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INSTITUTO TECNOLGICO DEL SUR DE NAYARIT

ESPECIALIDAD: INGENIERA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

ASIGNATURA: BIOTECNOLOGIA

NOMBRE DEL TRABAJO: RESUMEN

NOMBRE DEL DOCENTE: M.C MARCELA HERNANDEZ PINTADO

NOMBRE DE LOS ALUMNOS: 6 SEMESTRE

FECHA: 23/04/2012

PROCESOS DE BIOSEPARACIN
Las fermentaciones industriales comprenden las etapas de upstream (USP) y downstream (DSP) o separacin del producto. El USP involucra a todos los factores y procesos que conducen e incluyen a la fermentacin y se compone de tres reas principales. La primera se refiere a los aspectos relacionados con el microorganismo productor. Estos incluyen las estrategias para la obtencin de un microorganismo adecuado. El segundo aspecto del USP tiene que ver con el medio de fermentacin. Especialmente la adecuada seleccin de fuentes de carbono y energa rentables, junto con otros nutrientes esenciales. Esta optimizacin del medio es un aspecto vital del desarrollo del proceso para asegurar la maximizacin del rendimiento y la rentabilidad. El tercer componente del USP se relaciona con la fermentacin, que se realiza generalmente bajo condiciones rigurosamente controladas, desarrollada para optimizar el crecimiento del organismo o la produccin de un producto microbiano. El DSP abarca todos los procesos despus de la fermentacin. Tiene el objetivo principal de recuperar el producto de manera eficiente, reproducible y segura segn las especificaciones requeridas (actividad biolgica, pureza, etc), al tiempo que maximiza el rendimiento de recuperacin y minimiza los costos. El producto puede ser recuperado mediante el procesamiento de las clulas o el medio fermentado dependiendo de si se trata de un producto intracelular o extracelular. El nivel de pureza que debe lograrse generalmente lo determina por el uso especfico del producto. A menudo, la pureza de un producto se define por lo que no se encuentra presente y no por lo que es. La pureza de una enzima, por ejemplo, se expresa como unidades de actividad enzimtica por unidad de protena total. No slo es importante reducir las prdidas de masa del producto, sino que en muchos casos es de vital importancia la retencin de la actividad biolgica del producto. Factores que afectan la fermentacin en el proceso de bioseparacin Propiedades de los microorganismos: Morfologa Caracteristicas de floculacin (formacin de grumos) Tamao Rigidez de la pared celular

Estos factores tienen mayor influencia sobre: Filtracin Sedimentacin Eficiencia en la homogeneizacin La presencia de productos de fermentacin, impurezas y aditivos de fermentacin, como antiespumantes puede interferir con las etapas del DSP y el anlisis del producto. EQUIPO 1: AQU HAY UN HUECO EN LA INFORMACIN Y EL PRRAFO QUE SIGUE NO HACE MUCHO SENTIDO. FAVOR DE COMPLETAR LA INFORMACN. EN SEGUIDA SE ENCUENTRA EL TEXTO QUE OMITIERON. POR FAVOR HAGAN UN BUEN RESUMEN PARA QUE LA INFORMACIN TENGA CONTINUIDAD.

Consequently, a holistic approach is required when developing a new industrial purification strategy. The whole process, both upstream and downstream factors, needs to be considered. For example, the choice of fermentation substrate influences subsequent DSP. A cheap carbon and energy source containing many impurities may provide initial cost savings, but may necessitate increased DSP costs. Hence overall cost savings may be achieved with a more expensive but purer substrate. Also, adopting methods that use existing available equipment may be more costeffective than introducing more efficient techniques necessitating investment in new facilities. The physical and chemical properties of the product, along with its concentration and location, are obviously key factors as they determine the initial separation steps and overall purification strategy. It may be the whole cells themselves that are the target product or an intracellular product, possibly located within an organelle or in the form of inclusion bodies. Alternatively, the target product may have been secreted into the periplasmic space of the producer cells or the fermentation medium.

La estabilidad del producto tambin influye en el requerimiento de cualquier pretratamiento necesario para evitar la inactivacin del producto

Formatted: English (U.S.)

y/o degradacin puede ser dividida en una serie de procesos unitarios entre si para lograr la purificacin del producto. DSP can be divided into a series of distinct unit processes linked together to achieve product purification (Fig. 7.2). Examples of the purification strategies for two products are shown in Fig. 7.3. Usually, the number of steps is kept to a minimum. This is not only because of cost, but because even though individual steps may obtain high yields, the overall losses of multistage purification processes may be prohibitive (Fig. 7.4).

Operaciones unitarias tpicas de un proceso de separacin (DSP)

Separacin celular
Sedimentacin o flotacin Centrifugacin Filtracin

Acondicionamiento del medio Floculacin Pila de discos, tubular, multicmara. Filtros de profundidad y los sistemas de membrana

Medio clarificado (Producto extracelulares)

Clulas recuperadas
(Productos intracelulares)

Ruptura celular
Mecnico No mecnica Homogeneizacin lquidos tipo navaja, molienda, sonicacin. Antibiticos, autolisis, detergentes, enzimas, choque osmtico

Clarificacin
Centrifugacin Filtracin

De discos, tubular, multicmara Filtros de profundidad y sistemas de membrana

Concentracin
Precipitacin Cromatografa Filtracin Fraccionamiento Destilacin

Sulfato de amonio, disolventes Cromatografa en gel Filtracin por membrana de flujo cruzado Sistemas de dos fases Alambique en lotes, alambique continuo

Tcnicas de alta resolucin


Cromatografa
Electroforesis Dilisis Adsorcin, afinidad, filtracin en gel HPLC, hidrfobico, intercambio inico, metal quelante Enfoque Isoelctrico Diafiltracion, electrodilisis

Acabado
Cristalizacin Filtracin Cromatografa en gel Secado Adicin de sales Sistemas de membranas Acabado, no concentracin, Liofilizacin, Secado por pulverizacin, secado en bandeja.

Las operaciones unitarias especficas elegidas estarn influenciadas por la economa del proceso, la pureza requerida del producto, el rendimiento alcanzable en cada paso y los aspectos de seguridad. En muchos casos es preferible la integracin de la fermentacin y del DSP. La integracin a menudo puede aumentar la productividad, disminuir el nmero de operaciones unitarias y reducir tanto el tiempo total del proceso como los costos. Ejemplos de operaciones unitarias en un proceso de bioseparacin Purificacin de protena soluble intracelular bacteriana.

Recuperacin celular: Ej.centrifugacin Sobrenadante Rompimiento de clulas recuperadas: Ej. Homogeneizacin por cizalla lquida sobrenadante

Separacin de restos celulares: Ej. centrifugacin Restos celulares Precipitacin de las protenas del extracto (libre de clulas): Ej. Sulfato de amonio.

Recuperacin de protenas por centrifugacin

Desalacin del precipitado de protena Ej. Filtracin en gel

Cromatografa de intercambio inico. Dilisis Liofilizacin

Purificacin de cido orgnico de un cultivo de hongos.

Caldo de clarificacin EJ: filtracin al vaco por rotacin. Micelio Decoloracin del caldo clarificado EJ: Tratamiento con carbn activado.

Evaporacin

Cristalizacin

Recuperacin de cristales EJ: filtracin

Limpieza de cristales

Secado del cristal

RECUPERACIN DE CLULAS El primer paso en el DSP de cultivos suspendidos es la separacin slidolquido para remover las clulas del medio fermentado. Cada una de las fracciones podr entonces pasar a un proceso posterior, dependiendo de si el producto es intracelular o ha sido secretado al espacio periplasmtico o al medio. La eleccin del mtodo de separacin slidolquido, est influenciada por el tamao y la morfologa del microorganismo (clulas individuales, agregados o micelio), y la gravedad especfica,

viscosidad y reologa del medio fermentado. Esto influye en el transporte del lquido a travs de bombas y tubos. Acondicionamiento del caldo de cultivo Las tcnicas de acondicionamiento del caldo se utilizan principalmente en asociacin con la sedimentacin y la centrifugacin para la separacin de las clulas de los medios lquidos. Estas alteran o explotan alguna propiedad de un microorganismo u otro material en suspensin, como la floculacin o la precipitacin. Sin embargo, en algunos casos, slo promueve la flotacin. Esta utiliza la capacidad de algunas clulas para adsorberse a las interfaces de gas-lquido de las burbujas de gas y flotan hacia la superficie para su recoleccin, esto ocurre de forma natural en la cerveza tradicional y fermentacin de levadura de panadera. Sedimentacin La sedimentacin se utiliza ampliamente para la separacin primaria de levadura en la produccin de bebidas alcohlicas, y en el tratamiento de aguas residuales. Esta tecnologa es de bajo costo y relativamente lenta, slo es adecuada para grandes flculos. La tasa de sedimentacin de las partculas est en funcin del tamao y la densidad. Por lo que mientras ms grande la partcula y su densidad, ms rpida ser la velocidad de sedimentacin. La base de este mtodo de separacin es la sedimentacin por gravedad, que para una partcula esfrica puede ser representado por la ley de Stoke

Donde Vg = velocidad de sedimentacin de las partculas (m/s), dp = dimetro de partcula (m), pS-p1 = diferencia de densidad entre la partcula y el medio circundante (km/m3);

Por lo tanto, para una sedimentacin rpida la diferencia de densidad entre la partcula y el medio debe ser grande, y la viscosidad del medio debe ser baja. Centrifugacin Si en lugar de slo la fuerza gravitatoria para separar las partculas en suspensin, se aplica un campo centrfugo, la tasa de separacin slidolquido se incrementa significativamente y partculas mucho ms pequeas pueden ser separados. La centrifugacin se puede utilizar para eliminar las partculas tan pequeas como 0,1 um de dimetro y tambin es adecuado para algunas separaciones lquido-lquido. Su eficacia tambin depende de la diferencia en el tamao de partcula en densidad entre las clulas y el medio, y de viscosidad del medio.

Filtracin Estas tcnicas son generalmente tiles para la recoleccin de hongos filamentosos, pero son menos efectivas para la recoleccin de bacterias. Los dos tipos principales de filtracin convencional comnmente utilizados en la industria son los siguientes: Placa y marco filtros o filtros prensa, que son los sistemas industriales de filtracin por lotes. Estos normalmente forman una pila horizontal que alterna placas porosas y marcos huecos. La pila est montada en una estructura de soporte donde esta se mantiene unida con un pistn hidrulico o tornillo. La tela filtrante se sostiene en su lugar entre las placas que contienen canales de flujo para la alimentacin y permean corrientes. Esto esencialmente forma una serie de cmaras forradas de tela en las que las clulas en suspensin son forzadas bajo presin. Despus de la filtracin por lotes el aparato debe ser desmantelado para quitar la torta del filtro de recoleccin. Filtros rotativos de vaco son simples sistemas de filtracin continua que se utilizan en diversos procesos industriales, en particular para la recoleccin de micelio de hongos durante la fabricacin de antibiticos, para la produccin de levadura de panadera y en deshidratacin de lodos durante el tratamiento de aguas residuales, el dispositivo comprende un tambor hueco perforado que soporta el medio de filtracin.

Membrana de filtracin
Los mtodos modernos de filtracin implican filtros absolutos en lugar de filtros de profundidad. Estos consisten en membranas con poros de tamaos especficos que se pueden dividir en tres categoras principales. Son, en orden decreciente de tamao de poro, microfiltracin, ultrafiltracin y smosis inversa. La microfiltracin se utiliza para separar las partculas de 10-2 m a 10 m, incluyendo la eliminacin de las clulas microbianas del medio de fermentacin. Este mtodo es muy costoso pero tiene ventajas es: Silencioso Bajos requisitos de energa El producto puede ser lavado fcilmente Buen control de temperatura la contencin se logra en la facilidad y no se producen bioaerosoles. Por consiguiente es adecuado para la manipulacin de patgenos y de microorganismos recombinantes.

La ultrafiltracin es similar a la microfiltracion, excepto que las membranas tienen tamao de poro ms pequeo y se utilizan para fraccionar soluciones de acuerdo al peso molecular. Elimina pirgenos (lipopolisacridos de la pared celular de bacterias), restos de restos celulares y los virus del medio y para el procesamiento de suero. Osmosis inversa se utiliza para la deshidratacin o en las etapas de concentracin y se ha empleado para desalinizar agua de mar para beber. RUPTURA CELULAR Algunos productos de destino son intracelulares, incluyendo muchas

enzimas y protenas recombinantes. para romper las clulas de

Por lo tanto, se requieren mtodos

los microorganismos y liberar estos productos.

La ruptura de la pared celular y membrana citoplasmtica puede plantear problemas, sobre todo cuando las clulas poseen paredes celulares fuertes. Por ejemplo, se necesita una presin de 650 bar para romper las clulas de levadura, aunque esto puede variar algo en diferentes momentos

durante el ciclo de crecimiento y dependiendo de las condiciones de crecimiento especficos. Problemas generales asociados con la ruptura celular incluyen la liberacin de ADN, que puede aumentar la viscosidad de la suspensin. Esto tambin puede afectar a su posterior procesamiento, tales como el bombeo de la suspensin en el proceso siguiente y el flujo a travs de columnas de cromatografa. Si se utiliza la ruptura mecnica invariablemente se genera calor, lo que desnaturaliza las protenas a menos que se implementen medidas de enfriamiento. Los productos liberados de las clulas eucariotas estn a menudo sujetos a la degradacin por las enzimas hidrolticas (proteasas, lipasas, etc.). Este dao se puede reducir mediante la adicin de inhibidores de la enzima, el enfriamiento del extracto de clulas y el procesamiento rpido. Alternativamente, se pueden hacer intentos para producir cepas mutantes del microorganismo productor que carece de las enzimas perjudiciales. La ruptura de la clula se puede lograr por mtodos mecnicos y no mecnicos. El proceso de ruptura a menudo se cuantifica vigilando los cambios en la absorbancia, el tamao de partcula, la concentracin total de protena o la actividad de una enzima especfica intracelular liberada a la suspensin de ruptura.

Mtodos mecnicos de ruptura celular Existen diversos mtodos mecnicos para la ruptura celular. Los basados en cizalla slida incluyen la extrusin de preparaciones celulares congeladas a travs de un orificio estrecho a alta presin. Este enfoque ha sido utilizado a escala de laboratorio, pero no para operaciones a gran escala. Los mtodos que utilizan cizalla lquida son generalmente ms eficaces. Se pueden usar para las clulas bacterianas, de levaduras y el micelio de hongos. En estos dispositivos la suspensin celular se extrae a travs de una vlvula Chek en un cilindro de la bomba. En este punto, es forzado bajo presin (hasta 1500 bares) a travs de un anillo muy estrecho o vlvula de descarga, sobre el cual la presin se reduce a la

atmosfrica. funcin de

La la

velocidad presin y la

de

liberacin el

de

protenas de el ciclos

(eficiencia a travs de

de del la

interrupcin) es independiente de la concentracin celular, pero es una ejercida, nmero Durante homogeneizador temperatura. procesamiento

temperatura se eleva por sobre 2.2-2.4 C por 100bar.La entrada de energa necesaria es de aproximadamente 100 bares por 0.35kW y el rendimiento es de hasta 6000L / h. Una problema de este mtodo de ruptura celular es que todos materiales intracelulares son puestos en libertad. Como resultado, el producto de inters debe ser separado de una mezcla compleja de protenas, cidos nuclicos y fragmentos de la pared celular. Algunos fragmentos de restos de clulas no se separan fcilmente, haciendo que la solucin difcil de aclarar. Adems, las protenas pueden ser desnaturalizadas si el equipo no est lo suficientemente fro y microorganismos filamentosos pueden bloquear la vlvula de descarga. En la industria, se utilizan molinos de bolas de alta velocidad equipados

con camisas de refrigeracin, a menudo se utilizan para agitar una suspensin de clulas con perlas pequeas (0.5-0.9 dimetro micrmetros) de carburo de vidrio, xido de zirconio o titanio. Los resultados de rotura de la clula, depende de las fuerzas de corte, pulido entre los granos y las colisiones con los granos. La eficiencia de rotura celular es funcin de la velocidad de agitacin, la concentracin de perlas, la densidad de las perlas y el dimetro, la densidad de caldo, caudal y temperatura. La concentracin celular es tambin un factor importante (peso seco ptimo 30-60%), que es una diferencia importante de los homogeneizadores de cizalla lquida descritos anteriormente. La ruptura ultrasnica es eficaz a pequea escala, pero no se utilizan habitualmente en operaciones a gran escala, debido a problemas con la transmisin de energa y la disipacin de calor. La ruptura celular es un rea olvidada de los bioprocesos, ya que ha sido relativamente poca la innovacin y el progreso. Incluso los mtodos mecnicos establecidos utilizados, se disearon originalmente para otros propsitos. Sin embargo, algunos sistemas de ruptura nuevos se estn desarrollando para mejorar la ruptura a gran escala, a menudo con una

contencin integral. Estos incluyen un molino de bolas de nuevo diseo, el molino de bolas, sistemas de rompimientos con alta presin que opera a velocidades de hasta 2.700 bar. Mtodos no mecnicos ruptura celular Un mtodo alternativos de ruptura celular es causar la permeabilizacin de la clula. Esto puede lograrse por autolisis, choque osmtico, con cristales de hielo (congelacin / descongelacin) o choque trmico. Autolisis, por ejemplo, se ha utilizado para la produccin de extracto de levadura y otros productos de levadura. Tiene las ventajas de menor costo y utiliza enzimas propias de los microbios, de modo que no se introduzcan otras sustancias en el producto. El choque osmtico a menudo es til para la liberacin de productos desde el espacio periplsmico. Esto puede lograrse equilibrando las clulas en solucin buffer al 20% C rpidamente. Se han utilizado disolventes orgnicos, generalmente acetona, butano, cloroformo o metanol, para liberar enzimas y otras sustancias a partir de microorganismos mediante la creacin de membrana celular. Se han empleado con xito diversas enzimas que degradan la pared celular en la ruptura celular. Por ejemplo, la lisozima, que hidroliza enlaces glicosdicos -1, 4 dentro del peptidoglicano de las paredes celulares bacterianas, es til para lisar organismos gram-positivos La destruccin enzimtica de la pared celular de la levadura se puede lograr con las enzimas intestinales de caracol que contienen una mezcla de beta-glucanasas. Estas enzimas preparacin son tambin tiles para la produccin de esferoplastos de levadura. La penicilina y antibiticos se pueden utilizar para lisar el crecimiento activo de clulas bacterianas, a menudo en combinacin con un choque osmtico. canales a travs de la y recolectando y resuspendiendo en agua a 4

RECUPERACIN DEL PRODUCTO La recuperacin de protenas extracelulares es a partir del medio

clarificado, donde las preparaciones de clulas disgregadas son usadas tanto para protenas intracelulares como para las que se encuentren en el espacio periplasmtico. En el caso de algunas ruptura de la clula. Despus de la ruptura celular, las protenas solubles son separadas de los desechos celulares usualmente por centrifugacin. El sobrenadante resultante, que contiene las protenas, se procesa de una manera similar a un medio de crecimiento que contiene las protenas secretadas. Esto puede involucrar diferentes tipos de mtodos, uno eficaz, el mtodo de salting out de protenas seguido por la recuperacin de protenas precipitadas por centrifugacin. La precipitacin se logra mediante la adicin de sales inorgnicas de fuerza inica elevada, generalmente en forma de soluciones solidas o saturadas de sulfato de amonio. La reduccin de la solubilidad de una protena puede reducirse mediante la adicin de solventes orgnicos, como acetona, etanol e isopropanol. Esto es realizado a bajas temperaturas y reduce la constante dielctrica del medio, causando precipitacin de las protenas. La separacin de dos fases acuosas implica el fraccionamiento de la protena entre las dos fases, dependiendo de su peso molecular y carga. Los sistemas comnmente usados incluyen dextrano y polietilenglicol (PEG) y fosfato de potasio. Las dos fases pueden ser separadas por centrifugacin. Este mtodo es barato, suave y verstil, y se puede ampliar para aplicaciones industriales, incluyendo purificacin de enzimas por ejemplo RNA polimerasa de E. Coli. protenas recombinantes expresadas en altos

niveles, algunas veces forman cuerpos de inclusin que se liberan por la

Muchos alcaloides, antibiticos, esteroides y vitaminas son recuperadas por mtodos de extraccin liquido-liquido usando solventes orgnicos. Los solventes utilizados no deben ser txicos, deben ser selectivos, de bajo costo, inmiscibles con el caldo y deben tener un alto coeficiente de distribucin para el producto, es decir, la relacin del producto en las dos fases. Una recuperacin eficiente del disolvente para su reutilizacin es un aspecto esencial para la economa general del proceso. Cromatografa Las tcnicas cromatogrficas se emplean generalmente para productos de mayor valor. Se utilizan para la desalinizacin, concentracin y purificacin de preparaciones de protenas. En la eleccin de una tcnica cromatogrfica se debe tener en cuenta una serie de consideraciones. Para productos proteicos estos factores incluyen el peso molecular, punto isoelctrico, la hidrofobicidad y la afinidad biolgica. El orden y la eleccin de la tcnica depender del producto en particular, pero se deben considerar los parmetros cromatogrficos siguientes: capacidad, recuperacin y poder de resolucin (selectividad). La capacidad se refiere al tamao de la muestra que se puede aplicar al sistema en trminos de concentracin de protena y el volumen, y la recuperacin es el rendimiento de producto en cada etapa. Los valores de rendimiento deben ser tan altos como sea posible de otro modo el proceso global no es econmico. La Cromatografa de adsorcin separa de acuerdo a la afinidad de la protena, o de otro material, por la superficie de la matriz slida. La Almina (Al2O3 ), la hidroxiapatita (Ca10 (PO4)6(OH)2) o la slica (SiO2) se utilizan para purificar molculas no polares, mientras que las resinas basadas en poliestirenos son matrices eficaces para molculas polares. Esta tcnica involucra enlaces de hidrgeno y/o las fuerzas de Van der Walls.

Cromatografa de afinidad Es una tcnica de purificacin especialmente potente y altamente selectiva. A menudo resulta en varias veces la purificacin en un solo paso. Esta tcnica consiste en las interacciones qumicas especificas entre las molculas de los solutos (protenas y un ligando inmovilizado). Los ligandos se unen covalentemente al material matriz, por ejemplo: la agarosa, a travs de un brazo espaciador evita un impedimento estrico. Es tambin una tcnica de alta velocidad y la elucin se consigue utilizando cofactores o sustratos especficos, alternativamente la elucin no especifica puede llevarse a cabo con el cambio de pH o de sal. En operaciones a escala industrial es necesario esterilizar los medios cromatogrficos con el fin de cumplir con varios requisitos legales. Siendo esto problemtico ya que algunos ligandos son sensibles a los agentes esterilizantes. La cromatografa de exclusin o filtracin en gel Es una clase de cromatografa slido-lquido que permite la separacin de molculas en funcin de su tamao. En este tipo de cromatografa la fase estacionaria es un gel, que se introduce en una columna como soporte cromatogrfico. El gel est constituido por partculas esfricas que tienen poros de un determinado tamao. Las molculas de pequeo tamao difunden a travs de los poros de las partculas del gel y por ello son retardadas en su paso por la columna. Las molculas grandes no entran en los poros de las partculas del gel y por ello eluyen rpidamente en lo que se denomina volumen vacio de la columna, se dicen que son excluidos del gel. De esta forma, las molculas se separan en funcin de su tamao, eluyendo en orden decreciente de peso molecular. Cromatografa de intercambio inico La cromatografa de intercambio inico se basa en las interacciones electrostticas y permite la separacin de macromolculas (protenas) en funcin de sus cargas mediante su interaccin diferencial con una fase estacionaria de naturaleza inica.

Cromatografa liquida de alto rendimiento (HPLC) Se desarrollo originalmente para la separacin de molculas orgnicas en disolventes no acuosos, pero ahora se utiliza para las protenas en solucin acuosa. Este mtodo utiliza columnas empaquetadas apretadamente que contienen partculas rgidas muy pequeas entre 5-50 m de dimetro, de slica o de un polmero reticulado., en consecuencia, se requieren altas presiones. El mtodo es rpido y da alta resolucin de molculas de soluto. Ya hay equipos disponibles para operaciones a gran escala. Cromatografa hidrofobica: Se basa en la interaccin hidrofobica entre regiones hidrfobas o dominios de una protena soluto y grupos funcionales hidrfobicos de las partculas de soporte. Estos soportes son a menudo de sacarosa sustituida con grupos octilo o fenilo. La elucin de la columna se consigue normalmente mediante la alteracin de la fuerza inica, cambiando el pH o el aumento de la concentracin de iones caotropicos, por ejemplo tiocianato. Esta tcnica proporciona una buena resolucin limitado por volumen de la muestra. Cromatografa de afinidad por quelatos metlicos Utiliza una matriz con iones metlicos conectados, por ejemplo sacarosa conteniendo calcio, cobre o iones de magnesio. La protena a ser purificada debe tener una afinidad por este ion la formacin y se une a ella mediante de complejos de coordinacin con grupos tales como el y como cromatografa de intercambio inico, tiene una muy buena capacidad, ya que no est

imidazol de residuos de histidina. Las protenas unidas se eluyen utilizando soluciones de ligandos que no se unen a metales, por ejemplo los aminocidos. Dilisis y electrodilisis: Estas tcnicas de separacin por membranas se utilizan principalmente para la eliminacin de los solutos de bajo peso molecular o iones inorgnicos procedentes de una solucin. Las membranas implicadas son

de tamao selectivo con aislantes especficos que permiten determinar su peso molecular. Las membranas utilizadas contienen grupos de intercambio inico y tienen una carga fija; por ejemplo las membranas cargadas positivamente permiten el paso de aniones y repelen a los cationes. Son esencialmente resinas de intercambio inico en forma de hoja y tambin se han utilizado para la desalinizacin de agua. DESTILACIN La destilacin se utiliza para recuperar alcohol combustible, acetona y otros disolventes del medio de fermentacin y para la preparacin de aguardientes. La destilacin por lotes en alambiques se sigue utilizando para la produccin de algunos whiskies, pero para muchos otros fines la destilacin continua es el mtodo de eleccin. El medio de fermentacin entrante se calienta, a medida que pasa por un tubo en espiral dentro de la columna rectificadora por medio de vapor ascendente caliente producido por la columna analizadora.

Alambique Tipo Coffey El medio ya caliente es liberado dentro de un canal en la parte superior analizadora a medida baja por la columna es calentado

de la columna

por vapor. Los vapores calientes generados se transportan desde la parte superior de la columna analizadora a la parte inferior de la columna

rectificadora. A medida que suben se condensan sobre las bobinas que llevan caldo entrante. Existe un gradiente de temperatura en la columna rectificadora y cada compuesto voltil se condensa a su nivel apropiado donde la fraccin es colectada. TERMINADO Cristalizacin La cristalizacin del producto se logra mediante la evaporacin, de baja de

temperatura de tratamiento o la adicin de un reactivo qumico con el soluto. Solubilidad del producto puede reducirse mediante la adicin disolventes, sales, polmeros o mediante la alteracin de pH.

El secado El secado implica la transferencia de calor al material hmedo y la eliminacin de la humedad como vapor de agua. Por lo general, producto. Los parmetros que afectan el secado son las propiedades fsicas del sistema solido-liquido, propiedades intrnsecas y la transferencia de calor puede ser por contacto directo de conveccin o radiacin. En secadores de tambor rotativo se elimina el agua por la conduccin del calor. Esto permite temperaturas ms bajas para ser utilizado debido al es realizado de tal manera como para retener la actividad biolgica del

menor punto de ebullicin del agua a presin reducida. El mtodo es adecuado para pequeos lotes de materiales costosos, tales como algunos productos farmacuticos, secado por pulverizacin implica atomizacin y pulverizacin de la solucin de producto en una cmara caliente, y partculas secas resultantes se separan de los gases utilizando ciclones. Secadores de transporte neumtico utiliza aire caliente que suspende y transporta partculas. Liofilizacin La liofilizacin es til para algunas enzimas, vacunas o productos

farmacuticos, en donde la retencin de la actividad biolgica es de gran importancia. En este mtodo las enzimas o suspensiones de clulas se preparan y se les elimina el agua por sublimacin al vacio. El secado por congelacin (liofilizacin) elimina el dao trmico y osmtico.

Los cuerpos de inclusin y el papel de la ingeniera gentica en los procesos de bioseparacin

CUERPOS DE INCLUSIN Y EL PAPEL DE LA INGENIERA GENTICA EN EL DSP Muchas protenas recombinantes se forman como cuerpos de inclusin, surgen debido se a la han acumulacin expuesto a las de polipptidos parcialmente Las plegados que superficies hidrofbicas.

interacciones hidrofbicas forman agregados insolubles, esto proporciona una forma concentrada de la protena ya que contienen ms del 50 % de protena diana. Los cuerpos de inclusin se recuperan fcilmente a partir de los extractos libres de clulas por centrifugacin a baja velocidad. La protena recuperada se solubiliza. Su solubilizacin requiere soluciones concentradas de agentes desnaturalizantes. Tras la disolucin de los desnaturalizantes y agentes reductores son eliminados por dilisis, diafiltracin o filtracin en gel. Esto comienza por el replegamiento de protenas (renaturalizacin) para producir la conformacin funcional y restaurar la actividad biolgica. El replegamiento

puede lograrse mediante la eliminacin lenta de desnaturalizantes. Los organismos pueden ser modificados para suprimir la produccin de subproductos y enzimas que pueden interferir con las operaciones DSP o degradar el producto objetivo. Productos protenicos recombinantes pueden ser diseados para ser excretados de la clula, la rotura de clulas y la liberacin de productos intracelulares. La envoltura celular de un organismo puede ser modificado de modo que es permeable. Por ejemplo, E. coli recombinante a menudo es lisozimada bajo control inductor apropiado. Despus de la induccin de lisozima (La lisozima es una enzima que rompe las paredes celulares de las bacterias) y al final de la fermentacin, la rotura de clulas es promovida por un paso de congelacin-descongelacin. Los productos recombinantes de protenas pueden ser diseados con una alta afinidad a otra molcula con caractersticas de separacin deseables. Una tcnica ya consolidada es la construccin de protenas de fusin. Por ejemplo, el gen estructural para el pptido/protena recombinante se pueden fusionar con el ADN adicional que codifica un polipptido natural o

sinttico en el extremo 5 'o 3' del gen final. o glutatin-S-transferasa.

La etiqueta puede ser una

enzima completa, tales como -galactosidasa, cloranfenicol acetiltransferasa Estas etiquetas se pueden emplear para proteger pptido corto que a menudo son rpidamente degradados, o ayuda en la elaboracin secundaria y la ejecucin del test especfica del producto pptido / protena. pptido / protena. Las etiquetas se pueden utilizar para permitir afinidad, separacin intercambio inico hidrofbico covalente o metal quelato del