que la enzima nativa
CLASIFICACIÓN
MÉTODOS DE RETENCIÓN FÍSICA
 Consiste en la retención física de la
ATRAPAMIENTO enzima en las cavidades interiores
de una matriz sólida porosa

Suspensión En capas En fibras

de la enzima en un
Enzima queda Enzima dentro de
monómero
atrapada en gel fibra sintética

Polimerización
Por un cambio de
temperatura o mediante la
adición de un reactivo
químico
 Consiste en la retención física de la
INCLUSIÓN DE enzima en las cavidades interiores
de una matriz sólida porosa
MEMBRANAS

Encapsulación Reactores de membrana

Enzima rodeadas de Estos reactores emplean

membranas membranas permeables al
semipermeables producto final, permeables o no
al sustrato inicial e
impermeables a la enzima.
MÉTODOS DE UNIÓN QUÍMICA
 Incrementa
UNIÓN A ● La afinidad por el sustrato,
SOPORTES ● Disminuye la inhibición,
● Amplíe el intervalo de pH óptimo y
● Reduce las posibles contaminaciones
microbianas.

SOPORTES
INORGÁNICO SOPORTES
ORGÁNICOS
Naturales Polímeros naturales
Materiales Polímeros sintéticos
manufacturados
 UNIÓN COVALENTE
Activación de grupos químicos
del soporte Ventajas Desventajas
Enzimas empleadas para la formación de
enlaces con el soporte son principalmente 1. Manipulación de los 1.. Necesario conocer
la lisina, la cisteína, la tirosina y la derivados la densidad de
histidina, y en menor medida la metionina, inmovilizados es grupos activos.
el triptófano, la arginina y el ácido sencilla. 2. Alteración de la
aspártico y glutámico. 2. Carga enzimática estructura del
constante. centro activo.
3. Derivados usados 3. No aconsejable
reactores cotinuo. en enzimas
4. Mayor resistencia a la sensibles.
desactifación
ADSORCIÓN
La enzima se una a un soporte
sin funcionalizar mediante Ventajas Desventajas
interacciones iónicas, fuerzas
de Van der Waals y por 1. Preparación sencilla 1.. Optimización de
puentes de hidrógeno. 2. Bajo coste las variables que
3. No hay cambios de controlan la
especificidad adsorción.
enzimática, 2. Derivados
4. Derivados son obtenidos son poco
estables estables.
3. La unión al
soporte es débil.
 Consiste en uso de reactivos bifuncionales
RETICULADO que originan uniones intermoleculares entre
Entrecruzamiento las moléculas de enzima.
cross-linking

Reactivos bifuncionales CO-RETICULADO

Dialdehídos, diiminoésteres, Elimina las pérdidas de

diisocianatos, sales de actividad enzimática debidas a
bisdiazonio e, incluso, efectos difusionales, mediante
diaminas si están activadas el entrecruzamiento de las
con carbodiimida enzimas con una proteína sin
actividad enzimática y rica en
residuos de lisina

Resultado:
Enzimas con enlaces
intermoleculares irreversibles Cross-linked
capaces de resistir condiciones
extremas de pH y temperatura. Consiste en la cristalización de
enzimas y su posterior
reticulado con glutaraldehído
 ● Dentro de la industria tanto los
métodos de purificación como
inmovilización han sido
ampliamente utilizados
● En la purificación permitiendo
extraer enzimas de gran
Aplicaciones importancia

● Dependiendo del método de

purificación utilizado es posible
reducir costos.

● La inmovilización tiene gran

aplicación por su aplicabilidad
PURIFICACIÓN

Aplicaciones
Purificación de enzimas Purificación mixta
como: 80% Captura la proteína objetivo
directamente de una materia prima
Proteasas
Lipasas Diseño de un método de purificación de anticuerpos
monoclonales a partir de la proteína A

Cromatografía líquida Otros usos:

En la insulina humana
Detecta cambios
Replegamiento de proteínas, para
recombinante
conformacionales recuperar su actividad.
INMOVILIZACIÓN

Aplicaciones
Industria
Medicinal ● Diseño de biosensores.
● Producción de jarabe ● Producción de la manteca de
● Fabricación de tiras reactivas de cacao
glucosa. ● Producción del 6-APA
● Tratamiento antitumoral ● Obtención industrial de
● Farmacos opticamente puros. edulcorantes.

Alimenticia
Bioremediación
● Producción de suero
Tratamiento de aguas
● Modificación del contenido
residuales.
proteico.
● Degradación del almidón

Los métodos de purificación enzimática
varían con respecto a su técnica,
complejidad y costos, en general se
clasifican en métodos de purificación
por solubilidad, centrifugación, tamaño,
cromatografía y electroforesis.
La inmovilización enzimática es un
procedimiento que se desarrolla para
dar un mejor uso a las enzimas por la
mejora a la estabilidad que
proporciona y el aumento de la
productividad.
Conclusiones
La cromatografía es un método útil de
separación, purificación y análisis de
enzimas y proteínas. Las técnicas
cromatográficas pueden llevarse a
cabo por diferentes mecanismos como
son: absorción continua, adsorción,
partición e intercambio iónico.
Los métodos de inmovilización se
dividen en físicos y por unión química,
donde los métodos físicos se pueden
realizar por atrapamiento o por
inclusión en membranas y los métodos
químicos mediante la unión a soportes y
por reticulado, además la unión
covalente es el más interesante desde
el punto de vista industrial.
La electroforesis convencional es de
gran utilidad; sin embargo este tipo de
separación electroforética es lenta,
laboriosa , con poca reproducibilidad,
difícil de automatizar, y además no
proporciona resultados cuantitativos
precisos.
Tanto la purificación como la
inmovilización tienen una amplia
aplicación a nivel industrial, medicinal,
siendo parte de varios tratamientos
terapéuticos, en el área alimenticia,
incluso en bioremediación.
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